CN109641921B - 分子荧光团及其制备方法和用于短波红外成像的用途 - Google Patents
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Abstract
提供了用于在短波红外窗口(1000‑1700nm)中的生物成像的分子荧光团的设计、合成和应用。所述分子荧光团化合物包含具有电子接受芳族单元、电子供给芳族单元和屏蔽单元的结构，所述屏蔽单元屏蔽共轭骨架免于分子间相互作用。
Description
技术领域
本公开内容的实施方案总体涉及利用分子荧光团进行生物医学成像。
背景技术
生物医学成像的发展要求更高的成像分辨率和更深的穿透深度，其受光子散射、生物组织自荧光和水光学吸收限制。已知的是，在较长波长下，光子散射减少并且生物组织自荧光降低。同时，在近红外区水光学吸收低。因此，对于体内光学成像，短波红外(SWIR，SWIR1.0-1.7μm)相对于传统近红外窗口(750-1000nm)近来已显示前景。
无机纳米材料(如碳纳米管、PbS和Ag2S量子点)和稀土纳米粒子由于其低带隙、高量子产率和良好稳定性而已被用为SWIR荧光团。然而，这些基于纳米材料的SWIR荧光团由于其大尺寸通常非常难以从身体清除并且具有毒性问题。
有机分子染料可以是更好的替代方案，因为相比于无机纳米材料，可以使它们是更加生物相容的并且易于从身体排泄。分子荧光团性质可以更容易地通过结构工程调整。然而，一般分子荧光剂如吲哚菁绿(ICG)、亚甲蓝(MB)和异硫氰酸荧光素(FITC)展现出低于900nm的荧光。一些多次甲基染料如IR-26、IR-1051和IR-1100可以具有在SWIR区域中的发射。但是这些染料从未被用于生物成像，因为它们都不是水溶性的。尽管小分子染料和聚合物已被用作SWIR荧光团，但是由于其在水溶液中的低溶解性，所以它们必须被包封在亲水性聚合物基质中。这样的包封显著地增加粒度，阻止快速排泄并且降低量子产率。近来，已报道分子染料CH1055具有SWIR发射并且显示肾排泄。然而，这样的染料的发射量子产率对于实时成像太低(低于0.2％)，尺寸(分子量9.7k Da)相对大并且荧光限制在低于～1200nm。因此，对于开发作为以下SWIR荧光团的有机分子仍然是高度挑战，所述SWIR荧光团具有良好水溶性和生物相容性、高量子产率、在相比于先前报道的较长波长下的荧光发射和与生物分子的高度有效缀合，其对于充分开发用于研究和潜在临床转化的SWIR基于荧光的成像方法是非常重要的。
发明内容
以下简述不意图包括本发明的所有特征和方面，也不意味着本发明必须包括在此概述中述及的全部特征和方面。
本发明包括用于在SWIR或SWIR窗口中的生物成像的分子荧光团的设计、合成和应用。一些分子荧光团可以伸展到NIR窗口。本公开内容的实施方案寻求在至少一定程度上解决相关领域中存在的问题中的至少一个，这些问题包括：1)低发射量子产率。2)分子荧光团在含水和生物溶液中有限的溶解性。3)与生物分子(包括靶向配体或抗体)缀合的低产率。4) 荧光限制在低于～1200nm。在本发明中，采用给体-受体-给体结构和强受体单元以提供分子荧光团的低带隙。引入新型给体单元以提供共轭骨架的构象畸变，这可以减小分子间和分子内相互作用，由此增强QY。为了进一步降低分子间相互作用，本发明的发明人在共轭骨架的末端处引入屏蔽(包裹)单元，其可以包盖共轭骨架。屏蔽单元和给体单元可以引入端官能化侧链，其可以通过高度有效点击反应(如叠氮化物–炔环加成)而缀合至亲水单元(如PEG) 或其他靶向配体，已知所述点击反应优于用于之前染料的典型缀合化学。重要地，通过调整给体和屏蔽基团，发明人已开发了荧光>1200nm的SWIR荧光团，其优于荧光<1200nm的 CH1055染料并且可以在体内提供显著减少的散射效应并且因此提供更深的组织成像深度。这些SWIR染料还含有叠氮基以促进以优于基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯的缀合的超高效率的生物缀合。
本公开内容的第一个宽泛方面的实施方案提供一种化合物，其包含：
电子接受芳族单元(或称为受电子芳族单元，electron accepting aromaticunit)，
任选的电子供给芳族单元(或称为给电子芳族单元，electron donatingaromatic unit)，和
屏蔽单元，其屏蔽所述电子接受芳族单元和/或电子供给芳族单元免于分子间相互作用，
其中所述电子接受芳族单元、电子供给芳族单元和屏蔽单元经由共价键连接。
根据本发明的一些实施方案，电子接受芳族单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
Z1和Z2中的每一个独立地是O、S、Se或NR，
各个R独立地是H、Cn1H2n1+1或叔丁氧羰基，
n1是1至12范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，电子供给芳族单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
各个R1独立地是H、Cn2H2n2+1或叔丁氧羰基，
各个X独立地是S、Se、NR1或O，
Y1和Y2中的每一个独立地是H、OCn2H2n2+1、Cn2H2n2+1、
OCn2H2n2B或Cn2H2n2Z，
各个B独立地是Br、I、OTs、OMs、ONs、N3或OMe，
各个Z独立地是Br或N3，
各个m独立地是0至6范围内的整数，
各个n2独立地是1至20范围内的整数，
各个p独立地是1至20范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，屏蔽单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
各个R2独立地是OCn3H2n3+1、Cn3H2n3+1、
OCn3H2n3W或Cn3H2n3W，
各个n3独立地是0至20范围内的整数，
各个p独立地是1至20范围内的整数，
各个W独立地是H、Br、I、OH、OTs、N3、
Z5、Z6和Z7中的每一个独立地是S、Se、O或NR2’，
R2’是H、Cn5H2n5+1或叔丁氧羰基，
各个X1独立地是Si、Ge或C，
n5是1至20范围内的整数，
n是4至120范围内的整数，
各个b独立地是1至6范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含两个屏蔽单元和两个电子供给芳族单元，并且所述化合物具有式：S’1-D1-A-D2-S’2，其中
S’1表示第一屏蔽单元，
S’2表示第二屏蔽单元，
D1表示第一电子供给芳族单元，
D2表示第二电子供给芳族单元，
A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有式：S’-D-A，其中
S’表示屏蔽单元，
D表示电子供给芳族单元，
A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含两个电子接受芳族单元、三个电子供给芳族单元和两个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’3-D3-A1-D5-A2-D4-S’4，其中
S’3表示第三屏蔽单元，
S’4表示第四屏蔽单元，
D3表示第三电子供给芳族单元，
D4表示第四电子供给芳族单元，
D5表示第四电子供给芳族单元，
A1表示第一电子接受芳族单元，
A2表示第二电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含一个电子接受芳族单元、两个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’5-A-S’6，其中
S’5表示第五屏蔽单元，
S’6表示第六屏蔽单元，
A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含一个电子接受芳族单元、四个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’7-S’8-A-S’9-S’10，其中
S’7表示第七屏蔽单元，
S’8表示第八屏蔽单元，
S’9表示第九屏蔽单元，
S’10表示第十屏蔽单元，
A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
Y1和Y2中的每一个独立地是H、Cn2H2n2+1、OCn2H2n2+1、OCn2H2n2B、
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
本公开内容的第二宽泛方面的实施方案提供一种试剂盒，其包括上述化合物。
本公开内容的第三宽泛方面的实施方案提供上述化合物或试剂盒在标记生物分子或缀合至生物分子中的用途。
根据本发明的一些实施方案，通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，生物分子和上述化合物经由利用上述化合物上的叠氮基的点击化学或分子间力结合在一起，从而形成稳定的非共价复合物。
根据本发明的一些实施方案，生物分子包括小生物活性分子(叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖、生物素等)、肽(十肽：synB3、卵巢癌特异性结合肽：OSBP-1和OSBP-S等)、抗体(爱必妥(erbitux)、抗-SA2、赫赛汀(Herceptin)、针对人或动物抗体的二抗、阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗 (belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、康纳单抗 (canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、妥珠单抗(certolizumab pegol)、达克珠单抗 (daclizumab)、达雷木单抗(daratumumab)、狄诺塞麦(denosumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗(infliximab)、易普利姆玛(ipilimumab)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)等)、蛋白质(链霉亲和素等)、亲合体(affibody)、核酸和适体，它们利用末端炔基改性然后与荧光团叠氮化物进行点击反应。
本公开内容的第四宽泛方面的实施方案提供上述化合物与生物分子的缀合物，其中生物分子包括利用末端炔基修饰的小生物活性分子、肽、抗体、蛋白质、亲合体、核酸和适体。
根据本发明的一些实施方案，通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，生物分子和上述化合物经由利用上述化合物上的叠氮基团的点击化学或分子间力缀合在一起，从而形成稳定的非共价复合物。根据本发明的一些实施方案，此处所述的生物分子与以上提及的生物分子相同，并且将不再详细描述。
本公开内容的第五宽泛方面的实施方案提供上述化合物、试剂盒或缀合物在生物医学成像中的用途。
根据本发明的一些实施方案，此处所述的生物分子与以上提及的生物分子相同，并且将不再详细描述。
本公开内容的第六宽泛方面的实施方案提供一种生物医学成像的方法，包括：
将上述化合物、试剂盒或缀合物施用至受试者，
通过NIR光源在关注的部位处照射所述受试者，
通过照相机记录荧光图像或视频。
根据本发明的一些实施方案，受试者包括动物、人、组织、细胞、3D类器官(organoid) 或球状体(spheroid)。
根据本发明的一些实施方案，将上述化合物、试剂盒或缀合物施用到受试者的血管、组织、器官或淋巴结中。
根据本发明的一些实施方案，NIR光源是激光光源或发光二极管，并且NIR光源的波长为780nm、808nm或980nm。
根据本发明的一些实施方案，照相机包括用于在900nm-1700nm成像的InGaAs照相机、 Si电荷耦合器件(CCD)或用于在800-1100nm范围内成像的具有或不具有NIR增强检测器的照相机。
根据本发明的一些实施方案，对人体或动物体的脑、眼或其他器官中具有荧光团循环的血管进行成像，用于癌症转移诊断的对瘤旁的淋巴结成像的前哨淋巴结(SLN)定位(mapping)，或者通过靶向归巢至机体中癌细胞的荧光团-生物分子对癌症进行分子成像。
本公开内容的第七宽泛方面的实施方案提供一种成像引导的肿瘤手术的方法，包括：
通过上述的生物医学成像的方法记录靶向区域的图像，
利用所述图像指导肿瘤移除。
本公开内容的第八宽泛方面的实施方案提供一种用于标记生物分子的方法，包括：
使上述化合物或试剂盒与生物分子反应，或者在加热至40-70摄氏度或没有加热至40-70 摄氏度的情况下将上述化合物或试剂盒与生物分子混合。
根据本发明的一些实施方案，生物分子包括小生物活性分子(叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖、生物素等)、肽(十肽：synB3、卵巢癌特异性结合肽：OSBP-1和OSBP-S等)、亲合体、抗体(爱必妥、抗-SA2、赫赛汀、针对人或动物抗体的二抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、达雷木单抗、狄诺塞麦、依库珠单抗、依法珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、乌司奴单抗、维多珠单抗等)和蛋白质(链霉亲和素等)、核酸以及适体，它们用末端炔基修饰然后与荧光团叠氮化物进行点击反应。
术语“生物分子”与如此处所述的SWIR染料组合使用，所述SWIR染料连接至特异性结合至靶标中关注的标记物的分子或分子片段。“小生物活性分子”如叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖，它们可以结合至其选择性地在肿瘤细胞的表面上过度表达的特异性受体。一些特异性肽受体还通过其配体受体显示与其“肽”配体的最高结合亲和性和特异性，所述配体受体可以将肽-染料缀合配体定向地递送至靶向细胞和组织。“抗体分子”是任意免疫球蛋白，包括抗体和片段，其结合至特异性抗原，这可以预期重组产生的完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。通过利用生物分子的特异性，可以在体内、体外或离体实现靶向生物成像或分子成像。
本发明中的上述化合物可以用作具有增强的量子产率和良好的生物相容性的分子SWIR 荧光团。这些化合物在400-1000nm范围内的光激发下展现出在900-1700nm范围内的荧光，共轭骨架的分子间和分子内相互作用减少并且量子产率增强。同时，分子荧光团(上述化合物)展现出良好的水溶性并且染料在水溶液中的动态范围足够小以确保经由肾或胆管系统的快速尿液或粪便排泄以及很小的毒性。所述分子染料的高量子产率和生物相容性连同其 SWIR发射打开了将分子荧光团用于体内应用的SWIR成像的机会。
本文中公开的任一实施方案可以与其他实施方案组合，只要它们不相互矛盾，即使这些实施方案是在本发明的不同方面进行描述的。另外，一个实施方案中的任何技术特征可以应用于在其他实施方案中的相应技术特征，只要它们不相互矛盾，即使这些实施方案是在本发明的不同方面进行描述的。
本公开内容的以上概述不意图描述各个公开的实施方案或本公开内容的每一种实现。以下的附图和详述更具体地例举了说明性实施方案。
本公开内容的实施方案的另外方面和优点将部分地在以下描述中给出，部分地根据以下描述变得明显或者从本公开内容的实施方案的实施领会。
附图简述
根据以下参照附图的描述，本公开内容的实施方案的这些和其他方面与优点将变得明显并且更易于理解，附图中：
图1， a示出了IRETBN-PEG1700在水溶液中的吸收和发射光谱，图1， b示出了在1周内测量的IRETBN-PEG1700在水和PBS中的荧光强度。
图2示出了利用经由尾静脉注射在小鼠血流中循环的IRETBN-PEG1700荧光团的小鼠脑血管的SWIR成像。
图3示出了在注射IREFNS溶液后带有4T1肿瘤的小鼠的SWIR荧光图像。荧光团通过EPR效应在肿瘤中积累，允许以高肿瘤/正常组织信号比进行肿瘤成像。
