CN109613235A - 一种快速检测血液样本中异嗜性抗体ha的胶体金试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条及其制备方法，包括底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上。所述胶体金垫上包含有胶体金标记的通用型HA单克隆抗体mAb1，浓度为8～12μg/mL。所述胶体金的最大吸收波长为510～550nm。本发明胶体金试纸条可以实现血液样本中异嗜性抗体HA干扰物的快速、全面检测，结果直观、可靠，为临床工作者准确判读和分析实验结果提供可行性解决方案。

Description

一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条及其 制备方法

技术领域

本发明属于临床检验技术领域，尤其涉及一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

近二十年来，国内外大量文献报道了免疫分析实验中存在的假阳性、假阴性或其它特异性干扰现象。目前已知的干扰物有：溶血、高血脂、高胆红素、抗凝剂、补体、异嗜性抗体、自身抗体、结合蛋白、药物及其代谢物等，其中异嗜性抗体对双抗体夹心法免疫分析系统造成的干扰尤为严重。

异嗜性抗体(Heterophilic Antibodies,HA)是存在于人类血液中，由已知或未知的抗原物质刺激人体产生的，可以与啮齿类动物免疫球蛋白相结合的一类抗体。HA可与试剂中抗体的Fc或者F(ab)区域的决定簇结合，从而干扰免疫反应。

异嗜性抗体(HA)产生的主要途径有：类风湿性关节炎、流行性感冒、过敏、输血、自身免疫疾病、免疫抑制药物、心肌病变、注射疫苗、动物接触、特定食物(奶酪)、动物辅助治疗(胸腺细胞、胚胎细胞、羊细胞)、血液透析、母婴传递、肠胃炎(E.coli)等。

根据大量文献报道，超过30％的人群血液样本中存在异嗜性抗体干扰。这些干扰作用对免疫分析结果的准确性是一个很大的威胁，已经引起业内的高度关注。

我国临床医疗总误诊率为27.8％，比国际平均临床医疗总误诊率25％高2.8个百分点，其中恶性肿瘤误诊率为40％，抗体干扰是其中主要原因之一。一旦假阳性或假阴性结果没有被发现，患者将要承受不必要的治疗及身体和精神上的痛苦。因而，鉴定和排除这些干扰物成为当务之急。

由于异嗜性抗体种类的多样性和复杂性，目前国内外针对异嗜性抗体HA干扰物的检测和鉴定方法，既不全面，也不成熟，主要鉴别方法有：

1)系列稀释样本之后，观察测定值是否成比例，如果不成比例说明可能有HA干扰；

2)用参考试剂盒测定进行结果对比，如果有明显差异，说明可能存在HA干扰；

3)加入清洁抗体进行结果对比，如果有明显差异，说明可能存在HA干扰。

这些方法费时费力，而且无法做到HA干扰物的全面检测，结果也不够直观，所以急需一种能够方便、全面、准确检测HA干扰物的方法

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，本发明的目的是建立一种血液样本中异嗜性抗体HA干扰物的快速、全面、准确检测方法，为临床工作者准确判读和分析实验结果提供可行性解决方案。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，包括底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上。

所述胶体金垫上包含有胶体金标记的通用型HA单克隆抗体mAb1，浓度为8～12μg/mL。

所述胶体金的最大吸收波长为510～550nm。

所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，检测线包被有另外一株不同表位的通用型HA单克隆抗体mAb2，浓度为0.8～1.8mg/mL，划膜量为1ul/cm；质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为0.8～1.8mg/mL，划膜量为1ul/cm。

所述检测线和质控线间隔距离为3～5mm，检测线在质控线的下方。

所述样品垫为玻璃纤维材质，胶体金垫为玻璃纤维材质，包被膜为硝酸纤维素NC材质，底板为PVC胶板材质，吸水垫为滤纸材质。

此外本发明还提供了一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：

步骤一、胶体金的制备

采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将质量百分浓度为1％的氯金酸溶液和质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠溶液按1:1-1:2体积比混合煮沸，制备浓度为0.01％的胶体金溶液；用紫外-可见光分光光度计进行全波长扫描。

步骤二、胶体金垫的制备

每ml胶体金中加入0.2M碳酸钾溶液2-4ul调整pH，然后加入8-12ug通用型HA单克隆抗体mAb1，混合均匀，保持2-8℃静置反应过夜，继续加入1％BSA，封闭1小时以上，以10℃、10000rpm离心20分钟，弃上清；沉淀用含20mM Tris、10％蔗糖、1％BSA，pH8.0-8.5的溶液复溶至原胶体金体积的1/10，将复溶后的原胶体金标记物用专用设备按5-10μl/cm喷涂在玻璃纤维上，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到胶体金垫。

