CN115876990B - 鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物及其应用 - Google Patents
鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物及其应用。本发明提供的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物包括以下糖链标志物中的一种或两种的组合：A2F0E、A2GE。上述糖链标志物在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内与肺栓塞患者体内存在显著差异，可用于作为鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物，具有较高的准确性，同时具有检测便捷、所需时间短等优势，能够满足临床诊断的要求，可在实践中用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断，为慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断提供了新的标志物和方法。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物及其应用。
背景技术
慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTEPH)是一种死亡率高、预后差的心肺疾病，属于第4大类肺动脉高压，严重危及患者生命。未经治疗的CTEPH患者5年生存率仅为10%左右。改善CTEPH患者预后的关键在于早期诊断，从而采取有效的治疗措施。由于缺乏特异性的临床表现，导致CTEPH常被延误诊断和治疗。CTEPH是急性肺栓塞(PE)的一种远期并发症，目前在临床上对PE发展为CTEPH的相关危险因素尚不完全明确，而且没有无创的血清学标志物用于鉴别诊断CTEPH和PE。因此，研究CTEPH相关危险因素，筛选用于鉴别诊断PE和CTEPH的血清学标志物具有重要的临床意义。
在200多种蛋白翻译后修饰中，蛋白的糖基化是最普遍和最重要的修饰之一。糖蛋白异常糖基化与包括心血管疾病在内的多种重大疾病密切相关。糖基化对蛋白性质和功能有重要影响，几乎参与每一个生理过程。健康个体的糖链表型相当稳定，但在病理条件下（如心血管疾病、炎症等）可发生显著变化，并且这种变化可以在血液中检测到。因此，血清中糖蛋白糖基化分析将为血清学标志物的发现提供新途径。
发明内容
本发明提供鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物及其应用。
本发明通过对大量慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者和肺栓塞患者血浆的糖链组成和谱图结构进行检测和分析，发现了在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内发生特异性改变的糖链，进一步采用逻辑回归的方法分析慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者和肺栓塞患者的糖链结构及其含量，确定哪些派生糖链与慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者的发生显著相关，在逻辑回归中，进行了年龄、性别校正（即将年龄和性别作为逻辑回归模型中的协变量），对与慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者发病显著相关的糖链进一步进行ROC曲线分析（同样校正了协变量），评估糖链作为标志物的潜力，最终确定了可用于鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物，这些标志物在用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断时具有较高的特异性、灵敏度和准确性。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物，所述标志物包括以下糖链标志物中的一种或两种的组合：A2F0E、A2GE。
上述糖链标志物中的任意一个的表达量在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者和肺栓塞中均有显著差异，且每个糖链标志物在区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞时的AUC值均在0.7以上，能够较为准确地区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞患者，特异性和灵敏度较高。因此，上述糖链标志物可以单独用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断。
对于上述标志物的组合，本领域技术任意可以理解的是，由于上述标志物中的任意一个在区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞时的AUC值均在0.7以上，因此，将其进行组合使用，其区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的AUC值必然也在0.7以上，甚至高于组合中每个单独的标志物的AUC值，因此上述两个糖链标志物的组合也能够用于鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞，具有较高的准确性。
对于上述标志物，在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内，A2F0E、A2GE的表达量较肺栓塞患者显著下降。