图4示出了在炔官能生物分子和叠氮化物官能化SWIR荧光团之间的缀合的示意图。
图5示出了在荧光团-蛋白缀合物和游离荧光团的密度梯度超离心(DGU)分离后的样品通过808nm激光激发的荧光。
图6， a示出了显示IRETBN-PEG1700在注射后6h在小鼠的膀胱中积累的SWIR荧光图像，图6， b示出了在注射后3h收集的尿液的SWIR图像。
具体实施方式
将详细提及本公开内容的实施方案。在本文中参照附图描述的实施方案是示例性的、说明性的，并且用于总体地理解本公开内容。这些实施方案不应解释为限制本公开内容。相同或相似要素以及具有相同或相似功能的要素在说明书通篇中通过相同标号表示。
如本文中使用的，语法冠词“一个”、“一种”和“该”意图包括“至少一个”或“一个或多个”，除非本文另有指明或明显地与上下文相矛盾。因此，这些冠词在本文中用来指该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。作为示例，“一个组分”意指一个或多个组分，并且因此，可能地，考虑并且在所述实施方案的实施中可以采用或使用多于一个组分。
术语“包括”意味着开放式的，包括所指明的组分但不排除其他要素。
本公开内容的第一宽泛方面的实施方案提供了一种化合物，其包含：
电子接受芳族单元，
任选的电子供给芳族单元，和
屏蔽单元，其屏蔽所述电子接受芳族单元和/或电子供给芳族单元免于分子间相互作用，
其中所述电子接受芳族单元、电子供给芳族单元和屏蔽单元经由共价键连接。
根据本发明的一些实施方案，电子接受芳族单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
Z1和Z2中的每一个独立地是O、S、Se或NR，
各个R独立地是H、C2n+1H2n+1或叔丁氧羰基，
n1是1至12范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，电子供给芳族单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
各个R1独立地是H、Cn2H2n2+1或叔丁氧羰基，
各个X独立地是S、Se、NR1或O，
Y1和Y2中的每一个独立地是H、OCn2H2n2+1、Cn2H2n2+1、
OCn2H2n2B或Cn2H2n2Z，
各个B独立地是Br、I、OTs、OMs、ONs、N3或OMe，
各个Z独立地是Br或N3，
各个m独立地是0至6范围内的整数，
各个n2独立地是1至20范围内的整数，
各个p独立地是1至20范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，靠近“A”单元(电子接受芳族单元)侧的“D”单元(电子供给芳族单元)的取代是优选的，这可以提高分子染料在水溶液中的量子产率，可能是由于减少的分子间和分子内相互作用。如：
根据本发明的一些实施方案，屏蔽单元具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
各个R2独立地是OCn3H2n3+1、Cn3H2n3+1、
OCn3H2n3W或Cn3H2n3W，
各个n3独立地是0至20范围内的整数，
各个p1独立地是1至20范围内的整数，
各个W是H、Br、I、OH、OTs、N3、
Z5、Z6和Z7中的每一个独立地是S、Se、O或NR2’，
R2’是H、Cn5H2n5+1或叔丁氧羰基，
各个X1独立地是Si、Ge或C，
各个n5是1至20范围内的整数，
各个n是4至120范围内的整数，
各个b独立地是1至6范围内的整数。
根据本发明的一些实施方案，屏蔽单元含有伸展到共轭骨架(电子接受芳族单元和/或电子供给芳族单元)的面外部的侧链，这可以减少分子共轭骨架的堆叠。这些侧链的末端用聚乙二醇(PEG)、离子基团(如季铵盐)官能化，这可以增强水溶性。有时，这些侧链的末端用叠氮基(N3)官能化用于与靶向配体的进一步缀合。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含两个屏蔽单元和两个电子供给芳族单元，并且所述化合物具有式：S’1-D1-A-D2-S’2，其中S’1表示第一屏蔽单元，S’2表示第二屏蔽单元，D1表示第一电子供给芳族单元，D2表示第二电子供给芳族单元，A表示电子接受芳族单元。换句话说，S’1表示两个屏蔽单元中的一个屏蔽单元，S’2表示两个屏蔽单元中的另一个屏蔽单元，D1表示两个电子供给芳族单元中的一个电子供给芳族单元，D2表示两个电子供给芳族单元中的另一个电子供给芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有式：S’-D-A，其中S’表示屏蔽单元，D表示电子供给芳族单元，A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含两个电子接受芳族单元、三个电子供给芳族单元和两个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’3-D3-A1-D5-A2-D4-S’4，其中S’3表示第三屏蔽单元，S’4表示第四屏蔽单元，D3表示第三电子供给芳族单元，D4表示第四电子供给芳族单元，D5表示第五电子供给芳族单元，A1表示第一电子接受芳族单元，A2表示第二电子接受芳族单元。换句话说，S’3表示两个屏蔽单元中的一个屏蔽单元，S’4表示两个屏蔽单元中的另一个屏蔽单元。D3表示三个电子供给芳族单元中的一个电子供给芳族单元，D4表示三个电子供给芳族单元中的另一个电子供给芳族单元，D5表示三个电子供给芳族单元中的第三电子供给芳族单元。A1表示两个电子接受芳族单元中的一个电子接受芳族单元，A2表示两个电子接受芳族单元中的另一个电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含一个电子接受芳族单元、两个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’5-A-S’6，其中
S’5表示第五屏蔽单元，
S’6表示第六屏蔽单元，
A表示电子接受芳族单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物包含一个电子接受芳族单元、四个屏蔽单元，并且所述化合物具有式：S’7-S’8-A-S’9-S’10，其中S’7表示第七屏蔽单元，S’8表示第八屏蔽单元，S’9表示第九屏蔽单元，S’10表示第十屏蔽单元，A表示电子接受芳族单元。换句话说，A1表示电子接受芳族单元，S’7、S’8、S’9和S’10分别表示四个屏蔽单元中的一个屏蔽单元。
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
Y1和Y2中的每一个独立地是H、Cn2H2n2+1、OCn2H2n2+1、OCn2H2n2B、
根据本发明的一些实施方案，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
术语“-PEG600”、“-PEG1000”和“-PEG1700”表示
的式，600、700和1000表示重均分子量，并且n的值取决于重均分子量。
在本发明中，
的含义是R1、R2、R3、R4中的两个表示 N3，R1、R2、R3、R4中的另外两个表示
除非本文另有指明或明显地与上下文相矛盾。其他类似的描述是一样的。
本公开内容的第二宽泛方面的实施方案提供一种试剂盒，其包括上述化合物。上述试剂盒可以用作用于生物医学成像或标记生物分子的分子荧光。
本公开内容的第三宽泛方面的实施方案提供上述化合物或试剂盒在标记生物分子或缀合至生物分子中的用途。因此，生物分子可以通过分子荧光(上述化合物)追踪。根据本发明的一些实施方案，所述分子可以进一步结合至肿瘤、血管等，因此该肿瘤、血管等也可以被追踪。
根据本发明的一些实施方案，通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，生物分子和上述化合物经由利用上述化合物上的叠氮基的点击化学或分子间力结合在一起，从而形成稳定的非共价复合物。
根据本发明的一些实施方案，生物分子包括小生物活性分子(叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖、生物素等)、肽(十肽：synB3、卵巢癌特异性结合肽：OSBP-1和OSBP-S等)、抗体(爱必妥、抗-SA2、赫赛汀、针对人或动物抗体的二抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、达雷木单抗、狄诺塞麦、依库珠单抗、依法珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、乌司奴单抗、维多珠单抗等)、蛋白质(链霉亲和素等)、亲合体、核酸和适体，它们利用末端炔基修饰然后与荧光团叠氮化物进行点击反应。
本公开内容的第四宽泛方面的实施方案提供一种上述化合物与生物分子的缀合物，其中生物分子包括用末端炔基修饰的小生物活性分子、肽、抗体、蛋白质、亲合体、核酸和适体。所述缀合物可以用作用于生物医学成像如血管成像(用于TBI的脑血管，肿瘤血管)、肿瘤成像等的分子荧光。
根据本发明的一些实施方案，通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，生物分子和上述化合物经由利用上述化合物上的叠氮基的点击化学或分子间力缀合在一起，从而形成稳定的非共价复合物。根据本发明的一些实施方案，此处所述的生物分子与以上提及的生物分子相同，并且将不再详细描述。本公开内容的第五宽泛方面的实施方案提供上述化合物、试剂盒或缀合物在生物医学成像中的用途。上述化合物、或试剂盒或缀合物可以用作具有增强量子产率和良好生物相容性的用于生物医学成像的分子荧光。
根据本发明的一些实施方案，此处所述的生物分子与以上提及的生物分子相同，并且将不再详细描述。
本公开内容的第六宽泛方面的实施方案提供一种生物医学成像的方法，包括：将所述化合物、试剂盒或缀合物施用至受试者，通过NIR光源在关注的部位处照射所述受试者，并且通过照相机记录图像。通过使用上述的化合物或缀合物作为分子荧光，显著提高了量子产率和生物相容性。
根据本发明的一些实施方案，关注的部位包括血管(脑血管、肿瘤血管等)、肿瘤、淋巴系统等等。
根据本发明的一些实施方案，受试者包括动物、人、组织、细胞、3D类器官或球状体。本发明的方法可以有效地用于动物或人体的非侵入性生物医学成像，如靶向肿瘤成像、血管成像、淋巴系统成像，以及可以用于临床诊断的动物或人体的多个部分中的其他靶标。
根据本发明的一些实施方案，将上述化合物或缀合物施用到受试者的血管、组织、器官或淋巴结中。所述化合物或缀合物能够在靶区域中积累，然后可以容易地获得该靶区域的图像。
根据本发明的一些实施方案，NIR光源是激光光源或发光二极管，并且NIR光源的波长为780nm、808nm或980nm。因此，显著减少光子散射、生物组织自荧光和水光学吸收，并且QY高。
根据本发明的一些实施方案，照相机包括用于在900nm-1700nm成像的InGaAs照相机、 Si电荷耦合器件(CCD)或者用于在800-1100nm范围内成像的具有或不具有NIR增强检测器的照相机。
根据本发明的一些实施方案，对人体或动物体的脑、眼或其他器官中具有荧光团循环的血管进行成像，用于癌症转移诊断的对瘤旁的淋巴结成像的前哨淋巴结(SLN)定位，或者通过靶向归巢至机体中癌细胞的荧光团-生物分子对癌症进行分子成像。
本公开内容的第七宽泛方面的实施方案提供一种成像引导的肿瘤手术的方法，包括：通过上述的生物医学成像的方法记录靶向区域的图像，利用所述图像指导肿瘤移除。本发明的方法可以减少肿瘤手术困难，并且提高操作精度。
本公开内容的第八宽泛方面的实施方案提供一种用于标记生物分子的方法，包括：使上述化合物或试剂盒与生物分子反应，或者在加热至40-70摄氏度或没有加热至40-70摄氏度的情况下将上述化合物或试剂盒与生物分子混合。通过使用上述化合物作为分子荧光，显著地提高了生物相容性和荧光强度。
根据本发明的一些实施方案，生物分子包括小生物活性分子(叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖、生物素等)、肽(十肽：synB3、卵巢癌特异性结合肽：OSBP-1和OSBP-S等)、亲合体、抗体(爱必妥、抗-SA2、赫赛汀、针对人或动物抗体的二抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、达雷木单抗、狄诺塞麦、依库珠单抗、依法珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、乌司奴单抗、维多珠单抗等)，以及蛋白质(链霉亲和素等)、核酸和适体，它们用末端炔基修饰，然后与荧光团叠氮化物进行点击反应。
本发明中以上提及的化合物可以用作具有增强的量子产率和良好的生物相容性的分子 SWIR荧光团。这些化合物在400-1000nm范围内的光激发下展现出在900-1700nm范围内的荧光，共轭骨架的分子间和分子内相互作用减少并且量子产率增强。同时，分子荧光团(上述化合物)展现出良好的水溶性并且染料在水溶液中的动态范围足够小以确保经由肾或胆管系统的快速尿液或粪便排泄以及很小的毒性。所述分子染料的高量子产率和生物相容性连同其SWIR发射打开了将分子荧光团用于体内应用的SWIR成像的机会。
在以下所述的实施例中，所有空气和湿气敏感反应都在氮气氛下在火焰干燥的玻璃器具中进行。反应性液体化合物通过气密性注射器测量和转移，并且经由橡胶隔板加入到反应烧瓶中。四氢呋喃(THF)从二苯甲酮钠(sodium benzophenoneketyl)新蒸。甲苯从CaH2蒸馏。除非另有说明，所有试剂商购获得并且在没有进一步纯化下使用。
实施例1：IRETBN-PEG1700和IRETBN-PEG600的合成
(1)5-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)噻吩-2-基)-2,3-二氢-噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯(化合物2)的合成：
在Ar气氛下，向三丁基(2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)锡烷(860mg，2.0 mmol)和化合物1(720mg，1.2mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(71mg，0.061 mol)。将混合物在110℃搅拌24h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/DCM1:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物2，为浅黄色油状物(590mg，45％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.45(d,J＝3.9Hz,1H),7.24(d,J＝3.9Hz,1H),7.17(t,J＝ 8.3Hz,1H),6.61(d,J＝8.4Hz,2H),6.21(s,1H),4.37–4.32(m,2H),4.28–4.23(m,2H),4.01 (t,J＝6.2Hz,4H),3.38(t,J＝6.9Hz,4H),1.84(m,7.2Hz,8H),1.52–1.43(m,8H)；13CNMR (100MHz,CDCl3)：δ157.1,141.9,137.2,134.3,132.6,129.2,128.2,122.1,113.0,112.9,105.5, 96.4,68.9,64.9,64.7,33.9,32.7,29.0,27.9,25.3；
HRMS(ESI)对于C28H35Br2O4S2 +，([M+H+])计算值657.0344，实测值657.0347。
(2)(7-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)噻吩-2-基)-2,3-二氢-噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)三丁基锡烷(化合物3)的合成：
