CN109609521A

CN109609521A - 博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列及其应用

Info

Publication number: CN109609521A
Application number: CN201811423063.2A
Authority: CN
Inventors: 黄鹏; 曾建国
Original assignee: Hunan Meikeda Biological Tiomin Resources Inc
Current assignee: Hunan Meikeda Biological Tiomin Resources Inc
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109609521B

Abstract

本发明提供一种博落回普罗托品‑6‑羟基化酶基因优化序列及其应用，具体包括对普罗托品‑6‑羟基化酶基因MC11229进行密码子优化后得到优化序列MC11229opt，含有优化序列MC11229opt的重组表达载体，含有所述优化序列MC11229opt的重组表达载体的酵母工程菌以及其在制备二氢血根碱/血根碱中的应用。本发明将博落回中参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因MC11229，根据酵母菌偏爱的密码子，进行密码子优化后得到的优化序列，整合到酿酒酵母中进行异源表达实现血根碱与白屈菜红碱的微生物转化，与未经优化的功能基因相比，能极大提高其酶催化效率，提高催化产物二氢血根碱及血根碱的含量，降低二氢血根碱及血根碱的生产成本。

Description

博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列及其应用，属于基因工程与生物工程技术领域。

技术背景

药用植物是我国传统医学中具有防病治病的疗效而作为药物来源的植物，在我国医学中具有非常重要的地位。许多药用植物的有效成分就是它的次生代谢产物，由于其独特的疗效以及毒副作用小等特点引起了广泛关注。我国野生药用植物资源种类丰富，但是由于近年来自然环境的破坏加上对药用植物供不应求而致使的过度开采和滥用，导致我国的药用植物资源濒临枯竭。野生资源已经不能满足人们的需求，而人工栽培中又存在活性成分减少以及品种退化的问题，所以利用生物技术来调控药用植物的次生代谢能够有效的改善植物的代谢途径、提高植物的抗病性、抗逆性、其有效成分含量、药物的药效、产量以及品质，对于优化药用植物种质资源以及可持续发展具有重要的意义。

博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)属于罂粟科博落回属植物，别名又叫号筒杆、落回、山号筒、山梧桐、三钱三等，生长于丘陵、低山、林边、草地、路旁，是一种野生草本植物。博落回主要分布于中国、东亚、北美洲和欧洲。博落回属植物包括博落回和小果博落回(M.microcarpa(Maxim)Fedde)两个种，作为一种传统中草药最早见于《本草拾遗》，在民间作为一种杀蛆青草药而广泛使用。随着研究的不断深入，发现博落回具有抑菌、抗炎、调节畜禽类肠道菌群等多重药理作用，博落回开始作为一种药源植物得到越来越广泛的应用。

国内外许多有关博落回化学成分的研究表明，博落回属植物的化学成分中，生物碱是最主要的次生代谢产物，其中主要包括了原阿片碱、血根碱、白屈菜红碱、小檗碱、别隐品碱、黄连碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱等等。这些生物碱都具备各种用途以及多种药理作用，属于异喹啉类生物碱。研究表明，其中最主要的血根碱、白屈菜红碱以及小檗碱具有广谱抑菌的作用。另外，博落回中还有一些其他的物质如糖类、三萜化合物、甾体、挥发油、黄酮及其苷、氨基酸、蛋白质等等。因此博落回不仅具有较高的生态以及药用价值，而且具备较高的经济效益，近年来作为饲料添加剂收到广泛的关注，博落回的需求量逐年增长。然而，随着野生资源的不断开采，使得博落回资源的野生储备量逐年递减。

生物转化(biotransformation)也叫生物催化(biocatalysis)，是指利用微生物全细胞或提取酶作为催化剂对外源底物进行结构修饰或定向合成而获得有价值产物的生理生化反应，其本质是生物体系中酶的催化反应。这种特定的酶催化反应具有以下特点：(1)具有高度的立体选择性。(2)反应条件温和，生产安全，不造成环境污染和后处理简单。(3)目标明确，副产物少，成本低。(4)微生物转化可以减少反应步骤。生物转化体系中以微生物转化体系应用得最为广泛。微生物分布广泛，种类繁多，易培养，周期短，在生长过程中产生丰富的酶系，利用微生物及其产生的酶进行生物转化可以生成许多有价值的化合物，且微生物的酶系所催化的反应很多是传统化学合成很难进行的反应。随着微生物的基因操作方法日渐成熟，利用现代分子生物学的手段，不仅能提高生物转化的转化率，而且能将几种不同的基因构建于同一个工程菌中，能同时进行几步转化反应，给微生物转化带来更美好的前景。