在上述糖链标志物的基础上，本发明还进一步提供了与慢性血栓栓塞性肺动脉高压相关的其他糖链标志物，这些糖链标志物单独用于区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的AUC值在0.7以下，但是，本领域技术人员可以理解的是，可以将这些糖链标志物中的一个或至少两个与上述AUC值在0.7以上的标志物中的一个或两个进行组合用于鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞，因此这些标志物组合的方案也在本发明的保护范围内。与慢性血栓栓塞性肺动脉高压相关、AUC值在0.7以下的糖链标志物包括：CA2、CA3、CF0、CF、CB、CS、TA2FS0、A2F0、A2F、A2L0F、A3L0F、A2SF、A2LF、A2EF、A2B、A2F0B、A2SB、A2F0SB、A2F0G、A2S、A3S、A2F0S、A3FS、A2F0L、A2E、A3E、A3FE、A2GS、A3GS、A2F0GS、A3FGS、A2GL、A2F0GL、A3GE、A2F0GE、A4F0GE、A3FGE。
上述糖链标志物中，在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内，CA3、CF0、CS、A2F0、A2F0G、A2S、A3S、A2F0S、A3FS、A2E、A3E、A3FE、A2GS、A3GS、A2F0GS、A3FGS、A3GE、A2F0GE、A4F0GE、A3FGE的表达量较肺栓塞患者显著下降，CA2、CF、CB、TA2FS0、A2F、A2L0F、A3L0F、A2SF、A2LF、A2EF、A2B、A2F0B、A2SB、A2F0SB、A2F0L、A2GL、A2F0GL的表达量较肺栓塞患者显著升高。
本发明所述的糖链标志物的命名方法参考如下文献：Zhang Z, Westhrin M,Bondt A, et al. Serum protein N-glycosylation changes in multiple myeloma[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 2019。具体地，除质谱直接检测到的糖链结构外，采用直接检测到的糖链结构依据其结构特点和生物相关性通过Rstudio计算得到派生糖链特征（derived glycan traits）。根据直接检测到的糖链结构特征和其反映的生物合成途径计算出派生糖链特征:糖链的类型 (高甘露糖型(M)、复杂型(C)和杂合型(Hy)聚糖)，天线/分支数量(A)，以及其他特征，如平分型糖链(B)，半乳糖基化(G)、岩藻糖基化(F)和连接特异的唾液酰化(S)。第一组派生的糖链特征将所有直接检测到的糖链划分为高甘露糖型(M)、复杂型(C)和杂合型(Hy)聚糖。然后再根据糖型中，天线/分支的数目、岩藻糖基化有无及数目、半乳糖化和唾液化等的含量，对复杂型(C)糖链进行进一步细分。糖链派生特征表明，糖链改变是由一组结构相关的糖链共同发生的。计算的主体对象由最后一个字母表示，例如，唾液酸化(S)，S前面的字母代表在什么范围内计算，如，岩藻糖基化的三天线糖链中(A3F)。因此，可将A3FS翻译为岩藻糖基化的三天线糖链中的唾液化水平。
派生糖链特征包括：复杂型N-糖链的天线数量（antennae of complex-typeglycans，CA）、岩藻糖糖基化的水平（fucosylation，F）、平分型糖链的水平（bisection，B）、末端半乳糖糖基化水平（galactosylation，G）、唾液酸化水平（sialylation，S）等。各N-糖链标志物的具体结构和计算公式如表1所示，当计算公式中涉及的糖链未被直接检测到时，在计算公式中删除该糖链即可。
表1
注：表1中M = 甘露糖; Hy = 杂合型; T =在所有的糖型中; C = 在复杂型糖型中; F = 脱氧核糖（岩藻糖）; G = 半乳糖; S = N-乙酰神经氨酸（唾液酸）; E =α2,6-连接唾液酸; L =α2,3-连接唾液酸; H = 己糖（甘露糖或半乳糖） ; N = N-乙酰氨基己糖（N-乙酰氨基葡萄糖：GlcNAc）。
本发明中，直接检测糖链结构的命名、分类及派生特征命名方式如表2所示。
表2
第二方面，本发明提供以上所述的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物或所述标志物的检测试剂在制备用于鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的产品中的应用。
优选地，所述产品为药物或试剂盒。
第三方面，本发明提供以上所述的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物在作为慢性血栓栓塞性肺动脉高压治疗的药物靶点中的应用。
第四方面，本发明提供一种鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的产品，所述产品包括以上所述的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物或所述标志物的检测试剂。
优选地，所述产品为药物或试剂盒。
本发明所述的标志物的检测试剂可为任何用于本发明所述标志物检测的试剂，例如：特征性糖链探针、质谱检测试剂、凝集素芯片等。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂为特异性识别所述糖链标志物的特征性糖链探针。
在本发明的一些实施方式中，所述检测试剂为检测所述糖链标志物的质谱检测试剂。
第五方面，本发明提供一种鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的装置，所述装置包括：
检测模块，用于检测以上所述的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物在待测样品中的含量；
输入模块，用于获取检测模块的检测结果；
判断模块，用于将输入模块获取的检测结果与肺栓塞患者进行比较，判断是否为慢性血栓栓塞性肺动脉高压；
输出模块，用于输出诊断结果。
上述装置中，所述判断模块的判断标准为：若待测样品中A2F0E、A2GE中的一种或两种的含量较肺栓塞患者显著下降，则判断为慢性血栓栓塞性肺动脉高压。
本发明中，用于检测所述标志物的表达量或含量的待测样品可为血液、血浆或血清。