在-78℃在Ar气氛下，向化合物2(350mg，0.53mmol)在5mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1mL，1.6mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h 之后，将三正丁基氯化锡(330mg，1mmol)加入至溶液。然后，将反应混合物慢慢温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
(3)化合物4的合成：
在Ar气氛下，向化合物a(72mg，0.2mmol)和化合物3(400mg，0.44mmol)在5mL 甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(35mg，0.03mol)。将混合物在110℃搅拌48h。在冷却至室温之后，将混合物倒入到水中并用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物5，为深绿色固体(93mg，31％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝4.0Hz,2H),7.42(d,J＝4.0Hz,2H),7.19(t,J＝ 8.3Hz,2H),6.63(d,J＝8.4Hz,4H),4.51(m,4H),4.37(m,4H),4.04(t,J＝6.3Hz,8H),3.40(t, J＝6.8Hz,8H),1.87(m,16H),1.55–1.43(m,16H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ157.1, 152.5,141.6,137.6,134.0,133.9,129.4,128.4,123.2,117.6,113.0,112.8,108.4,105.5,69.0,64.9, 64.8,34.0,32.8,29.1,28.0,25.5；
HRMS(ESI)对于C62H67Br4N4O8S6 +，([M+H+])计算值1503.0017，实测值1503.1578。
(4)IRETBN-1700和IRETBN-PEG600的合成。将化合物4(50mg，0.036mmol)溶解在5mL DMF中。然后，加入叠氮化钠(47mg，0.72mmol)并将反应溶液在60C搅拌20h。之后，加入一大份水，并将产物用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到叠氮化物产物，为深绿色固体43mg(定量)。
将叠氮化物产物20mg溶解在5mL THF中并加入碘化亚铜100mg、α-炔基-ω-羟基-聚(乙二醇)-1.7k(HO-PEG-炔-1.7k，重均分子量＝1.68k，PDI＝1.05)120mg和三乙胺200uL。将体系在RT搅拌48h。然后，将反应混合物用Al2O3过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在15mL水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干。得到 IRETBN-1700(100mg)，为黄色粉末。MALDI-TOF-MS预期的M.W.约4,500，测得的重均 M.W.约4,500。(表明两个PEG链通过点击反应连接至染料分子。染料分子中的另外两个叠氮基被所引入的PEG链封闭用于进一步的点击反应)。并且通过使用HO-PEG-炔-0.6k(重均分子量＝0.60k)，利用相同方法制备IRETBN-PEG600，为浅绿色粉末。MALDI-TOF-MS预期的M.W.约2,800，测得的重均M.W.约2,800。
IRETBN-1700在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝835nm，发射峰λem＝1098nm，在808 nm的吸收系数K＝1.1L/g.cm，量子产率为0.7％(利用808nm激发)
IRETBN-600在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝830nm，发射峰λem＝1098nm，在808 nm的吸收系数K＝1.22L/g.cm，量子产率为0.9％(利用808nm激发)
实施例2：IREF-PEG600和IREFN-PEG600的合成。
(1)5-(9H-芴-2-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯(化合物6)的合成：
在保护气体气氛下，将2-溴-9H-芴(化合物5)(5.0g，20.4mmol)和三丁基(2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)锡烷(9.2g，21.4mmol)溶解在40mL甲苯中，然后加入 Pd(PPh3)4(200mg)。在回流6h之后，将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物6，为浅黄色固体(5.8g，94％)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.94(dd,J＝3.8,1.7Hz,1H),7.82–7.74(m,3H),7.56(dd,J ＝7.3,2.0Hz,1H),7.40(td,J＝7.5,2.7Hz,1H),7.36–7.29(m,1H),6.41–6.26(m,1H),4.37–4.31(m,2H),4.29–4.23(m,2H),3.95(s,2H)。13C NMR(126MHz，氯仿-d)δ37.60,65.10, 65.41,98.00,118.68,120.45,120.62,123.15,125.43,125.64,127.22,127.41,132.37,138.60, 140.84,142.11,142.91,144.05,144.30。
HRMS(ESI)对于C19H15O2S+，([M+H+])计算值307.0793，实测值307.0787。
(2)5-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯(化合物7) 的合成：
在0℃，将5-(9H-芴-2-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯(化合物6)(3.0g，9.8 mmol)和1,6-二溴己烷(9.7g，40mmol)溶解在50mL THF中。然后逐滴加入在THF中的叔丁醇钾(2.5g，2.1mmol)。在RT反应6h之后，将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物 7，为浅黄色油状物(4.9g，81％)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.77(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.71(ddd,J＝7.9,4.6,0.8Hz, 2H),7.69–7.64(m,1H),7.41–7.29(m,3H),6.35(s,1H),4.42–4.34(m,2H),4.34–4.26(m, 2H),3.30(t,J＝6.8Hz,4H),2.02(dt,J＝11.1,5.7Hz,4H),1.74–1.59(m,4H),1.29–1.17(m, 4H),1.16–1.04(m,4H),0.78–0.56(m,4H)。13C NMR(126MHz，氯仿-d)δ23.54,27.76,29.06, 32.65,34.07,40.20,55.01,64.52,64.88,77.29,97.35,118.20,119.70,119.88,120.23,122.77, 124.98,126.92,127.02,132.09,138.06,139.69,140.86,142.38,150.55,150.77。
HRMS(ESI)对于C31H37Br2O2S+，([M+H+])计算值630.0803，实测值631.0861。
(3)化合物8的合成：
在-78℃在Ar气氛下，向化合物7(2.0g，3.18mmol)在25mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，2.4mL，3.8mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h之后，将三正丁基氯化锡(1.3g，3.8mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌 8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在Ar气氛下，向上述粗产物(1.4g，1.5mmol)和a的化合物(195mg，0.5mmol)在15mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(100mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物8，为深绿色固体(435mg，60％)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)δ7.95(dd,J＝7.8,1.7Hz,2H),7.85–7.73(m,6H),7.39–7.32(m,6H),4.54(dd,J＝6.0,2.6Hz,4H),4.48–4.32(m,4H),3.31(t,J＝6.8Hz,8H),2.11–2.01(m,8H),1.70–1.66(m,8H),1.29–1.21(m,8H),1.17–1.10(m,8H),0.76–0.64(m,8H)。13CNMR(126MHz，氯仿-d)δ13.71,17.59,23.59,26.90,27.81,27.92,29.07,32.66,34.12,40.26,55.13,64.61,64.79,108.85,113.14,119.84,119.95,119.97,120.68,122.66,122.80,125.63, 127.01,127.24,131.79,138.40,140.36,140.82,142.00,150.66,150.83,152.60。
HRMS(ESI)对于C68H71Br4N4O4S4 +，([M+H+])计算值1451.1092，实测值1451.1080。
(4)IREF-PEG600和IREFN-PEG600的合成：
将化合物8(100mg，0.069mmol)溶解在10mL DMF中并加入叠氮化钠(47mg，0.72mmol)。将混合物在70℃加热3h。在冷却至RT之后，加入水以溶解所有的固体。然后，将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到深绿色固体95mg(定量)。
将深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc(10mg)、HO-PEG-炔-0.6k(重均分子量＝ 0.60k，170mg)和TBTA(10mg)。将体系在RT搅拌0.5h。然后用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在15mL水中并将其转移至透析器 (MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干。得到IREF-PEG600(250mg)，为绿色油状物。MALDI-TOF-MS预期的M.W.约 3,700，测得的M.W.3,700。并且通过将HO-PEG-炔-0.6k的量变为85mg，以相同的方法制备IREFN-PEG600，为绿色油状物。MALDI-TOF-MS预期的M.W.约2,800，测得的重均 M.W.约2,800。
IREFN-PEG600在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝793nm，发射峰λem＝1047nm，在808nm的吸收系数K＝2.2L/g.cm，量子产率为2.1％(利用808nm激发)
实施例3：IREFNS的合成
将化合物8(100mg，0.069mmol)溶解在10mL THF和二甲胺(THF中的2.0M，2mL)，然后在50℃搅拌6h。之后，将溶剂在真空中蒸发。将深绿色固体和1,2-氧硫杂环戊烷2,2- 二氧化物122mg(1mmol)溶解在5mL THF中，然后将溶液搅拌过夜。之后，将溶液过滤，用丙酮和乙酸乙酯洗涤多次。得到IREFNS(110mg)，为绿色固体。
HRMS(ESI)对于C88H120N8O16S8，([M+H+])计算值1800.6588，实测值1800.6545。
IREFNS在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝795nm，发射峰λem＝1047nm，在808nm 的吸收系数K＝6.2L/g.cm，量子产率为0.46％(利用808nm激发)
实施例4：IRTTBN-PEG1000的合成
(1)3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩(化合物9)的合成：
将具有冷凝器和磁力搅拌棒的干燥250mL两颈圆底烧瓶中装入叔丁醇钾(10.5g，94 mmol)并加入碘化亚铜(2.34g，12mmol)。接下来，加入10mL吡啶和100mL甲苯混合物溶液并搅拌直至溶解，并且加入15mL三甘醇单甲醚。然后允许反应混合物在室温搅拌30 min。然后一次性加入3-溴噻吩(5.8mL，62mmol)并将反应混合物加热至110℃持续24h。在冷却至室温之后，将反应混合物离心并在真空下浓缩。加入50mL二氯甲烷并用5M HCl(水溶液)洗涤。水层用DCM萃取，并且合并的有机部分用MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗物料经由柱色谱纯化，用在己烷中的1:1乙醚(v/v)洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(10.35g，68％收率)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.18(dd,J＝5.3,3.1Hz,1H),6.79(dd,J＝5.3,1.5Hz,1H), 6.28(dd,J＝3.1,1.5Hz,1H),4.17–4.10(m,2H),3.89–3.83(m,2H),3.77–3.72(m,2H),3.72 –3.64(m,4H),3.57(dd,J＝5.7,3.6Hz,2H),3.40(s,3H)。
(2)2-溴-3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩(化合物10)的合成：
在0℃，将化合物9(2.46g，10mmol)溶解在15mL DMF中，并分批加入NBS(1.78g，10mmol)。在RT 18h之后，加入如所需那么多的水以溶解所有的固体。然后，将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用Na2SO3(水溶液)洗涤三次并用MgSO4干燥，并且在未经进一步纯化下在真空中蒸发，并得到化合物10，为带黄色的油状物(3.0g，92％收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.18(d,J＝6.0Hz,1H),6.77(d,J＝5.9Hz,1H),4.28–4.13(m,2H),3.86–3.79(m,2H),3.76–3.70(m,2H),3.70–3.63(m,4H),3.55(dd,J＝5.6,3.6Hz,2H),3.38(s,3H)。