近年来，国内外对于血根碱生物合成途径的研究有过很多报道。罂粟，唐松草(Thalictrum aquilegifolium)，黄唐松草(Thalictrum flavum)，拟南芥，日本黄连(Coptis Japonica)和花菱草等植物中都有血根碱生源合成途径的相关功能酶基因。来自不同物种的功能基因异源表达效果不一样。D.Smolke团队比较了花菱草、蓟罂粟(A.mexicana)和罂粟的华紫堇碱合酶(cheilanthifoline synthase,CFS)基因与拟南芥、花菱草、罂粟以及酵母的CPR基因的表达情况，得出花菱草的CFS基因与拟南芥的CPR基因在酵母中有最好的表达效果，催化产生最高浓度的华紫堇碱。而迄今为止，未有学者对不同物种的P6H基因表达情况有所报道。

而如何提高外源基因的异源表达高效性是微生物合成研究中的一个亟待解决的重要问题。影响外源基因在酵母表达系统中高效表达的因素有很多，其中酵母对密码子的偏爱性，目的基因的密码子序列对产物的表达量有很大影响。在编码氨基酸的所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的，含有酵母本身所偏爱密码子的基因在酵母中往往有较高的表达。通过优化基因的密码子序列，可以提高宿主细胞内tRNA的丰度，同时也有利于翻译的二级结构的形成，从而使得产物表达量有所提高。

本发明拟提供一种博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因进行密码子优化后的基因优化序列及其在制备二氢血根碱/血根碱中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列，所述优化序列为对普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因MC11229进行密码子优化后得到，记为MC11229opt，其包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；MC11229包含如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

进一步地，

所述优化序列MC11229opt表达的氨基酸包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种含有上述博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体的质粒选自PYES2。

本发明还提供一种含有上述博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt或上述重组表达载体的酵母工程菌株。

进一步地，

所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

进一步地，

本发明还提供上博落回述普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt、上述重组表达载体或上述酵母工程菌在制备二氢血根碱/血根碱中的应用。

本发明还提供一种采用上述博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt、上述重组表达载体或上述酵母工程菌制备二氢血根碱/血根碱的方法，具体包括如下步骤：

(1)将上述含有博落回普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt与辅酶基因构建到表达载体PYES2上，然后转入酵母工程菌中，获得含有普罗托品-6-羟基化酶(P6H)基因优化序列MC11229opt的重组表达载体的酵母工程菌株；

(2)以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂步骤(1)构建的酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时；

(3)收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得。

本发明的有益效果：

本发明将博落回中参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因MC11229，根据酵母菌偏爱的密码子，进行密码子优化后，然后将得到的优化序列，整合到酿酒酵母中进行异源表达实现血根碱与白屈菜红碱的微生物转化，与未经优化的功能基因相比，能极大提高其酶催化效率，提高催化产物二氢血根碱及血根碱的含量，降低二氢血根碱及血根碱的生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径；

图2为密码子优化前后的功能基因MC11229、MC11229opt的催化效率比较图。

具体实施方式

为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。特在此说明，实施例只是为更直接地描述本发明，它们只是本发明的一部分，不能对本发明构成任何限制。

如附图1所示的博落回中血根碱和白屈菜红碱的合成途径，普罗托品-6-羟基化酶(P6H)参与了血根碱(SAN)和白屈菜红碱(CHE)生物合成的步骤，其能催化别隐品碱(ALL)生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)以及催化原阿片碱(PRO)生成二氢血根碱(DHSAN)。由于P6H属于细胞色素P450氧化还原酶，作为一种单加氧酶，需要与细胞色素P450还原酶(CPR)共表达才能发挥蛋白催化作用，CPR在反应中起到传递电子的作用。

在本申请人之前的研究中，在以罂粟和花菱草的P6H基因序列为参照，在博落回转录组数据中进行同源比对后找到2个同源性较高的基因序列(编号为MC11229和MC11218，参照专利：CN106119265A，博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的细胞色素P450酶基因)，并进行了酵母异源表达验证。

本发明对其中一个基因序列MC11229(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，根据酿酒酵母偏爱的密码子，进行密码子优化后，得到基因优化序列MC11229opt，其核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。

根据图1博落回中血根碱和白屈菜红碱生物合成途径图，P6H既可以催化别隐品碱(ALL)生成二氢白屈菜红碱(DHCHE)又可以催化原阿片碱(PRO)生成二氢血根碱(DHSAN)，进而在二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)的催化作用下合成白屈菜红碱(CHE)及血根碱(SAN)，为了研究的方便、不重复，本发明只加入原阿片碱标准品作为前体物质来研究P6H的相关性能。