第六方面，本发明提供一种鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的方法，所述方法包括：检测以上所述的鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物在待诊断人体内的表达量，根据其表达量的变化情况，判断是否患有慢性血栓栓塞性肺动脉高压。
所述判断的依据为：若待诊断人体内A2F0E、A2GE中的一种或两种的表达量较肺栓塞患者显著下降，则判断为慢性血栓栓塞性肺动脉高压。
本发明的有益效果在于：本发明提供的糖链标志物在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内与肺栓塞患者体内存在显著差异，可用于作为鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物，具有较高的特异性、灵敏度和准确性，同时具有检测便捷、所需时间短等优势，能够满足临床诊断的要求，可在实践中用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断，对于全面、深入了解慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的发生发展过程具有重要意义，同时为慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断提供了新的标志物和方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述的“糖组(glycome)”是指样品（如体液、细胞、组织）中表达的全部糖链或某一类特定糖蛋白上的全部糖链。
本发明所述的样品选自：体液样品，如血液、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液、淋巴液、脊髓液、腹水、羊水；细胞样品，如分离自组织的细胞样品、体外培养的细胞样品；组织样品，其形式可为新鲜组织样品、固定化组织样品等。
本发明所述的糖链可为游离糖链或从糖复合物中释放的糖链。
游离糖链可采用本领域已知的技术获得，包括但不限于：酶法，例如可采用糖苷酶，优选糖苷酶PNGase F；化学法，例如采用β消除反应，糖蛋白肼解试剂；也可采用酶法和化学法的组合来释放糖链。
本发明所述的衍生化方法包括但不限于：甲胺化、酯化、甲基化、还原氨化、乙酰化等，可根据需要对衍生化的类型进行选择。优选酯化。
本发明中，从体液蛋白中游离下糖链后，可采用本领域已知技术对N-糖链进行纯化和/或富集。纯化、富集方法包括但不限于：离心、过滤、萃取、吸附、毛细管电泳、色谱法等。
在本发明的一个具体实施方式中，采用了Cotton HILIC SPE分离小柱富集纯化N-糖链，其中采用了水来活化分离柱，采用水:乙腈=15：85（体积比）的溶液平衡分离柱，并采用纯水洗脱糖链。
本发明中，糖链分析和数据处理可采用本领域已知的分析方法对糖组进行测定和定量。所述方法包括但不限于：质谱法，例如基质辅助激光解吸附电离质谱(MALDI MS)（如基质辅助激光解吸附电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、基质辅助激光解吸附电离-四级离子阱-飞行时间质谱(MALDI-QIT-TOF MS))、快原子轰击质谱(FAB-MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)、多级质谱、高效液相色谱HPLC、液相色谱-质谱联用法 (LC-MS)、糖芯片技术、核磁共振NMR或以上方式的任合组合。优选采用分辨率高的技术进行分析，例如MALDI MS等。
本发明中，对糖链分析数据进行进一步计算和处理以获得所需的糖组相关信息。例如，可获得样品中每种糖链峰面积相对于所有峰面积和的比值，从而获得每种糖链的相对定量值，可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，确保分析的高准确性；根据检测到的每个糖链的组成特点和生物相关性，计算出派生特征，包括岩藻糖糖基化的水平（fucosylation，F）、平分型糖链的水平（bisection，B）、末端半乳糖糖基化水平（galactosylation，G）、唾液酸化水平（sialylation，S）等。这些数据可直接用于相对含量比较或定性分析，用于监控目标糖链或糖链派生特征的丰度的变化。
糖链分析数据进行进一步计算和处理可采用各种相关的糖链分析软件、数据库、算法等对所得的数据进行分析，可用的糖链分析软件包括但不限于：MassyTools、Progenesis MALDI、LassyTools、GlycoWorkbench、GlycanMass、GlycoMod、GlycoFragment、GlycoSearchMS等。可用的糖链分析数据库包括但不限于：CCSD、GlycomeDB、CarbBank、EUROCarbDB等。
本发明中，糖链的检测方法优选是高通量检测方法，例如：可同时处理和检测96、192、288、384个或更多个样品，这大大减少了样品制备的时间。
以下实施例中，对185例慢性血栓栓塞性肺动脉高压和157例肺栓塞患者进行血液全糖组检测。所用样本的队列特征如表3所示。
表3
以上述样本为研究对象，筛选用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞鉴别诊断的糖链标志物并判断其临床应用价值，具体步骤如下：
1、糖苷酶释放N-糖链
用糖苷酶PNGase F将N-糖链从全血清/血浆糖蛋白上游离释放。具体步骤如下：从每个样本中取5 μL血清/血浆，加入10 μL的 2% SDS，60℃孵育10分钟；然后加入10μL酶解液（含2% NP-40, 2.5 × PBS 和1 U PNGase F），37℃孵育12-16 h。
2、N-糖链衍生化
用已知的衍生化技术对上述游离得到的N-糖链衍生化，经过衍生化可以将α2,3和α2,6连接键的唾液酸区分。具体步骤如下：1 µL上述酶解后的血清/血浆，加入20 µL衍生化试剂（250 mM EDC 和250 mM HOBt，溶剂为无水乙醇），37℃孵育60分钟。