(3)三异丙基(3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩-2-基)硅烷(化合物11)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物10(3.25g，10mmol)在20mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，6.25mL，20mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三异丙基甲硅烷基氯(1.9g，12mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌12h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。粗物料经由柱色谱纯化，用在己烷中的2:1乙酸乙酯(v/v)洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(3.53g，88％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.46(d,J＝5.0Hz,1H),6.95(d,J＝5.0Hz,1H),4.16–4.10(m,2H),3.79(t,J＝5.2Hz,2H),3.71–3.66(m,6H),3.59–3.55(m,2H),3.40(s,3H),1.49–1.35(m,2H),1.10(d,J＝7.5Hz,19H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ163.62,129.85,116.51,108.99,71.95,70.72,70.67,70.06,69.96,59.07,18.78,12.03。
HRMS(ESI)对于C20H39O4SSi+，([M+H+])计算值402.2294，实测值403.2333。
(4)三异丙基(3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-5-(三丁基甲锡烷基)噻吩-2-基)硅烷(化合物12)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物11(402mg，1.0mmol)在5mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，0.625mL，1.2mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h之后，将三正丁基氯化锡(390mg，1.2mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
(5)(5'-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-[2,2'-联噻吩]-5-基)三异丙基硅烷(化合物13)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物2-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-5-溴噻吩(1.19g，2.0 mmol)、化合物12(1.66g，2.4mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122 mol)。将混合物在110℃搅拌18h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物13，为浅黄色油状物(1.18g，54％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝3.9Hz,1H),7.19(dd,J＝6.1,4.5Hz,2H),7.05(s, 1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),4.04(t,J＝6.3Hz,4H),3.82(t,J＝5.1Hz,2H),3.76–3.63(m, 8H),3.58(dd,J＝5.7,3.6Hz,2H),3.46–3.34(m,7H),1.92–1.80(m,8H),1.68(s,3H),1.55– 1.47(m,8H),1.14(d,J＝7.4Hz,18H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.19,157.12,141.65, 136.97,133.40,129.67,128.50,122.15,112.88,112.48,108.23,105.46,71.97,70.75,70.73,70.62, 70.04,68.94,59.04,33.80,32.54,29.03,27.84,25.42,18.83,12.11。
HRMS(ESI)对于C42H67O6Br81BrS2Si，([M+H+])计算值919.24891，实测值919.24902。
(6)5'-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2,2'-联噻吩 (化合物14)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物13(918mg，1mmol)在4mL THF中的溶液中，加入四丁基氟化铵(THF中的1.0M，4mL，4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h 之后，将反应慢慢地温热至室温并搅拌4h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。粗物料经由快速柱色谱纯化，用己烷至乙酸乙酯洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(722mg，95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝3.9Hz,1H),7.30(d,J＝3.9Hz,1H),7.19(t,J＝ 8.3Hz,1H),7.05(d,J＝5.5Hz,1H),6.91(d,J＝5.5Hz,1H),6.63(d,J＝8.4Hz,2H),4.02(t,J ＝6.3Hz,4H),3.93–3.84(m,2H),3.75(dd,J＝5.8,3.5Hz,2H),3.71–3.60(m,4H),3.54(dd,J ＝5.7,3.6Hz,2H),3.44–3.34(m,7H),1.90–1.78(m,8H),1.56–1.44(m,8H)。13CNMR(101 MHz,CDCl3)δ157.15,151.93,134.56,132.35,129.03,128.23,122.23,121.03,117.11,113.30, 105.56,71.93,71.17,70.91,70.68,70.57,70.06,68.94,59.01,33.88,32.70,29.04,27.86,25.41。
HRMS(ESI)对于C33H47O6Br81BrS2，([M+H+])计算值763.1155，实测值763.1154。
(7)4,8-(二-2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2,2'-联噻吩e)-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5]噻二唑)(化合物15)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物14(1.52g，2mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1.5mL，2.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(2mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5] 噻二唑)(化合物a，234mg，0.67mmol)在15mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(150mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA3:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物15，为深绿色固体(505mg，43％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(dd,J＝8.6,4.4Hz,2H),7.33(dd,J＝3.7,1.4Hz,2H), 7.23(dd,J＝15.5,4.8Hz,4H),6.70–6.59(m,4H),4.41(d,J＝4.2Hz,4H),4.07(t,J＝6.2Hz, 8H),3.72(t,J＝5.0Hz,4H),3.63–3.47(m,16H),3.42(t,J＝6.7Hz,8H),3.36(s,6H),1.97– 1.83(m,16H),1.60–1.45(m,16H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.25,152.93,150.90,149.60,140.11,138.00,135.70, 129.38,124.74,123.08,122.44,120.18,118.16,109.81,102.14,73.68,70.37(d,J＝1.6Hz), 69.96,69.54,69.25,57.85,33.30,31.58,30.68,28.80,26.58。
HRMS(ESI)对于C72H91Br4N4O12S6 +，([M+H+])计算值1716.1639，实测值1716.1618。
(8)IRTTBN-PEG1000的合成：
将化合物15(100mg，0.058mmol)和叠氮化钠(47mg，0.72mmol)溶解在10mL DMF中并在70℃加热3h。加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体97mg。
将深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc(10mg)、w-炔基-PEG-羟基(Mw＝1000，116mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌1.0h。然后将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶剂在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，粗产物通过用DCM/MeOH 10:1洗脱的薄层色谱纯化。得到IRTTBN-PEG1000(142mg)，为绿色油状物。
IRTTBN-PEG1000在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝830nm，发射峰λem＝1098nm，在808nm的吸收系数K＝1.22L/g.cm，量子产率为0.93％(利用808nm激发)
实施例5：IRTBBN-PEG1000的合成：
(1)(5-(2',6'-二((6-溴己基)氧基)-[1,1'-联苯]-4-基)-3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基) 噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物16)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物4'-溴-2,6-二((6-溴己基)氧基)-1,1'-联苯(1.18g，2.0mmol)、化合物12(1.66g，2.4mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122mol)。将混合物在110℃搅拌18h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物16，为浅黄色油状物(1.04g，57％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.62(d,J＝8.2Hz,2H),7.37(d,J＝8.2Hz,2H),7.27–7.20(m,2H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),4.22(t,J＝5.1Hz,2H),3.91(t,J＝6.2Hz,4H),3.76–3.65(m, 8H),3.59–3.55(m,4H),3.40(s,3H),3.33(t,J＝6.8Hz,4H),1.86–1.73(m,4H),1.68–1.60 (m,4H),1.49–1.41(m,3H),1.41–1.30(m,8H),1.14(d,J＝7.1Hz,18H)。13C NMR(126MHz, CDCl3)δ163.63,157.17,148.10,133.74,132.47,131.61,128.65,123.99,119.99,112.47,108.72, 105.72,71.97,70.64,70.06,68.52,59.07,33.83,32.69,28.94,27.68,25.19,18.86,17.99,12.12。
HRMS(ESI)对于C44H69O6Br81BrSSi，([M+H+])计算值913.29249，实测值913.29279。
(2)2-(2',6'-二((6-溴己基)氧基)-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基) 噻吩(化合物17)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物16(912mg，1mmol)在4mL THF中的溶液中，加入四丁基氟化铵(THF中的1.0M，4mL，4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h 之后，将反应慢慢地温热至室温并搅拌3h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。粗物料经由快速柱色谱纯化，用己烷至乙酸乙酯洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(695mg，92％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70–7.51(m,2H),7.42–7.32(m,2H),7.27–7.22(m,1H),7.09(d,J＝1.6Hz,1H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),6.24(d,J＝1.6Hz,1H),4.21–4.16(m,2H),3.95–3.90(m,4H),3.80–3.76(m,2H),3.75–3.68(m,4H),3.61–3.56(m,2H),3.41(s,3H),3.35(t,J＝6.8Hz,4H),1.83–1.76(m,4H),1.69–1.61(m,4H),1.41–1.30(m,8H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ157.32,157.15,143.05,133.94,132.29,131.02,128.70,124.09,119.85, 115.32,105.66,96.84,71.96,70.84,70.84,70.66,69.72,69.16,68.51,59.09,33.89,32.66,28.90, 27.67,25.17,18.86,12.12。
HRMS(ESI)对于C35H49O6Br81BrS，([M+H+])计算值757.15906，实测值757.15814