由于CPR基因是P450基因在氧化底物中的一个辅酶基因，加入CPR有利于提高氧化反应效率。本发明中加入CuCPR辅酶基因(其核苷酸序列、氨基酸序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示)，并以优化前的MC11229基因序列为参照，来研究优化后P6H基因序列酶催化效率。

1、引物设计

根据infusion引物的设计原则设计各基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见下表1：

表1 PCR引物序列与产物长度

2、博落回cDNA的制备

按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取博落回总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。

3、提取载体质粒

取经高压灭菌后的10mL离心管，加入5mL含100mg/L Amp的LB液体培养基，再分别加入200μL标签为PYES2-His(组氨酸缺陷的载体质粒)、PYES2-Ura、PYES2-Leu的大肠杆菌菌液，放于恒温振荡仪中37℃，200rpm过夜培养。采用质粒提取试剂盒提取质粒，并测定含量。

4、基因克隆

MC11229opt、MC11229及CuCPR基因的扩增：以博落回cDNA为模板，分别选用MC11229opt-His-F、MC11229opt-His-R；MC11229-Ura-F、MC11229-Ura-R；CuCPR-Leu-F、CuCPR-Leu-R引物(引物序列见上表1)进行PCR扩增。PCR反应体系如下表2：

表2基因克隆PCR反应体系

轻轻混匀，短暂离心5sec。扩增条件：98℃预变性30sec，98℃10sec，58℃30sec，72℃2min(30个循环)，72℃2min，4℃保持。扩增完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，目的条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，并测定含量。

5、制备线性载体

用限制性内切酶SacI-HF、XBaI(购自New England Biolabs(NEB)公司)将载体质粒PYES2-His回收产物进行双酶切，反应体系如下：

表3线性载体PCR反应体系

用限制性内切酶KpnI-HF、XBal将载体质粒PYES2-Ura、PYES2-Leu回收产物分别进行双酶切，反应体系分别如下表4、表5：

表4载体质粒PYES2-Ura双酶切反应体系

表5载体质粒PYES2-Leu双酶切反应体系

扩增条件如下：置于37℃反应30min，反应完成后在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，目的条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，并测定含量。

6、构建表达载体

进入以下网站：

http://www.clontech.com/US/Support/xxclt_onlineToolsLoad.jsp？citemId ＝http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do&section＝16260&xxheight ＝750，根据载体和目的基因的片段大小，计算出载体和基因所需的浓度。再根据上述所测得的基因和载体的含量，计算出相应的体积，加入Infusion酶充分混匀后，置于50℃反应20min。再将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α，涂板于含100mg/L Amp的LB筛选平板上，37℃倒置培养过夜。

7、构建重组表达载体

将基因序列MC11229opt构建到表达载体上，并以优化前的基因序列MC11229为参照，按照同样的方法构建重组表达载体，获得重组表达载体PYES2-His+MC11229opt、PYES2-Ura+MC11229，同时还构建重组表达载体PYES2-Leu+CuCPR。

以PYES2-Detect-F、PYES2-Detect-R为上下引物对重组基因PYES2-His+MC11229opt、PYES2-Ura+MC11229、PYES2-Leu+CuCPR进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

表6重组基因PCR反应体系

扩增条件：94℃预变性5min，94℃30sec，58℃30sec，72℃2min，(35个循环)，72℃5min，4℃保持。扩增完成后，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，挑取PCR初步检测正确的阳性克隆菌落于含100mg/L Amp的LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养，次日采用质粒提取试剂盒提取质粒并送测序，测序确认没有突变。

8、构建重组酵母菌并进行酵母工程菌发酵培养

将重组表达载体PYES2-Ura+MC11229、PYES2-His+MC11229opt分别与PYES2-Leu+Cu CPR转入酵母(ivf，购自Thermo Fisher Scientific公司)中，获得酵母工程菌株MCY-3072(PYES2-Ura+MC11229+CuCPR)MCY-3083(PYES2+MC11229opt+CuCPR)，同时还将P YES2-Trp质粒单独转入酵母(ivf)菌株中，获得酵母工程菌株MCY-3060，作为空白对照；然后再分别在组氨酸(His)与Leu双缺陷以及Trp、Leu与Ura三缺陷的SD/Dropout选择培养基上培养48h，得到直径约1mm的单菌落。