3、N-糖链HILIC-SPE富集纯化
将上述得到的衍生化的糖链用HILIC-SPE进行富集纯化。HILIC利用棉线作为固定相，棉线自行填充在20 µL的枪头，制成纯化小柱，首先，用15 µL超纯水（MQ）活化柱子3次；接着，用15 μL的85% 乙腈平衡（ACN）柱子3次；再将上述衍生化糖链混合液加入柱子，上样30次，保证衍生化的N-糖链尽可能完全地被吸附在柱子上；接着用15 μL 的85% 乙腈+ 1%三氟乙酸（TFA）淋洗柱子3次，再用15 μL 的85%乙腈淋洗柱子3次；最后，将糖链洗脱于10 μL MQ 中。
4、N-糖链的质谱分析
检测前，用已知分子质量的肽段混合物标准品（Bruker Peptide CalibrationStandard II）对质谱仪器进行校正。将基质super-DHB溶于含1 mM NaOH的50%乙腈（水）溶液中，浓度为5 mg/mL。取上述1 µL纯化的N-糖链，点样于质谱靶板上，然后将1 µL基质溶液加滴在样品上，室温下晾干。应用MALDI-TOF MS进行分析，质谱配备Smartbeam 3D激光源，并在正离子反射模式（reflection positive，RP）下采集信号离子，应用FlexControl软件进行控制，样本检测时m/z范围设置为：1000 至 5000。谱图采集设置为：对于质谱靶板上的每个样本点，激光在该样本点范围内完全随机采集信号，累积10K laser shots，采集一张质谱谱图，激光频率为5000 Hz。
5、数据预处理和统计分析
使用FlexAnalysis和MassyTools软件对采集到的质谱图进行预处理，并导出到Microsoft Excel进行进一步分析。应用GlycoWorkbench的糖链解析功能辅助人工解析来解析质谱数据，糖链结构的鉴定主要基于质荷比、二级质谱碎片归属及已经发表的文献。单个糖链定量由单个糖链的峰面积/检测到的所有糖链的峰面积和得到。除了直接检测到的糖链结构外，派生糖链特征（derived glycan traits）由直接检测到的N-糖链依据其结构特点和生物相关性通过Rstudio计算所得。派生糖链特征包括：复杂型N-糖链的天线数量（antennae of complex-type glycans，CA）、岩藻糖糖基化的水平（fucosylation，F）、平分型糖链的水平（bisection，B）、末端半乳糖糖基化水平（galactosylation，G）、唾液酸化水平（sialylation，S）等。慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）和肺栓塞（PE）之间的N-糖基化的差异以及N-糖基化特征与临床参数之间的关系，通过统计检验、回归分析、受试者工作特征曲线进行评价。研究队列的质谱数据质量通过样本检测过程中随机分布在靶板上的标准品以及计算所得到的多个标品每种糖链的平均值、变异系数和标准偏差来评估。
6、结果及讨论
质量控制标品所得Top30的糖链平均CV值为5.23%，说明本发明中得到的数据可靠。
实施例1 标志物用于慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的鉴别诊断
在慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞研究队列（表3）中检测到了74种糖链结构，并根据这些直接检测到的糖链的结构特征和生物学合成途径计算得到125种派生糖链特征。由于派生特征汇总代表了直接检测到糖链的结构特征，并有助于解释结果和生物学效应，因此主要分析派生糖链特征。
上述发现的125种派生糖链特征种中有39种派生糖链特征在健康对照和肺栓塞患者之间具有显著差异（表4）。结果显示，与肺栓塞患者相比，CA3、CF0、CS、A2F0、A2F0G、A2S、A3S、A2F0S、A3FS、A2E、A3E、A2F0E、A3FE、A2GS、A3GS、A2F0GS、A3FGS、A2GE、A3GE、A2F0GE、A4F0GE、A3FGE在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者中显著降低；而CA2、CF、CB、TA2FS0、A2F、A2L0F、A3L0F、A2SF、A2LF、A2EF、A2B、A2F0B、A2SB、A2F0SB、A2F0L、A2GL、A2F0GL在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者中显著升高。根据受试者工作特征曲线（ROC）测试结果，发现上述2种糖链派生特征（A2F0E、A2GE）能够分别有效区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞（表4，表5）。这些N-糖链特征可以作为慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞鉴别诊断的潜在标志物。表4列出了慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞两组逻辑回归分析，与慢性血栓栓塞性肺动脉高压发病显著相关的派生糖链糖链，以受试者工作曲线（ROC）评估上述糖链区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的潜力，曲线下面积（AUC）在0.7以上的派生糖链如表5所示。
表4
表5
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的标志物或其检测试剂在制备用于鉴别诊断慢性血栓栓塞性肺动脉高压和肺栓塞的产品中的应用；
所述标志物包括以下糖链标志物中的一种或两种的组合：A2F0E、A2GE。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者体内，A2F0E、A2GE的表达量较肺栓塞患者显著下降。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或试剂盒。
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