(3)4,8-(二-2-(2',6'-二((6-溴己基)氧基)-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基) 乙氧基)噻吩)-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5]噻二唑)(化合物18)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物17(1.51g，2mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1.5mL，2.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(2mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5] 噻二唑)(化合物a，234mg，0.67mmol)在15mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(150mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA3:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物18，为深绿色固体(433mg，38％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝7.7Hz,4H),7.53–7.39(m,6H),7.32–7.17(m,2H),6.67(d,J＝8.3Hz,4H),4.51–4.42(m,4H),3.95(t,J＝5.7Hz,8H),3.74(t,J＝4.8Hz,4H),3.67–3.47(m,16H),3.45–3.27(m,16H),1.78–1.63(m,16H),1.48–1.33(m,16H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.98,152.93,152.27,150.90,144.66,134.00,133.34, 132.53,130.26,127.74,125.41,124.74,119.65,105.93,103.87,73.68,70.37(d,J＝1.6Hz), 69.96,69.54,69.25,57.85,33.30,31.58,30.68,28.80,26.58.HRMS(ESI)对于C76H95Br4N4O12S4 ([M+H+])计算值1704.4600，实测值1704.4611。
(4)IRTBBN-PEG1000的合成：
将化合物18(100mg，0.058mmol)溶解在10mL DMF并在70℃加热3h。加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体97mg。
将深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc 10mg，w-炔基-PEG-羟基(Mw＝1000，117 mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌1.0h。将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，粗产物通过用DCM/MeOH 10:1洗脱的薄层色谱纯化。得到IRTBBN-PEG1000(160mg)，为绿色油状物。
IRTBBN-PEG1000在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝730nm，发射峰λem＝1047nm，在808nm的吸收系数K＝1.19L/g.cm。
实施例6：IRTFN-PEG600的合成
(1)(5-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩-2-基) 三异丙基硅烷(化合物19)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物2-溴-9,9-二(6-溴己基)-9H-芴(1.14g，2.0mmol)、化合物 12(1.66g，2.4mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122mol)。将混合物在110℃搅拌24h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物19，为浅黄色油状物(856mg，48％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(dd,J＝10.3,7.4Hz,2H),7.62(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H), 7.54(d,J＝1.3Hz,1H),7.35(tt,J＝6.6,3.6Hz,3H),7.27(s,1H),4.25(t,J＝5.3Hz,2H),3.85(t, J＝5.2Hz,2H),3.77–3.65(m,6H),3.59(dd,J＝5.6,3.7Hz,2H),3.41(s,3H),3.29(t,J＝6.8 Hz,4H),2.06–2.00(m,4H),1.71–1.63(m,4H),1.47(dt,J＝14.8,7.5Hz,3H),1.25–1.05(m, 26H),0.61–0.68(m,4H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ163.66,151.09,150.48,148.34,140.79, 140.70,133.38,127.23,126.99,124.29,122.77,119.11,112.59,109.05,71.97,70.77,70.64,70.07, 70.01,59.09,55.10,40.30,34.02,32.65,29.04,27.78,23.50,18.87,12.14。
HRMS(ESI)对于C45H69Br2O4SSi，([M+H+])计算值893.2987，实测值893.3026。
(2)2-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩(化合物20)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物19(893mg，1mmol)在4mL THF中的溶液中，加入四丁基氟化铵(THF中的1.0M，4mL，4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h 之后，将反应慢慢地温热至室温并搅拌3h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。粗物料经由快速柱色谱纯化，用己烷至乙酸乙酯洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(691mg，94％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(t,J＝7.4Hz,2H),7.56(d,J＝8.0Hz,1H),7.51(s,1H), 7.35(d,J＝7.1Hz,3H),7.11(s,1H),6.26(d,J＝1.3Hz,1H),4.24–4.17(m,2H),3.93–3.86(m, 2H),3.78(dd,J＝5.8,3.5Hz,2H),3.71(ddd,J＝9.3,5.0,2.9Hz,4H),3.59(dd,J＝5.6,3.7Hz, 2H),3.41(s,3H),3.29(t,J＝6.8Hz,4H),2.00(t,J＝8.2Hz,4H),1.73–1.61(m,4H),1.23–1.05 (m,8H),0.76–0.57(m,4H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ157.54,151.08,150.54,143.31, 140.96,140.58,133.17,127.29,127.00,124.41,122.79,120.10,119.83,119.51,115.53,96.88, 71.96,70.84,70.70,70.61,69.71,69.42,59.09,55.03,40.23,33.99,32.64,29.05,27.76,23.53。
HRMS(ESI)对于C36H48Br2O4S，([M+H+])计算值737.1653，实测值737.1692。
(3)4,8-(二-5-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩)-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5]噻二唑)(化合物21)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物20(1.47g，2mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1.5mL，2.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(2mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5] 噻二唑)(化合物a，234mg，0.67mmol)在15mL甲苯中的溶液中，然后加入Pd(PPh3)2Cl2 150 mg。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入到水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用DCM/EA 5:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物21，为深绿色固体(565mg，52％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.75(m,6H),7.67(s,2H),7.49(s,2H),7.38(m,6H),4.49(t, J＝5.1Hz,4H),3.76(t,J＝5.1Hz,4H),3.66–3.56(m,12H),3.54(dd,J＝5.8,3.5Hz,4H),3.38 (s,6H),3.31(t,J＝6.8Hz,8H),2.07(t,J＝8.1Hz,8H),1.69(dd,J＝14.6,7.0Hz,8H),1.28– 1.20(m,8H),1.16–1.09(m,8H),0.75–0.63(m,8H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ156.62, 152.79,151.23,150.60,146.70,141.55,140.56,133.06,127.49,127.08,124.60,122.82,120.24, 119.94,119.66,113.98,113.77,71.91,71.15,70.72,70.60,70.55,70.06,59.05,55.18,40.33, 34.03,32.65,29.06,27.81,23.56。
HRMS(ESI)对于C78H94O8N4Br4NaS4 +，([M+Na+])计算值1681.2537，实测值1681.2580。
(4)IRTFN-PEG600的合成：
将化合物21(100mg，0.06mmol)和叠氮化钠(47mg，0.72mmol)溶解在10mL DMF中并在70℃加热3h。然后加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体(96mg)。将深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc 10mg，w-炔基-PEG-羟基 (Mw＝600，72mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌0.5h。然后将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，粗产物通过薄层色谱纯化，用 DCM/MeOH 10:1洗脱。得到IRTFN-PEG600(130mg)，为绿色油状物。
IRTFN-PEG600在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝750nm，发射峰λem＝1047nm，在808nm的吸收系数K＝2.85L/g.cm，量子产率为2.49％(利用808nm激发)
实施例7：IRDTNS的合成
(1)4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩(化合物23)的合成
在10℃，将4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩(2.0g，11.23mmol)和1,6-二溴己烷(13.27 g，55mmol)溶解在30mL DMSO中。然后以多份加入KOH(1.8g，33mmol)。在搅拌24h 之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物23，为浅黄色油状物(4.8g，86％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,2H),δ6.90(d,2H),3.52–3.41(t,4H),1.80–1.68(m,4H),1.43(d,J＝4.0Hz,4H),1.33–1.23(m,4H),1.15(m,4H),0.89–0.85(m,4H)。
(2)化合物(24)的合成。
在-78℃在Ar气氛下，向化合物23(2.0g，4.0mmol)在25mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，2.5mL，4.0mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h之后，将三正丁基氯化锡(1.5g，4.4mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌 8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在Ar气氛下，向上述粗产物(320mg，0.4mmol)和a的化合物(50mg，0.13mmol)在5mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(10mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱并得到化合物24，为深褐色固体(88mg，58％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35(d,J＝4.8Hz,2H),7.04(d,J＝4.8Hz,2H),3.33(t,J＝ 6.8Hz,9H),2.05(td,J＝10.4,5.0Hz,9H),1.83–1.69(m,10H),1.40(d,J＝7.4Hz,7H),1.17– 1.04(m,8H),0.95(t,J＝7.3Hz,10H)。
(3)化合物IRDTNS的合成
将化合物24(50mg，0.042mmol)溶解在10mL THF和二甲胺(THF中的2.0M，5mL) 中，然后在50℃搅拌6h。之后，将溶液在真空中蒸发。将该深褐色固体和1,2-氧硫杂环戊烷2,2-二氧化物122mg(1mmol)溶解在5mL THF中，然后将溶液搅拌过夜。将溶液过滤，用丙酮和乙酸乙酯洗涤多次。得到IRDTNS(40mg)，为深褐色固体。
HRMS(ESI)对于C68H103N8O12S10，([M+H+])计算值1543.4903，实测值1543.4908。
IRDTNS在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝930nm，发射峰λem＝1127nm，在980nm 的吸收系数K＝10.2L/g.cm。
实施例8：IRDT-PEG1000和IRDTN-PEG1000的合成
将化合物24(50mg，0.042mmol)溶解在10mL DMF和叠氮化钠(47mg，0.72mmol)中并在70℃加热3h。然后加入大量的水以溶解所有的固体。混合物用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到深褐色固体95mg(定量)。