以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂酵母工程菌；温度30°下发酵培养24小时。

9、样品的制备：收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、用甲醇抽提化合物，即得样品。

10、将制备好的样品用UPLC-Q-TOF进行检测，结果如下表1和图2所示。

本发明以MCY-3060作为空白对照，在相同条件下饲喂原阿片碱后未产生二氢血根碱和血根碱，证明酵母本身不会对实验产生影响。MCY-3072、MCY-3083均检测到了二氢血根碱，含量结果经SPSS 19.0软件分析，P＜0.05，样品之间差异显著，实验结果具有统计学意义。具体结果见表7：

表7优化前后的基因二氢血根碱含量测定结果

上表7的结果以及附图2表明，MC11229opt+CuCPR工程菌催化产生的二氢血根碱含量比MC11229+CuCPR的高，优化后的基因MC11229opt相比优化前的基因MC11229使得催化产物的含量得到了提高。具体地，优化后的酵母工程菌MC11229opt+CuCPR使得二氢血根碱的含量从20.096ng﹒mL^-1提高到了26.944ng﹒mL^-1，提高了34％。

以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做出的任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。

序列说明：

SEQ ID No.1、SEQ ID No.2分别为MC11229opt的核苷酸序列和氨基酸序列；SEQID No.3为MC11229的核苷酸序列；

SEQ ID No.4、SEQ ID No.5分别为CuCPR的核苷酸序列和氨基酸序列；

SEQ ID No.6-13分别为引物MC11229opt-His-F、MC11229opt-His-R、MC11229-Ura-F、MC11229-Ura-R、PYES2-Detect-F、PYES2-Detect-R、CuCPR-Leu-F、CuCPR-Leu-R的核苷酸序列。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南美可达生物资源股份有限公司

<120> 博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列及其应用

<130> 20181121

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> MC11229opt

<400> 1

atggcagctt tgttggcttt ggtcttttta tacaatttta ttattatttg gtcttcttca 60

ccaagaacta ctattaatgg taaaaagcag attagaaaag ctccaatggc tgctggtgct 120

tggccaattt tgggtcactt gcacttgttc ggttcaggtg agttgccaca caagatgttg 180

gcagctatgg ctgaaaaata tggttctgct tttatgatga agtttggtaa acatactaca 240

ttggtcgttt cagacacaag aattgttaaa gaatgtttta ctactaatga tacattgttt 300

gctaacagac catctactac tgctttcgat ttgatgactt atgctaatga ttctgttgct 360

tttactccat atggtccata ttggagagaa ttgagaaaga tttctacatt gaaattgttg 420

tcaaaccata gattgcaagc aattaaggat gttagagctt ctgaagttaa tgtttgtttt 480

agagaattat ataatttgtg taataaacaa aacaaaaatg acggtgctga tcatgttttg 540

gtcgatatga aaaagtggtt tgaagaagtt tctaacaatg ttgttatgag agttattgtt 600

ggtagacaaa attttggttc taaaattgtt agaggtgaag aagaagcagt taattacaaa 660

aaagttatgg atgaattgtt gagattggct tcattgtcta tgttgtctga cttcgctcca 720

ttgttgggtt ggttggatat ttttcaaggt aacatgtctg ctatgaaaag aaatgctaaa 780

aaagttgata caattttgga aggttggttg gaggaacata gaaataagaa aaagaagtct 840

tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcatcttctt cttcttcagg tgaaaatgat 900

