CN109644990B - 一种红细胞冷冻保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，所述保存方法，包括预处理、滴加部分保护液、加入剩余保护液、浸入液氮。本发明不使用甘油、二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；本发明所述红细胞冷冻保存方法，红细胞冻存180天后，复苏后测定红细胞的指标如下：复苏细胞成活率为91‑92.5%，溶血率为3.14‑3.32%，红细胞变形指数为0.30‑0.33，延长细胞的冷冻保存时间；本发明所述红细胞冷冻保存方法，在液氮保存之前的处理时间短，预处理时间为8‑10min，加入保护液的总时间为20‑25分钟，总共才28‑35分钟。

Description

一种红细胞冷冻保存方法
技术领域
本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，属于细胞冷冻保存技术领域。
背景技术
目前临床上长期保存细胞的方法是-80℃或-196℃深低温保存，细胞在低温条件下减缓甚至暂停代谢，从而使细胞达到长期保存的目的，然而，细胞的冷冻保存往往需要加入冷冻保护剂来降低细胞内外液冰晶的产生，避免细胞遭受不可修复的机械损伤和溶质损伤以致细胞死亡。
当前临床输血的红细胞只能来自人体，如何更长期的保存红细胞，特别是稀有血型的红细胞是人们关注的问题。
目前红细胞的冷冻保存主要是采用高浓度的甘油或者二甲基亚砜。但研究发现甘油与DMSO在非冷冻条件下具有细胞毒性，例如，DMSO会抑制细胞繁殖，改变细胞的生物功能等，因此，如果使用DMSO作为细胞冷冻保护剂，必须尽可能缩短它在非冻结状态下与细胞的接触时间，而在细胞使用之前，需要充分冲洗去除DMSO，但是已进入细胞内的DMSO难以彻底清洗掉，DMSO可能已经对细胞的生理功能和活性产生了有害的影响。使用甘油作为红细胞的冷冻保护剂，解冻后需要复杂的洗涤程序去除甘油，并且仍然后有甘油残留在细胞内部，对人体有一定的毒性作用。
现有技术中的传统保护剂一般都是需要进行梯度降温（慢冻）的方法，通常需要一天的时间，繁琐耗时，不仅加剧了有毒冻存保护剂与细胞的接触时间，增加了细胞损伤的机会，还需要多种冷冻设备。另外一旦没有达到“慢冻”的降温速率要求，冻存效率就会显著下降，造成细胞复苏成活率的降低。
CN105685016A公开了细胞冻存保护组合物、该组合物的用途以及细胞冻存的方法，含有一种具有特定结构的两性分子以及细胞用养料成分，该专利避免使用甘油/二甲基亚砜等保护成分，但是该专利将一定数量的细胞加入细胞冷冻保护液中，直接放入液氮中 冻存。该方法只适合特定种类的细胞，并不适合红细胞。红细胞即使加入了冷冻保护液，直接放入液氮中冻存，也容易出现细胞损伤，造成细胞溶血率增大、复苏细胞成活率低。
CN100391473C公开了红细胞深低温保存预处理液、冷冻保护液及其应用，为了避免红细胞在液氮冷冻过程受到损伤，导致溶血率增加，复苏成活率降低，该专利需要在预处理液中先进行孵育细胞，在4-40℃水浴中孵育1-4h，细胞回收率达80%以上，溶血率约为20%，红细胞变形指数在0.3左右，但是其只提供了保存1周的效果，本领域技术人员容易判断，采用该专利方法，随着保存时间的延长，细胞的溶血率会逐渐增加，细胞成活率会逐渐降低。并且，该专利预处理的温度较高，时间也较长，会加速红细胞的衰老，缩短其生存周期。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种红细胞冷冻保存方法，实现以下发明目的：
（1）不使用甘油、二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；
（2）提高复苏红细胞成活率，减少细胞溶血率；延长冷冻保存时间；
（3）缩短投入液氮前的处理时间。
为实现上述发明目的，采用以下技术方案：
一种红细胞冷冻保存方法，所述保存方法，包括预处理、滴加部分保护液、加入剩余保护液、浸入液氮。
所述预处理，采用的预处理液，包括丙谷二肽、苏亮环二肽、葡甘露聚糖、氯化钠水溶液；质量比例为3-4:6-7:1-2：50；所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%。
所述预处理，将洗涤后的红细胞采用预处理液淋洗，预处理液的淋洗流量为1-1.5ml/min，淋洗时间为8-10分钟，预处理液的温度为2-4℃，得到预处理后的红细胞。
所述红细胞，为静脉血经过离心洗涤去除白细胞和血小板后得到；所述静脉血与保护液的体积比为5:7。
所述保护液，以重量份计，包括以下组分：葡甘露聚糖8-10份、乙酰化二淀粉磷酸酯7-10份、丙谷二肽2-3份、苏亮环二肽1-2份、羟苯丁酰亮氨酸2份、红景天苷1-2份、氯化钠水溶液70份；所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%。
所述滴加部分保护液，在2-4℃条件下，向预处理后的红细胞，滴加占总体积3/7的保护液，滴加时间为10-15分钟。
所述加入剩余保护液，加入剩余保护，2-4℃条件下浸泡10分钟，浸泡的同时，采用200-300r/min的速度低速振荡。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下有益效果：