将该深褐色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc(10mg)、w-炔基-PEG-羟基(Mw＝1000，170mg)和TBTA(10mg)。将体系在RT搅拌0.5h。然后将反应用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在15mL水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干。得到IRDT-PEG1000(250mg)，为绿色油状物。MALDI-TOF-MS预期的 M.W.约5,208，测得的M.W.5,210。并且利用相同方法，但将w-炔基-PEG-羟基的量改变为 85mg，得到IRDTN-PEG1000，为绿色油状物。MALDI-TOF-MS预期的M.W.约3,198，测得的重均M.W.约3,200。
IRDTN-PEG1000在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝930nm，发射峰λem＝1127nm，在808nm的吸收系数K＝1.4L/g.cm。
实施例9：IRTSBN-PEG1000的合成
(1)(5-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)硒吩-2-基)-3-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物26)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物2-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-5-溴硒吩(1.28g，2.0mmol) 和化合物12(1.66g，2.4mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122mol)。将混合物在110℃搅拌18h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物26，为浅黄色油状物(1.18g，54％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝3.9Hz,1H),7.19(dd,J＝6.1,4.5Hz,2H),7.05(s, 1H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),4.04(t,J＝6.3Hz,4H),3.82(t,J＝5.1Hz,2H),3.76–3.63(m, 8H),3.58(dd,J＝5.7,3.6Hz,2H),3.46–3.34(m,7H),1.92–1.80(m,8H),1.68(s,3H),1.55– 1.47(m,8H),1.14(d,J＝7.4Hz,18H)。
(2)2-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)硒吩-2-基)-4-(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基) 噻吩(化合物27)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物26(1.0g，1mmol)在4mL THF中的溶液中，加入四丁基氟化铵(THF中的1.0M，8mL，8mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h之后，将反应慢慢地温热至室温并搅拌4h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。粗物料经由快速柱色谱纯化，用己烷至乙酸乙酯洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(722mg，95％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝3.9Hz,1H),7.30(d,J＝3.9Hz,1H),7.19(t,J＝ 8.3Hz,1H),7.05(d,J＝5.5Hz,1H),6.91(d,J＝5.5Hz,1H),6.63(d,J＝8.4Hz,2H),4.02(t,J ＝6.3Hz,4H),3.93–3.84(m,2H),3.75(dd,J＝5.8,3.5Hz,2H),3.71–3.60(m,4H),3.54(dd,J ＝5.7,3.6Hz,2H),3.44–3.34(m,7H),1.90–1.78(m,8H),1.56–1.44(m,8H)。
(3)化合物28的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物27(400mg，0.5mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1mL，1.6mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(0.25mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二 ([1,2,5]噻二唑)(化合物a，32mg，0.08mmol)在5mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(15 mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次。有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物28，为深绿色固体(86mg，61％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(dd,J＝8.6,4.4Hz,2H),7.33(dd,J＝3.7,1.4Hz,2H), 7.23(dd,J＝15.5,4.8Hz,4H),6.70–6.59(m,4H),4.41(d,J＝4.2Hz,4H),4.07(t,J＝6.2Hz, 8H),3.72(t,J＝5.0Hz,4H),3.63–3.47(m,16H),3.42(t,J＝6.7Hz,8H),3.36(s,6H),1.97– 1.83(m,16H),1.60–1.45(m,16H)。
(4)IRTTBN-PEG1000的合成：
将化合物28(100mg，0.058mmol)溶解在10mL DMF和叠氮化钠(47mg，0.72mmol) 中并在70℃加热3h。加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，并且合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体97mg。将该深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc 10mg，w-炔基-PEG- 羟基(Mw＝1000，52mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌1.0h。然后将反应用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在15mL水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干。得到IRTSBN-PEG1000(140mg)，为绿色油状物。
IRTSBN-PEG1000在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝800nm，在808nm的吸收系数 K＝0.85L/g.cm。
实施例10：IRESBN-PEG1000的合成
(1)5-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)硒吩-2-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯(化合物29)的合成：
在Ar气氛下，向三丁基(2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)锡烷(860mg，2.0 mmol)和化合物25(720mg，1.1mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(71mg， 0.061mol)。将混合物在110℃搅拌24h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物29，为浅黄色油状物(468mg，60％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.45(d,J＝3.9Hz,1H),7.24(d,J＝3.9Hz,1H),7.17(t,J＝ 8.3Hz,1H),6.61(d,J＝8.4Hz,2H),6.21(s,1H),4.37–4.32(m,2H),4.28–4.23(m,2H),4.01 (t,J＝6.2Hz,4H),3.38(t,J＝6.9Hz,4H),1.84(m,7.2Hz,8H),1.52–1.43(m,8H)；
(2)(7-(5-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)硒吩-2-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)三丁基锡烷(化合物30)的合成：
在-78℃在Ar气氛下，向化合物29(350mg，0.53mmol)在5mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1mL，1.6mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h 之后，将三正丁基氯化锡(330mg，1mmol)加入至溶液。然后，将反应混合物慢慢温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
(3)化合物31的合成：
在Ar气氛下，向化合物a(72mg，0.2mmol)和化合物30(500mg，0.47mmol)在5mL 甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(35mg，0.03mol)。将混合物在110℃搅拌48h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物31，为深绿色固体(93mg，31％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝4.0Hz,2H),7.42(d,J＝4.0Hz,2H),7.19(t,J＝ 8.3Hz,2H),6.63(d,J＝8.4Hz,4H),4.51(m,4H),4.37(m,4H),4.04(t,J＝6.3Hz,8H),3.40(t, J＝6.8Hz,8H),1.87(m,16H),1.55–1.43(m,16H)；
(4)RESBN-1700的合成。将化合物31(50mg，0.036mmol)溶解在5mL DMF中。然后，加入叠氮化钠(47mg，0.72mmol)并将反应溶液在60℃搅拌20h。之后，加入一大份水，并将产物用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到叠氮化物产物，为深绿色固体43mg(定量)。
将该叠氮化物产物(20mg)溶解在5mL THF中并加入碘化亚铜(100mg)、α-炔基-ω-羟基-聚(乙二醇)(Mw＝1.68k，120mg)和三乙胺200μL。将体系在RT搅拌48h。然后，将反应混合物用Al2O3过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在 15mL水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干，得到IRETBN-1700(100mg)，为黄色粉末。
实施例11：IREDTN-PEG1700的合成
(1)(4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物32) 的合成。
在-78℃在Ar气氛下，将4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩(化合物 23)(3.0g，6.0mmol)溶解在40mL干燥THF中。逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，4mL， 6.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h之后，将TIPSCl(1.5g，7.0mmol)加入至溶液。然后，将反应混合物慢慢温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53(d,1H),δ6.90(d,2H),3.52–3.41(t,4H),1.92–1.80(m,8H),1.68(s,3H),1.55–1.47(m,8H),1.14(d,J＝7.4Hz,18H)。
(2)(6-溴-4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物33)的合成。
在-78℃在Ar气氛下，将(4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物32)(2.1g，3.18mmol)溶解在40mL干燥THF中。然后逐滴加入n-BuLi (己烷中的1.6M，3mL，4.8mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外的1.5h之后，将CBr4(1.68 g，4.77mmol)加入至溶液。然后，将反应混合物慢慢温热至室温并搅拌过夜。将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物33，为浅红色油状物(1.88g，80％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.90(d,2H),3.52–3.41(t,4H),1.92–1.80(m,8H),1.68(s, 3H),1.55–1.47(m,8H),1.14(d,J＝7.4Hz,18H)。
(3)(4,4-二(6-溴己基)-6-(2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)-4H-环戊二烯并 [2,1-b:3,4-b']二噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物34)的合成
在Ar气氛下，向三丁基(2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧杂环己烯-5-基)锡烷(860mg，2.0 mmol)和(6-溴-4,4-二(6-溴己基)-4H-环戊二烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩-2-基)三异丙基硅烷(化合物33)(1.15g，1.6mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(71mg，0.061mol)。将混合物在110℃搅拌24h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物34，为红色油状物(868mg，68％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.90(d,2H),4.28(s,2H),4.25(s,2H),3.52–3.41(t,4H),1.92–1.80(m,8H),1.68(s,3H),1.55–1.47(m,8H),1.14(d,J＝7.4Hz,18H)。
(4)化合物35的合成。