caagatttca tggatgttat gttgtctatt attgaagaaa ctaagttgtc tggtagagat 960

gctgatactg ttattaaagc tacttgtttg gctatgatta tgggtggtac tgatactact 1020

gctgtttctt tgacttggat tgtttctttg ttgatgaata atagacatgt cttgaagaag 1080

gctagagagg agttggacgc tttggtcggt aaagacagac aggtcgagga ctcagacttg 1140

aagaacttgg tttatatgaa tgctattgtt aaagaaacta tgaggttgtt cccattgggt 1200

gctttgttgg agagggaaac taaggaggac tgcgaagtcg gtggtttcca gttgcagggt 1260

ggttctaggt tgttggtcaa tgtctggaag ttgcaaaggg acccaaacgt ctggtctgat 1320

ccaactgagt tcaggccaga gaggttcttg tctgagaacg ctgatattga cgtcggtggt 1380

cagcactttg agttgttgcc attcggagct ggtagaaggg tctgtccagg tgtctctttc 1440

gctttgcagt tcatgcactt ggtcttggct aggttgattc atggttatga attgggtact 1500

cagaatgacg aggacgtcga cttgactgag tcaacagagg gtcacgtcaa tcacaaggct 1560

tctccattgg atttaatttt gactccaaga ttacatccaa aattgtatga atattaa 1617

<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> MC11229opt

<400> 2

Met Ala Ala Leu Leu Ala Leu Val Phe Leu Tyr Asn Phe Ile Ile Ile

1 5 10 15

Trp Ser Ser Ser Pro Arg Thr Thr Ile Asn Gly Lys Lys Gln Ile Arg

20 25 30

Lys Ala Pro Met Ala Ala Gly Ala Trp Pro Ile Leu Gly His Leu His

35 40 45

Leu Phe Gly Ser Gly Glu Leu Pro His Lys Met Leu Ala Ala Met Ala

50 55 60

Glu Lys Tyr Gly Ser Ala Phe Met Met Lys Phe Gly Lys His Thr Thr

65 70 75 80

Leu Val Val Ser Asp Thr Arg Ile Val Lys Glu Cys Phe Thr Thr Asn

85 90 95

Asp Thr Leu Phe Ala Asn Arg Pro Ser Thr Thr Ala Phe Asp Leu Met

100 105 110

Thr Tyr Ala Asn Asp Ser Val Ala Phe Thr Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp

115 120 125

Arg Glu Leu Arg Lys Ile Ser Thr Leu Lys Leu Leu Ser Asn His Arg

130 135 140

Leu Gln Ala Ile Lys Asp Val Arg Ala Ser Glu Val Asn Val Cys Phe

145 150 155 160

Arg Glu Leu Tyr Asn Leu Cys Asn Lys Gln Asn Lys Asn Asp Gly Ala

165 170 175

Asp His Val Leu Val Asp Met Lys Lys Trp Phe Glu Glu Val Ser Asn

180 185 190

Asn Val Val Met Arg Val Ile Val Gly Arg Gln Asn Phe Gly Ser Lys

195 200 205

Ile Val Arg Gly Glu Glu Glu Ala Val Asn Tyr Lys Lys Val Met Asp

210 215 220

Glu Leu Leu Arg Leu Ala Ser Leu Ser Met Leu Ser Asp Phe Ala Pro

225 230 235 240

Leu Leu Gly Trp Leu Asp Ile Phe Gln Gly Asn Met Ser Ala Met Lys

245 250 255

Arg Asn Ala Lys Lys Val Asp Thr Ile Leu Glu Gly Trp Leu Glu Glu

260 265 270

His Arg Asn Lys Lys Lys Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Glu Asn Asp Gln Asp Phe Met

290 295 300

Asp Val Met Leu Ser Ile Ile Glu Glu Thr Lys Leu Ser Gly Arg Asp

305 310 315 320

Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Thr Cys Leu Ala Met Ile Met Gly Gly

325 330 335

Thr Asp Thr Thr Ala Val Ser Leu Thr Trp Ile Val Ser Leu Leu Met

340 345 350

Asn Asn Arg His Val Leu Lys Lys Ala Arg Glu Glu Leu Asp Ala Leu

355 360 365

Val Gly Lys Asp Arg Gln Val Glu Asp Ser Asp Leu Lys Asn Leu Val

370 375 380

Tyr Met Asn Ala Ile Val Lys Glu Thr Met Arg Leu Phe Pro Leu Gly

385 390 395 400

Ala Leu Leu Glu Arg Glu Thr Lys Glu Asp Cys Glu Val Gly Gly Phe

405 410 415

Gln Leu Gln Gly Gly Ser Arg Leu Leu Val Asn Val Trp Lys Leu Gln

420 425 430

Arg Asp Pro Asn Val Trp Ser Asp Pro Thr Glu Phe Arg Pro Glu Arg

435 440 445

Phe Leu Ser Glu Asn Ala Asp Ile Asp Val Gly Gly Gln His Phe Glu

450 455 460

Leu Leu Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Val Cys Pro Gly Val Ser Phe