步骤三、包被膜的制备

将通用型HA单克隆抗体mAb2用pH7.2-7.4的20mM PBS调节至浓度为0.8-1.8mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的检测线处；将羊抗鼠IgG用pH7.2-7.4的20mM PBS调节至浓度为0.8-1.8mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的质控线处，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到包被膜。

步骤四、样品垫的制备

将含有50mM Tris、1％PVP、0.5％NaCl、1％Brij35、pH8.5-9.0的处理液均匀涂布在玻璃纤维素上，置于空气湿度低于40％的条件下，室温自然晾干，得到样品垫。

步骤五、试纸条的组装

在底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫，制作试纸大板，用专用切条机切割成所需宽度的试纸条。

本发明采用胶体金免疫层析分析原理、夹心法，定性检测人血液样本中的异嗜性抗体HA干扰物。在玻璃纤维上预包埋胶体金标记的通用型HA单克隆抗体mAb1，在硝酸纤维素NC膜上检测线T和质控线C处分别包被另外一株不同表位的通用型HA单克隆抗体mAb2和羊抗鼠IgG多克隆抗体。当样本中含有HA时，HA与胶体金标记的mAb1结合形成金标复合物，由于层析作用复合物沿试纸条向前移动，经过检测线时与预包被的mAb2反应，形成免疫夹心复合物而显现红色条带，游离的金标复合物则在质控线与羊抗鼠IgG结合显现红色条带。若样本中不含HA，则仅质控线显色。

本发明胶体金试纸条可以实现血液样本中异嗜性抗体HA干扰物的快速、全面检测，结果直观、可靠，为临床工作者准确判读和分析实验结果提供可行性解决方案。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明胶体金试纸条的结构示意图。

图2为本发明胶体金试纸条配套的塑料外壳示意图。

其中：1、样品垫；2、胶体金垫；3、包被膜；4、吸水垫；5、底板；6、检测线；7、质控线，8、加样孔；9、观察窗。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例

如图1所示，在该实施例中，底板5上顺次相互搭接地粘贴样品垫1、胶体金垫2、包被膜3以及吸水垫4；样品垫1是加样区，用于吸取待测样本；包被膜3上设有检测线6和质控线7；所述检测线和质控线间隔距离为4mm，检测线在质控线的下方。

胶体金垫2上包含有胶体金标记的通用型HA单克隆抗体mAb1，浓度为10μg/mL。

包被膜3上的检测线6包被有另外一株不同表位的通用型HA单克隆抗体mAb2，浓度为1.0mg/mL，划膜量为1ul/cm。

包被膜3上的质控线7包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为1.0mg/mL，划膜量为1ul/cm。

所述样品垫为玻璃纤维材质，胶体金垫为玻璃纤维材质，包被膜为硝酸纤维素NC材质，底板为PVC胶板材质，吸水垫为滤纸材质。

一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：

1.胶体金的制备

加热一份99g纯化水，加入质量百分浓度为1％的氯金酸溶液1ml煮沸，在搅拌条件下再加入1.4ml质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后停止加热，继续搅拌至冷却，得到浓度为0.01％的胶体金溶液，使用紫外-可见光分光光度计进行全波长扫描确定最大吸收波长为530nm。

2.胶体金垫制备

取步骤1制备的胶体金溶液10ml，加入0.2M碳酸钾溶液30ul，然后加入100ug通用型HA单克隆抗体mAb1，混合均匀，保持2-8℃静置反应过夜，继续加入1％BSA，封闭2小时，以10℃、10000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用含20mM Tris、10％蔗糖、1％BSA，pH8.5的溶液复溶至1ml，复溶后的原胶体金标记物用专用设备按10μl/cm喷涂在玻璃纤维上，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到胶体金垫。

3.包被膜的制备

将通用型HA单克隆抗体mAb2用pH7.4的20mM PBS调节至浓度为1.0mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的检测线处，将羊抗鼠IgG用pH7.4的20mM PBS调节至浓度为1.0mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的质控线处，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到包被膜。

4.样品垫的制备

将含有50mM Tris、1％PVP、0.5％NaCl、1％Brij35，pH9.0的处理液均匀涂布在玻璃纤维素上，置于空气湿度低于40％的条件下，室温自然晾干，得到样品垫。