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物34(400mg，0.5mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1mL，1.6mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外1.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(0.25mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二 ([1,2,5]噻二唑)(化合物a)(32mg，0.08mmol)在5mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(15 mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到化合物35，为褐色固体(75mg，61％)。
(5)IREDTN-PEG1700的合成。
将化合物35(50mg，0.028mmol)溶解在5mL DMF中。然后，加入叠氮化钠(47mg，0.72mmol)并将反应溶液在60℃搅拌20h。之后，加入一大份水，并将产物用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到叠氮化物产物，为深绿色固体43mg(定量)。
将该叠氮化物产物20mg溶解在5mL THF中并加入碘化亚铜100mg，α-炔基-ω-羟基- 聚(乙二醇)(Mw＝1.7k，76mg)和三乙胺200μL。将体系在RT搅拌48h。然后，将反应混合物用Al2O3过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，将固体溶解在15mL 水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干。得到IRETBN-1700(100mg)，为褐色粉末。
IRDTNS在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝982nm，在980nm的吸收系数K＝1.3L/g.cm。
实施例12：IRETBNS的合成
IRETBNS的合成：将化合物4(50mg，0.036mmol)溶解在5mL DMF中。然后，加入叠氮化钠(47mg，0.72mmol)并将反应溶液在60C搅拌20h。之后，加入一大份水，并将产物用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的柱色谱，得到叠氮化物产物，为深绿色固体43mg(定量)。
将该叠氮化物产物20mg溶解在5mL DMSO中并加入碘化亚铜100mg，丙-2-炔-1-磺酸钠15mg和三乙胺200μL。将体系在RT搅拌48h。然后将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶液溶解在15mL水中并将其转移至透析器(MWCO＝3500)。将体系在RT搅拌72h，其中进行10次水交换。将所得的在透析膜中的水溶液冻干，得到IRETBNS(23mg)，为绿色粉末。
1H NMR(500MHz,D2O)δ8.53(s,4H),7.54–7.46(m,4H),7.34(d,J＝7.5Hz,2H),6.80(d,J＝7.5Hz,4H),4.60–4.42(m,8H),4.28(s,8H),4.22–4.04(m,17H),2.12–1.86(m,8H),1.90–1.76(m,8H),1.54–1.37(m,8H),1.39–1.27(m,8H)。
13C NMR(125MHz,D2O)δ159.25,153.19,151.34,150.73,147.66,142.77,140.11,137.54, 129.38,126.07,125.39,123.90,123.08,120.49,118.16,109.81,101.64,70.37,66.98,51.79, 42.08,28.80,27.64,27.05,26.58。
HRMS(ESI)对于C74H78O20N16Na2S10 2+，([M+2H+])938.12960，实测值938.1335。
IRETBNS在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝913nm，发射峰λem＝1149nm，在808nm 的吸收系数K＝3.23L/g.cm，量子产率为0.14％(利用808nm激发)。
实施例13：IRTTEBN-PEG600的合成
(1)3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩(化合物36)的合成：
将具有冷凝器和磁力搅拌棒的干燥250mL两颈圆底烧瓶中装入叔丁醇钾(10.5g，94 mmol)并加入碘化亚铜(2.34g，12mmol)。接下来，加入10mL吡啶和100mL甲苯混合物溶液并将混合物搅拌直至溶解，然后加入15mL三甘醇单甲醚。允许反应混合物在室温搅拌30min。然后一次性加入3,4-二溴噻吩(7.4g，31mmol)并将反应混合物加热至115℃持续24h。在冷却至室温之后，将反应混合物离心并在真空下浓缩。加入100mL二氯甲烷并用5 MHCl(水溶液)洗涤。水层用DCM萃取，并且合并的有机部分用MgSO4干燥并在减压下浓缩。粗物料经由柱色谱纯化，用在己烷中的1:1乙醚(v/v)洗脱。分离所需产物，为带黄色的油状物(8.04g，61％收率)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.25(s,2H),4.19–4.10(m,4H),3.97–3.80(m,4H),3.78–3.60(m,12H),3.61–3.49(m,4H),3.39(s,6H)。
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ147.10,97.87,71.94,70.80,70.66,70.56,58.36。
HRMS(ESI)对于C18H32O8S+，([M+H+])409.1854，实测值409.1817。
(2)(3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩-2-基)三丁基锡烷(化合物37)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物36(408mg，1.0mmol)在5mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，0.625mL，1.2mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0 h之后，将三正丁基氯化锡(390mg，1.2mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
(3)5'-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2,2'-联噻吩(化合物38)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物2-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-5-溴噻吩(1.19g，2.0 mmol)、化合物37(1.53g，2.2mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122 mol)。将混合物在110℃搅拌18h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，并且有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物38，为浅黄色油状物(0.89g，48％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.61–7.38(m,2H),7.34(d,J＝15.0Hz,1H),6.80(d,J＝15.0Hz,2H),6.61(s,1H),4.45–4.22(m,4H),4.22–4.05(m,4H),3.87–3.68(m,4H),3.63–3.45(m,20H),3.40(s,6H),2.01–1.70(m,8H),1.62–1.19(m,8H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.25,147.48(d,J＝18.6Hz),140.11,137.21,133.39, 129.38,124.96,123.08,118.16,109.81,95.52,73.68,70.37(d,J＝1.6Hz),69.96,69.54,68.97, 67.92,57.85,33.30,31.58,30.68,28.80,26.58。
HRMS(ESI)对于C40H61O10Br2S2，([M+H+])计算值923.20598，实测值923.20674。
(4)4,8-(5'-(2,6-二((6-溴己基)氧基)苯基)-3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2,2'-联噻吩)-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5]噻二唑)(化合物39)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物38(1.844g，2mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1.5mL，2.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(2mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5] 噻二唑)(化合物a)(234mg，0.67mmol)在15mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(150 mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA 2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物39，为深绿色固体(772mg，38％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.55–7.40(m,4H),7.34(d,J＝7.5Hz,2H),6.80(d,J＝7.5Hz,4H),4.31(t,J＝7.0Hz,8H),4.11(t,J＝7.4Hz,8H),3.77(t,J＝7.1Hz,8H),3.64–3.48(m, 40H),3.40(s,12H),1.97–1.62(m,16H),1.58–1.37(m,8H),1.38–1.26(m,8H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.25,157.63,153.23(d,J＝10.1Hz),151.34,140.11,137.54,129.38,127.88,126.07,123.90,123.08,118.16,109.81,104.50,73.68,70.37(d,J＝1.6 Hz),69.96,69.54,68.97,57.85,33.30,31.58,30.68,28.80,26.58。
HRMS(ESI)对于C86H119Br4N4O20S6，([M+H+])计算值2039.3356，实测值2039.3389。
(5)IRTTEBN-PEG600的合成：
将化合物39(118mg，0.058mmol)和叠氮化钠(47mg，0.72mmol)溶解在10mL DMF中并在70℃加热3h。然后加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，并且合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体114mg。将该深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc 10mg，w-炔基-PEG- 羟基(Mw＝600，70mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌1.0h。将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，粗产物通过用DCM/MeOH 10:1洗脱的薄层色谱纯化。得到IRTTEBN-PEG600(118mg)，为绿色油状物。
IRTTEBN-PEG600在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝710nm，在808nm的吸收系数 K＝1.22L/g.cm。
实施例14：IRTEFN-PEG600的合成
(1)2-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基)噻吩 (化合物40)的合成：
在保护气体气氛下，向化合物2-溴-9,9-二(6-溴己基)-9H-芴(1.14g，2.0mmol)、化合物 37(1.53g，2.2mmol)在10mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)4(142mg，0.122mol)。将混合物在110℃搅拌24h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过利用PE/EA2:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物40，为浅黄色油状物(790mg，44％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.20–8.00(m,1H),7.90(dd,J＝14.8,3.1Hz,1H),7.85–7.75(m,2H),7.48–7.03(m,3H),6.29(s,1H),4.31(t,J＝13.9Hz,4H),3.77(t,J＝13.9Hz,4H), 3.62–3.45(m,20H),3.40(s,6H),2.06–1.65(m,8H),1.47–1.11(m,12H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ150.16,149.92,149.70,148.88,141.93,137.29,131.31, 129.29,125.80,123.74(d,J＝7.8Hz),120.15(d,J＝13.1Hz),118.44,114.51,96.83,73.68, 70.38,69.96,69.54,68.97,67.92,57.85,52.54,40.16,33.30,31.58,30.68,29.54,25.54。
HRMS(ESI)对于C43H63O8Br2S，([M+H+])计算值897.26049，实测值897.25927。
(2)4,8-(二-2-(9,9-二(6-溴己基)-9H-芴-2-基)-3,4-二(2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙氧基) 噻吩)-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5]噻二唑)(化合物41)的合成：
在-78℃在保护气体气氛下，向化合物40(1.79g，2mmol)在15mL THF中的溶液中，逐滴加入n-BuLi(己烷中的1.6M，1.5mL，2.4mmol)。在将混合物在此温度搅拌另外2.0h 之后，将三正丁基氯化锡(0.812mg，2.5mmol)加入至溶液。然后将反应慢慢地温热至室温并搅拌8h。之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在没有进一步纯化下在真空中蒸发。