（1）本发明不使用甘油、二甲基亚砜等对细胞有害的冷冻保护剂；
（2）本发明所述红细胞冷冻保存方法，红细胞冻存180天后，复苏后测定红细胞的指标如下：复苏细胞成活率为91-92.5%，溶血率为3.14-3.32%，红细胞变形指数为0.30-0.33，延长细胞的冷冻保存时间；
（3）本发明所述红细胞冷冻保存方法，在液氮保存之前的处理时间短，预处理时间为8-10min，加入保护液的总时间为20-25分钟，总共才28-35分钟；
（4）本发明所述红细胞冷冻保护方法，不使用梯度降温，避免了传统的“慢冻”技术因为降温速率的不稳定而造成的细胞复苏成活率低、溶血率高的技术问题。
具体实施方式
实施例1一种红细胞冷冻保护方法
（1）预处理
取静脉血50毫升，加入抗凝剂，离心洗涤去除白细胞和血小板，将洗涤后的红细胞采用预处理液淋洗，预处理液的淋洗流量为1ml/min，淋洗时间为10分钟，预处理液的温度为2-3℃，得到预处理后的红细胞。
所述预处理液，包括丙谷二肽、苏亮环二肽、葡甘露聚糖、氯化钠水溶液；质量比例为3:7:1：50；
所述预处理液的制备方法，将各成分混合后，经过超声处理制备。
所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%。
（2）滴加部分保护液
然后在2-3℃条件下，向预处理后得到的红细胞，滴加30ml保护液，滴加速度为2ml/min；滴加时间为15分钟，滴加时候注意从容器壁上滴下，避免滴落的液体损伤细胞。
所述保护液，以重量份计，包括以下组分：葡甘露聚糖8份、乙酰化二淀粉磷酸酯10份、丙谷二肽3份、苏亮环二肽1份、羟苯丁酰亮氨酸2份、红景天苷2份、氯化钠水溶液70份。
（3）加入剩余保护液
加入剩余保护液40ml，2-3℃条件下浸泡10分钟，浸泡的同时，采用200r/min的速度低速振荡。
（4）浸入液氮
将含有红细胞的保护液，分装在冷藏管中，做好标记，快速投入液氮中进行冷冻保存。
解冻细胞时，将样品取出，40℃水浴中快速解冻，测定红细胞的各项指标。
红细胞冻存180天后，复苏后测定红细胞的指标如下：
复苏细胞成活率为92.5%，溶血率为3.14%，红细胞变形指数为0.33。
实施例2一种红细胞冷冻保护方法
（1）预处理
取静脉血50毫升，加入抗凝剂，离心洗涤去除白细胞和血小板，将洗涤后的红细胞采用预处理液淋洗，预处理液的淋洗流量为1.5ml/min，淋洗时间为8分钟，预处理液的温度为4℃，得到预处理后的红细胞。
所述预处理液，包括丙谷二肽、苏亮环二肽、葡甘露聚糖、氯化钠水溶液；质量比例为4:6:2：50；
所述预处理液的制备方法，将各成分混合后，经过超声处理制备。
所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%。
（2）滴加部分保护液
然后在4℃条件下，向预处理后得到的红细胞，滴加30ml保护液，滴加速度为3ml/min；滴加时间为10分钟，滴加时候注意从容器壁上滴下，避免滴落的液体损伤细胞。
所述保护液，以重量份计，包括以下组分：葡甘露聚糖10份、乙酰化二淀粉磷酸酯7份、丙谷二肽2份、苏亮环二肽2份、羟苯丁酰亮氨酸1份、红景天苷1份、氯化钠水溶液70份。
（3）加入剩余保护液
加入剩余保护液40ml，4℃条件下浸泡10分钟，浸泡的同时，采用300r/min的速度低速振荡。
（4）浸入液氮
将含有红细胞的保护液，分装在冷藏管中，做好标记，快速投入液氮中进行冷冻保存。
解冻细胞时，将样品取出，40℃水浴中快速解冻，测定红细胞的各项指标。
红细胞冻存180天后，复苏后测定红细胞的指标如下：
复苏细胞成活率为91.0%，溶血率为3.32%，红细胞变形指数为0.30。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种红细胞冷冻保存方法，其特征在于：所述保存方法，包括预处理、滴加部分保护液、加入剩余保护液、浸入液氮；
所述预处理，采用的预处理液，包括丙谷二肽、苏亮环二肽、葡甘露聚糖、氯化钠水溶液；质量比例为3-4:6-7:1-2：50；所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%；
所述预处理，将洗涤后的红细胞采用预处理液淋洗，预处理液的淋洗流量为1-1.5mL/min，淋洗时间为8-10分钟，预处理液的温度为2-4℃，得到预处理后的红细胞；
所述保护液，以重量份计，包括以下组分：葡甘露聚糖8-10份、乙酰化二淀粉磷酸酯7-10份、丙谷二肽2-3份、苏亮环二肽1-2份、羟苯丁酰亮氨酸2份、红景天苷1-2份、氯化钠水溶液70份；所述氯化钠水溶液，质量浓度为0.9%；
所述红细胞，为静脉血经过离心洗涤去除白细胞和血小板后得到；所述静脉血与保护液的体积比为5:7；
所述滴加部分保护液，在2-4℃条件下，向预处理后的红细胞，滴加占总体积3/7的保护液，滴加时间为10-15分钟；所述加入剩余保护液，加入剩余保护液，2-4℃条件下浸泡10分钟，浸泡的同时，采用200-300r/min的速度低速振荡。
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