5.试纸条的组装

在尺寸为60×300mm的底板上顺次相互搭接地粘贴尺寸为18×300mm的样品垫、尺寸为6×300mm的胶体金垫、尺寸为25×300mm的包被膜和尺寸为17×300mm的吸水垫，得到试纸大板，用专用切条机切割成4mm宽度的试纸条。

如附图2所示，本发明所述的胶体金试纸条在使用时，组装在配套的塑料外壳中，制作成检测卡。检测卡设有两个开孔，加样孔8和观察窗9，加样孔8对应于所述胶体金试纸条的样品垫1，观察窗9对应于所述胶体金试纸条的检测线6和质控线7。

检测样本时，先将检测卡置于干净平坦的台面上，然后垂直缓慢滴加100ul人血液样本于检测卡的加样孔8处，等待15分钟后，在观察窗9处根据检测线6和质控线7的显色情况判读结果。

本发明只是参考附图图示的实施例进行了举例说明，我们认为具有相关领域基本知识的人员可以以此为基础进行多种多样的变形和同等水平的其它实施例。

Claims (8)

1.一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，其特征在于：所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫按层析方向顺次搭接粘贴在底板上。

2.根据权利要求1所述一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，其特征在于：所述胶体金垫上包含有胶体金标记的通用型HA单克隆抗体mAb1，浓度为8～12μg/mL。

3.根据权利要求2所述一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，其特征在于：所述胶体金的最大吸收波长为510～550nm。

4.根据权利要求1所述一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，其特征在于：所述包被膜上依次设置有检测线和质控线，检测线包被有另外一株不同表位的通用型HA单克隆抗体mAb2，浓度为0.8～1.8mg/mL，划膜量为1ul/cm；质控线包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体，浓度为0.8～1.8mg/mL，划膜量为1ul/cm。

5.根据权利要求4所述一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，其特征在于：所述检测线和质控线间隔距离为3～5mm，检测线在质控线的下方。

6.根据权利要求1所述一种快速检测血液样本中异嗜性抗体HA的胶体金试纸条，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维材质，胶体金垫为玻璃纤维材质，包被膜为硝酸纤维素NC材质，底板为PVC胶板材质，吸水垫为滤纸材质。

7.一种根据权利要求1所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：主要包括以下步骤：

步骤一、胶体金的制备

采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将质量百分浓度为1％的氯金酸溶液和质量百分浓度为1％的柠檬酸三钠溶液按1:1-1:2体积比混合煮沸，制备浓度为0.01％的胶体金溶液；用紫外-可见光分光光度计进行全波长扫描；

步骤二、胶体金垫的制备

每ml步骤一中得到的胶体金溶液中加入0.2M碳酸钾溶液2-4ul调整pH，然后加入8-12ug通用型HA单克隆抗体mAb1，混合均匀，保持2-8℃静置反应过夜，继续加入1％BSA，封闭1小时以上，以10℃、10000rpm离心20分钟，弃上清；沉淀用含20mM Tris、10％蔗糖、1％BSA，pH8.0-8.5的溶液复溶至原胶体金体积的1/10，将复溶后的原胶体金标记物用专用设备按5-10μl/cm喷涂在玻璃纤维上，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到胶体金垫；

步骤三、包被膜的制备

将通用型HA单克隆抗体mAb2用pH7.2-7.4的20mM PBS调节至浓度为0.8-1.8mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的检测线处；将羊抗鼠IgG用pH7.2-7.4的20mM PBS调节至浓度为0.8-1.8mg/mL，1ul/cm划线在NC膜的质控线处，置于烘箱中37℃鼓风干燥1小时，得到包被膜；

步骤四、样品垫的制备

将含有50mM Tris、1％PVP、0.5％NaCl、1％Brij35、pH8.5-9.0的处理液均匀涂布在玻璃纤维素上，置于空气湿度低于40％的条件下，室温自然晾干，得到样品垫；

步骤五、试纸条的组装

在底板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫，制作试纸大板，用专用切条机切割成所需宽度的试纸条。

8.一种根据权利要求1-7任一项所述的胶体金试纸条的使用方法，其特征在于：所述的胶体金试纸条，在使用时，组装在配套的塑料外壳中，制作成检测卡，检测卡设有加样孔和观察窗，加样孔对应于所述胶体金试纸条的样品垫，观察窗对应于所述胶体金试纸条的检测线和质控线，检测样本时，先将检测卡置于干净平坦的台面上，然后垂直缓慢滴加100ul人血液样本于检测卡的加样孔处，等待15分钟后，在观察窗处根据检测线和质控线的显色情况判读结果。