在保护气体气氛下，向上述粗产物(2mmol)和4,8-二溴-1H,5H-苯并[1,2-c:4,5-c']二([1,2,5] 噻二唑)(化合物a)(234mg，0.67mmol)在15mL甲苯中的溶液中，加入Pd(PPh3)2Cl2(150 mg)。将混合物在110℃搅拌12h。在冷却至室温之后，将混合物倒入水中并用乙酸乙酯萃取两次，有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过用DCM/EA 3:1的硅胶上的柱色谱，得到化合物41，为深绿色固体(674mg，34％)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(d,J＝7.5Hz,2H),8.00(d,J＝1.4Hz,2H),7.90(dd,J＝7.4,1.5Hz,2H),7.78(dd,J＝7.5,1.4Hz,2H),7.48(dd,J＝7.4,1.5Hz,2H),7.34(td,J＝7.5, 1.5Hz,2H),7.24(td,J＝7.5,1.5Hz,2H),4.31(t,J＝6.9Hz,8H),3.77(t,J＝7.0Hz,8H),3.60– 3.44(m,40H),3.40(s,12H),2.02–1.72(m,16H),1.44–1.01(m,24H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.92,153.19,151.88,151.34,150.46,150.16,142.59, 137.29,129.54,129.29,126.07,125.80,124.19,123.77,121.16,120.20,119.88,119.32,105.62, 73.68,70.38,69.96,69.54,68.97,57.85,52.98,40.16,33.30,31.58,30.68,29.54,25.54。
HRMS(ESI)对于C92H122Br4N4O16S4 +，([M+Na+])2007.4477，实测值2007.4452。
(3)IRTEFN-PEG600的合成：
将化合物41(120mg，0.06mmol)溶解在10mL DMF和叠氮化钠(47mg，0.72mmol)并在70℃加热3h。然后加入大量的水以溶解所有的固体。然后将其用乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相用MgSO4干燥并在真空中蒸发。将粗产物经过硅胶上的快速柱色谱，得到深绿色固体118mg。将该深绿色固体溶解在5mL THF中并加入CuTc 10mg，w-炔基-PEG-羟基(Mw＝600，72mg)和TBTA(5mg)。将体系在RT搅拌0.5h。将反应混合物用硅藻土过滤，并将溶液在真空中蒸发。当所有有机溶剂被去除时，粗产物通过用DCM/MeOH 10:1洗脱的薄层色谱纯化。得到IRTEFN-PEG600(153mg)，为绿色油状物。
IRTEFN-PEG600在H2O中的光学参数：吸收峰λ＝700nm，在808nm的吸收系数K＝1.35L/g.cm。
实施例15：表征实验
光谱表征：
采用具有背景校正的UV-Vis-NIR光谱仪(UV 3600)来测量在300-1,200nm范围内在水中的光学吸收光谱。使用家庭构建设置来测量在900-1,600nm的区域中的IR-E1的荧光光谱，其中在808-nm二极管激光器(RMPC激光器)激发(160mW)下利用阵列检测器(Princeton OMA-V)和分光计(Acton SP2300i)。在发射测量期间，使用850-nm(Thorlabs)、1,000-nm (Thorlabs)、1,100-nm(Omega)和1,300-nm短通滤波器(Omega)作为激发滤波器并且使用 900-nm长通滤波器(Thorlabs)作为发射滤波器。所获得的发射光谱通过滤波器的检测器灵敏度分布曲线和吸光度特征进一步校正。
IRETBN-PEG1700在水溶液中的吸收和发射光谱在图1， a中示出，在1周内测量的IRETBN-PEG1700在水和PBS中的荧光强度在图1， b中示出。在水溶液中，IRETBN-PEG1700展现出在830nm的吸收峰，而荧光发射光谱显示1000至1400nm的发射范围，其中主发射峰在大约1080nm(图1， a)。IRETBN-PEG1700的重均分子量(MW)为～4.5kDa，其中在水溶液中的流体动力学尺寸为～3.6nm。该分子量和流体动力学尺寸二者都分别低于40kD和5.5 nm的肾排泄截止值。IRETPBN-PEG1700在水和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的荧光强度在1周之后不显示任何衰减，表明优异稳定性(图1， b)。IRETBN-PEG1700显示在PBS和水中的高光稳定性，其中在连续808nm激光下以0.33W/cm2的功率密度持续2小时的条件下具有可忽略衰减。
荧光量子产率的测定
使用商用SWIR荧光IR-26染料作为参照样品，其中量子产率为0.5％。将IR-26溶解在 1,2-二氯乙烷(DCE)中，并稀释至不同浓度，其中使用紫外-可见-近红外吸光度光谱仪在808 nm的吸光度值为～0.067、～0.029、～0.014和～0.002。在808-nm二极管激光器(RMPC激光器) 激发下，收集在900-至1,600-nm范围内的荧光光谱(900-nm长通滤波器)。实施例1至6的化合物在水中的吸收和发射利用与IR-26相同的方法测量。然后通过这些滤波器的检测器灵敏度分布曲线和消光分布曲线，对IR-26和所测量荧光团二者的所有发射光谱进行校正，然后在900至1,600nm积分。积分的SWIR荧光强度相对于在808nm的激发波长的吸光度绘图并拟合成线性函数。IR-E1的斜率与染料IR-26截然不同，并且所测量荧光团在SWIR中的量子产率通过以下公式确定。
QY代表量子产率，n是溶剂的折射率，A是溶液的吸光度，并且I是荧光强度。
实施例16：用于脑血管的非侵入性SWIR荧光成像
将IRETBN-PEG1700的PBS溶液(1mg/ml，200μL)注入去毛小鼠用于SWIR成像。使用通过850nm短通滤波器过滤后的808nm激光作为激发(140mW·cm-2)。动态成像利用2DInGaAs照相机(Princeton Instrument 2D-OMA V：320)进行，其中在>1300nm范围内的曝光时间为300ms(通过收集经过1,300-nm长通滤波器的发射)。在对侧半球中的大脑下静脉、横窦和大脑中血管中的SWIR荧光信号在注射后1s内立即显现，并且这些信号快速增加并且在～10s达到平稳(图2)。利用IRETBN-PEG1700荧光团的小鼠脑血管的SWIR成像在图 2中示出。
实施例17：用于肿瘤的SWIR荧光成像
将IREFNS的PBS溶液(0.3mg/ml，350μL)静脉内注入到具有位于左右后肢上的皮下异种移植物4T1鼠类肿瘤的小鼠中。使用经过850nm短通滤波器过滤后的808nm激光作为激发(140mW·cm-2)。动态成像利用2D InGaAs照相机(Princeton Instrument 2D-OMA V：320)进行，其中在>1100nm范围内的曝光时间为300ms(通过收集经过1,100-nm长通滤波器的发射)。4T1肿瘤中的染料荧光在注射后大约10s开始出现并且强度随时间增加，表明染料分子在肿瘤中积累。肿瘤中的染料荧光在12h内稳定并且肿瘤信噪比可以达到超过4(图3)。带有4T1肿瘤的小鼠在注射IREFNS溶液后的SWIR荧光图像在图3中示出。
实施例18：将分子荧光团缀合至生物分子
通过炔官能生物分子(如蛋白质和抗体)和叠氮化物官能化的荧光团之间的点击反应完成缀合，示意图在图4中示出。
对于用于链霉亲和素(SA)缀合的典型反应：将5μL SA(90.9μM)和2.95μL DBCO-PEG4-NHS(3.08mM)依次加入到50μL PBS中。将混合物涡旋一会儿，并且在振荡器中反应或搅拌2小时。在反应之后，产物通过30k滤器洗涤4次，最终体积为100μL。然后，将29.7μLIRETBN-PEG600(152.9μM)加入至100μL SA@DBCO-PEG4(染料的浓度可以调整)。将混合物涡旋一会儿，并在搅拌下反应6小时。为了纯化缀合物，产物通过30k滤器洗涤3次。并且产物可以进一步经过密度梯度超离心(DGU)纯化(蔗糖柱梯度：10、15、20、 25、30、35、40％，在50000rpm和4℃超离心18小时)。在DGU之后的样品通过808nm 激光激发并且记录它们的荧光，结果在图5中示出。如图5中所示，IRETBN-PEG600成功地连接至SA。荧光效率在其与生物分子结合之后可以保持或增强。
对于用于抗体缀合的典型反应：将72.2μL爱必妥(13.7μM)和1.93μL DBCO-PEG4-NHS (3.08mM)添加在一起。将混合物涡旋一会儿，并在振荡器中反应2小时。在反应之后，产物通过30k滤器洗涤4次，最终体积为100μL。然后，将29.7μL IRETBN-PEG600(152.9μM) 加入至100μL爱必妥@DBCO-PEG4。将混合物涡旋一会儿，并在搅拌下反应6小时。产物通过100k滤器洗涤6次。观察到染料-爱必妥缀合物特异性地在基片上形成斑点的EGFR过表达的SCC细胞溶解产物上结合，同时没有结合至EGFR阴性SKOV细胞溶解产物斑点。
实施例19：分子荧光团的排泄
通过合适设计，分子荧光团可以在体内排泄，其对于减少荧光团的潜在毒性很重要。发明人使用IRETBN-PEG1700作为示例。首先，将IRETBN-PEG1700的PBS溶液以2.5mg/kg的剂量注入健康C57BL/6小鼠中，并进行全身成像以在体内追踪荧光团。观察到在注射后几小时内IRETBN-PEG1700在膀胱中积累(图6， a)。收集不同时间点的尿液样品以检查IRETBN-PEG1700的排泄。使用荧光方法来评价尿液中的荧光团的量。观察到尿液样品中的强SWIR荧光信号，其中在注射后3h处具有最大SWIR信号(图6， b)。通过尿液排泄的IRETBN-PEG1700的总量在注射后15h处估算为超过80％。
本说明书通篇中提及"实施方案"、"一些实施方案"、"一个实施方案"、"另一个实施例"、 "实施例"、"具体实施例"或"一些实施例"意指关于所述实施方案或实施例描述的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开内容的至少一个实施方案或实施例中。因此，在本说明书通篇的多个地方出现的短语如"在一些实施方案中"、"在一个实施方案中"、"在实施方案中"、" 在另一个实施例中、"在实施例中"、"在具体实施例中"或"在一些实施例中"不是必需地指本公开内容的同一个实施方案或实施例。此外，特定的特征、结构、材料或特性可以在一个或多个实施方案或实施例中以任何合适方式组合。
尽管已经示出和描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，以上实施方案不能被解释为限制本公开内容，并且在没有背离本公开内容的精神、原则和范围的情况下，可以在这些实施方案中进行变化、备选方案和更改。
Claims (17)
1.一种化合物，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
其中，Z1、Z2、Z5和Y中的每一个独立地是O、S、Se；
各个R2独立地是OCn3H2n3W；
W是N3或
；
n是4至120范围内的整数；
各个n3独立地是0至20范围内的整数。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
3.一种化合物，所述化合物具有选自由以下各项组成的组中的任一个的式：
4.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1~3任一项所述的化合物。
5.根据权利要求1~3任一项所述的化合物或根据权利要求4所述的试剂盒在标记生物分子或缀合至生物分子中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，所述生物分子和根据权利要求1~3任一项所述的化合物经由利用根据权利要求1~3任一项所述的化合物上的叠氮基的点击化学或分子间力结合在一起，从而形成稳定的非共价的复合物。
7.一种根据权利要求1~3任一项所述的化合物与生物分子的缀合物，其中所述生物分子为利用末端炔基修饰的小生物活性分子、肽、抗体、蛋白质、亲合体、核酸和适体。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中通过简单混合或者通过混合接着加热至40-70摄氏度，所述生物分子和根据权利要求1~3任一项所述的化合物经由利用根据权利要求1~3任一项所述的化合物上的叠氮基的点击化学或分子间力结合在一起，从而形成稳定的非共价的复合物。
9.根据权利要求1~3任一项所述的化合物、根据权利要求4所述的试剂盒或者根据权利要求7或8所述的缀合物在非疾病诊断生物医学成像中的用途。
10.一种用于非疾病诊断的生物医学成像的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1~3任一项所述的化合物、根据权利要求4所述的试剂盒或者根据权利要求7或8所述的缀合物施用至受试者，
通过NIR光源在关注的部位处照射所述受试者，
通过照相机记录荧光图像或视频。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者包括动物、人、组织、细胞、3D类器官或球状体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将根据权利要求1~3任一项所述的化合物、根据权利要求4所述的试剂盒或者根据权利要求7或8所述的缀合物施用到所述受试者的血管、组织、器官或淋巴结中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述NIR光源是激光光源或发光二极管，并且所述NIR光源的波长为780nm、808nm或980 nm。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述照相机包括用于在900nm-1700nm范围内成像的InGaAs照相机、Si电荷耦合器件或用于在800-1100nm范围内成像的具有或不具有NIR增强检测器的照相机。
15.一种用于标记生物分子的方法，所述方法包括：
使根据权利要求1~3任一项所述的化合物或根据权利要求4所述的试剂盒与所述生物分子反应，或者
在加热至40-70摄氏度或没有加热至40-70摄氏度的情况下，将根据权利要求1~3任一项所述的化合物或根据权利要求4所述的试剂盒与所述生物分子混合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子为利用末端炔基修饰的小生物活性分子、肽、抗体、蛋白质、亲合体、核酸或适体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述小生物活性分子为叶酸、维甲酸、胆酸、半乳糖或生物素，
所述肽为十肽：synB3、OSBP-1或OSBP-S，
所述抗体为爱必妥、抗-SA2、赫赛汀、针对人或动物抗体的二抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝利木单抗、贝伐单抗、本妥昔单抗、康纳单抗、西妥昔单抗、妥珠单抗、达克珠单抗、达雷木单抗、狄诺塞麦、依库珠单抗、依法珠单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、英夫利昔单抗、易普利姆玛、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、纳武单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、派姆单抗、兰尼单抗、利妥昔单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、乌司奴单抗或维多珠单抗。
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