465 470 475 480

Ala Leu Gln Phe Met His Leu Val Leu Ala Arg Leu Ile His Gly Tyr

485 490 495

Glu Leu Gly Thr Gln Asn Asp Glu Asp Val Asp Leu Thr Glu Ser Thr

500 505 510

Glu Gly His Val Asn His Lys Ala Ser Pro Leu Asp Leu Ile Leu Thr

515 520 525

Pro Arg Leu His Pro Lys Leu Tyr Glu Tyr

530 535

<210> 3

<211> 1617

<212> DNA

<213> MC11229

<400> 3

atggctgctc ttcttgcctt ggttttcctc tacaatttca tcatcatctg gagctcatcc 60

ccaagaacca ctatcaacgg taagaaacaa attaggaagg cacccatggc agccggcgca 120

tggccgattc ttggtcacct tcatttgttt ggatccggtg agctgcctca caaaatgctt 180

gcagccatgg ctgaaaagta tggctccgcc ttcatgatga agttcggtaa gcacacaaca 240

ctagttgtga gtgacacccg catagtaaaa gaatgtttca ctactaatga taccctcttt 300

gctaaccgtc cttcgaccac cgcctttgat ctcatgactt atgccaatga ttccgttgct 360

ttcacaccct atggtcctta ttggcgagag cttagaaaga tatccactct caaacttctc 420

tctaaccacc gtctccaggc catcaaggac gttcgagcct ccgaggtgaa cgtatgcttc 480

agggaactat acaatttatg caataagcag aataaaaatg atggagctga tcatgttttg 540

gtggatatga agaaatggtt tgaagaggtc tcaaacaacg tcgtgatgag ggtaatcgtt 600

gggagacaga acttcgggtc taagattgtg cgtggtgagg aggaggccgt caattacaag 660

aaagtcatgg atgaactctt acgacttgct agtctgtcta tgttatctga tttcgctcct 720

ttacttggtt ggttggatat tttccaagga aacatgagcg ccatgaaacg aaatgccaag 780

aaagtcgaca ccatacttga gggctggttg gaagagcata ggaataagaa gaagaagagc 840

tcatcatcat catcatcatc atcatcatca tcatcatcat catcatctgg tgagaatgac 900

caagacttca tggatgttat gttgtcgatt attgaggaga ccaagttgtc tggccgtgat 960

gctgatactg ttattaaagc tacttgcttg gccatgatca tgggtgggac agacaccacg 1020

gcggtgagtc taacatggat cgtctcttta ctgatgaaca atcgtcatgt actgaagaag 1080

gctagagaag aattggacgc gctcgtgggg aaggatagac aagtggaaga ttcagatttg 1140

aagaatttgg tgtacatgaa tgccatcgtc aaggaaacga tgcgattatt cccattgggt 1200

gctcttcttg aacgtgaaac caaggaggac tgtgaggttg gtgggttcca gctccaaggt 1260

ggttcgcgtt tactagtgaa tgtatggaag ttacagcgag accccaacgt gtggtcggat 1320

ccaacagagt ttagaccaga gagatttcta tcggagaatg cggatataga cgtcgggggt 1380

caacatttcg aactactacc atttggggcc ggtagaaggg tgtgcccggg agtgtcgttc 1440

gcgctccaat tcatgcattt ggtactggct cgtctcatcc atggctatga attgggaacc 1500

cagaatgatg aggatgtgga tttaactgag agcacagaag gacatgttaa ccacaaagca 1560

tcccccctcg atctcatcct caccccacgc ctccatccca agctttatga gtattag 1617

<210> 4

<211> 2127

<212> DNA

<213> CuCPR

<400> 4

atgcaatcgg aatccagttc tatgaaggct tctccatttg acttcatgtc ggctataatt 60

aagggcagga tggatccgtc taattcttca tttcaatcga ctggcgaggg tgcctcagtt 120

attttcgaga atcgcgagct ggttgcgatc ttaactacct cgatcgctgt catgattggc 180

tgctttgttg ttcttgtgtg gcgaagatcc ggaaatcgaa aagttaagac tatagagctt 240

cctaagccgt tgcttgggaa ggagccagag ccagaagttg acgacgggaa gaagaaggtt 300

acgatattct ttggtacgca gactggtact gctgaaggct ttgcaaaggc tctatctgac 360

gaggcgaaag cacggtacga taaggccaag tttagagttg ttgatttgga tgattatggg 420

gctgacgaag atgaatacga acaaaaattg aaaaaggagt ctgtagctgt tttcttcttg 480

gcaacgtatg gcgatggaga gcccactgat aatgccgcaa gattctataa atggttcacc 540

gagggtaaag agagagggga atgtcttcag aacctcaatt atgcagtctt tggccttggc 600

aaccgacaat atgagcattt taataagatt gcaaaagtgg ttgatgagct gcttgagact 660

cagggtggta agcgccttgt aaaagttgga cttggagatg acgatcagtg catagaggat 720

gacttctctg cttggcgaga atcattgtgg cctgagttgg atcaattgct tcgggatgag 780

gatgatgcag caactgtgac cacaccttac acagctgcca tatcagaata ccgagtggta 840

ttccatgatc cttcagatgt aactgatgac aaaaagaact ggatgaatgc aaatggtcat 900

gctgtacatg acgcacaaca tccattcaga tctaatgtgg ttgtgagaaa ggagctccat 960

acacctgcgt ctgatcgttc ttgtactcat ctagagtttg atatttctga gtctgcactc 1020

aaatatgaaa caggggatca tgttggtgtt tactgtgaaa atttaaccga gactgttgat 1080

gaggctctaa atttattggg tttgtctcct gaaacgtatt tctccattca tactgataat 1140

gaggatggca cccaactagg tggaagctct ttaccacctc cttttccatc ctgcaccctc 1200

agaacagcat tgactcgata tgcagatctt ttaaattcac ccaaaaagtc agcattgctc 1260

gcattagcag cacatgcttc aaatcctata gaggctgacc gattaagata tcttgcatca 1320

cctgctggga aggatgaata ttctcagtct gtggttggta gccagaaaag cctgcttgaa 1380

gtcatggctg aatttccttc tgccaagcct ccacttggtg tcttctttgc agctgttgca 1440

ccacgtttac agcctcgatt ctactccata tcatcatctc caaggatggc tccatctaga 1500

attcatgtta cttgtgctct tgtctatgac aaaatgccaa ctggacgtat tcataaagga 1560

atttgctcta cttggatgaa gaattctgtg cccatggaga aaatccatga gtgcagttgg 1620

gctccaattt ttgtgaggca atcaaacttc aagcttcctt ctgatagtaa agtgcctatt 1680

atcatggttg gtcctggaac tggattggct cctttcagag gtttcttaca ggaaagatta 1740

gctttgaaag aatctggagt agaattgggg ccttccatat tgttctttgg atgcagaaac 1800

cgtgcaatgg attatatata cgaggatgag ctgaacaact ttgtcgagac tggtgctctc 1860

tccgagttgg ttatcgcctt ctcgcgtgaa ggtccaacga aagaatacgt gcaacataaa 1920

atgacagaga aggcgtcaga catctggaat ttgatatcac aaggtgctta cttatatgta 1980

tgcggtgatg caaagggaat ggctagagac gtccacagaa ctctccacac catcgtgcaa 2040

gaacagggat ctcttgacag ctcgaaagct gagagcatgg tgaagaatct acaaacgagc 2100

ggaaggtatc tgcgtgatgt gtggtga 2127

<210> 5

<211> 708

<212> PRT

<213> CuCPR

<400> 5

Met Gln Ser Glu Ser Ser Ser Met Lys Ala Ser Pro Phe Asp Phe Met

1 5 10 15

Ser Ala Ile Ile Lys Gly Arg Met Asp Pro Ser Asn Ser Ser Phe Gln

20 25 30

Ser Thr Gly Glu Gly Ala Ser Val Ile Phe Glu Asn Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ile Leu Thr Thr Ser Ile Ala Val Met Ile Gly Cys Phe Val Val

50 55 60

Leu Val Trp Arg Arg Ser Gly Asn Arg Lys Val Lys Thr Ile Glu Leu

65 70 75 80

Pro Lys Pro Leu Leu Gly Lys Glu Pro Glu Pro Glu Val Asp Asp Gly

85 90 95

Lys Lys Lys Val Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu

100 105 110

Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ser Asp Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Asp Lys

115 120 125

Ala Lys Phe Arg Val Val Asp Leu Asp Asp Tyr Gly Ala Asp Glu Asp

130 135 140

Glu Tyr Glu Gln Lys Leu Lys Lys Glu Ser Val Ala Val Phe Phe Leu

145 150 155 160

Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr

165 170 175

Lys Trp Phe Thr Glu Gly Lys Glu Arg Gly Glu Cys Leu Gln Asn Leu

180 185 190

Asn Tyr Ala Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn

195 200 205

Lys Ile Ala Lys Val Val Asp Glu Leu Leu Glu Thr Gln Gly Gly Lys

210 215 220

Arg Leu Val Lys Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp

225 230 235 240

Asp Phe Ser Ala Trp Arg Glu Ser Leu Trp Pro Glu Leu Asp Gln Leu

245 250 255

Leu Arg Asp Glu Asp Asp Ala Ala Thr Val Thr Thr Pro Tyr Thr Ala

260 265 270

Ala Ile Ser Glu Tyr Arg Val Val Phe His Asp Pro Ser Asp Val Thr

275 280 285

Asp Asp Lys Lys Asn Trp Met Asn Ala Asn Gly His Ala Val His Asp

290 295 300

Ala Gln His Pro Phe Arg Ser Asn Val Val Val Arg Lys Glu Leu His

305 310 315 320

Thr Pro Ala Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe Asp Ile Ser

325 330 335

Glu Ser Ala Leu Lys Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Cys

340 345 350

Glu Asn Leu Thr Glu Thr Val Asp Glu Ala Leu Asn Leu Leu Gly Leu

355 360 365

Ser Pro Glu Thr Tyr Phe Ser Ile His Thr Asp Asn Glu Asp Gly Thr

370 375 380

Gln Leu Gly Gly Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Ser Cys Thr Leu

385 390 395 400

Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Asn Ser Pro Lys Lys

405 410 415

Ser Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asn Pro Ile Glu Ala

420 425 430

Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ser

435 440 445

Gln Ser Val Val Gly Ser Gln Lys Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu

450 455 460

Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Val Ala

465 470 475 480

Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met

485 490 495

Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Asp Lys Met

500 505 510

Pro Thr Gly Arg Ile His Lys Gly Ile Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn

515 520 525

Ser Val Pro Met Glu Lys Ile His Glu Cys Ser Trp Ala Pro Ile Phe

530 535 540

Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser Lys Val Pro Ile

545 550 555 560

Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu

565 570 575

Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys Glu Ser Gly Val Glu Leu Gly Pro Ser

580 585 590

Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Ala Met Asp Tyr Ile Tyr Glu

595 600 605

Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val Glu Thr Gly Ala Leu Ser Glu Leu Val

610 615 620

Ile Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys

625 630 635 640

Met Thr Glu Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Leu Ile Ser Gln Gly Ala

645 650 655

Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His

660 665 670

Arg Thr Leu His Thr Ile Val Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp Ser Ser

675 680 685

Lys Ala Glu Ser Met Val Lys Asn Leu Gln Thr Ser Gly Arg Tyr Leu

690 695 700

Arg Asp Val Trp

705

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-F

<400> 6

ttaagcttgg taccgatggc agctttgttg gctttg 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> MC11229opt-His-R

<400> 7

gatgcggccc tctagttaat attcatacaa ttttgg 36

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> MC11229-Ura-F

<400> 8

ggaatattaa gcttgatggc tgctcttctt gccttggt 38

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> MC11229-Ura-R

<400> 9

gatgcggccc tctagctaat actcataaag cttgggatgg aggcgtgg 48

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> PYES2-Detect-F

<400> 10

accccggatc ggactactag c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> PYES2-Detect-R

<400> 11

tccttccttt tcggttagag cgga 24

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-F

<400> 12

ggaatattaa gcttgatgca atcggaatcc agttct 36

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> CuCPR-Leu-R

<400> 13

gatgcggccc tctagtcacc acacatcacg cagata 36

Claims

1.一种博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列，其特征在于，所述优化序列为对普罗托品-6-羟基化酶基因MC11229进行密码子优化后得到，记为MC11229opt，其包含如SEQID No.1所示的核苷酸序列；MC11229包含如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列，其特征在于，所述优化序列MC11229opt表达的氨基酸包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.一种含有权利要求1所述博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的含有所述博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的重组表达载体，其特征在于，其质粒选自PYES2。

5.一种含有权利要求1所述博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的酵母工程菌株。

6.根据权利要求5所述的含有博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的酵母工程菌株，其特征在于，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

7.一种含有权利要求3所述含有博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的重组表达载体的酵母工程菌株。

8.根据权利要求7所述的含有博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的重组表达载体的酵母工程菌株，其特征在于，所述酵母工程菌株的宿主菌选自酵母菌株ivf。

9.如权利要求1所述的博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt、如权利要求3所述的重组表达载体或如权利要求5所述酵母工程菌在制备二氢血根碱/血根碱中的应用。

10.采用权利要求1所述博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列制备二氢血根碱/血根碱的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将上述含有博落回普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt与辅酶基因构建到表达载体PYES2上，然后转入酵母工程菌中，获得含有普罗托品-6-羟基化酶基因优化序列MC11229opt的重组表达载体的酵母工程菌株；

(2)以pH＝8.0的TE缓冲溶液作为前体溶液，加入10μmol/L～2mmol/L原阿片碱作为底物，前体饲喂步骤(1)构建的酵母工程菌；温度30°，发酵培养24小时；

(3)收集培养后的酵母工程菌，裂解菌体、分离纯化，即得。