CN109402148A - 过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用 - Google Patents

过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用，本发明的方法是通过PCR技术扩增博落回中参与生物碱代谢的关键基因小檗碱桥接酶(BBE)全长编码序列并结合In‑Fusion同源重组法高效率载体构建技术将博落回中BBE基因成功整合到植物表达载体pCAMBIA2301D，然后利用农杆菌介导的方法将表达载体导入至博落回外植体中，以提高博落回中BAIs(苄基异喹啉类生物碱)的含量。本发明方法获得的过表达博落回阳性植株中的一些BAIs，如(S)‑网状番荔枝碱、(S)‑金黄紫堇碱、(S)‑华紫堇碱、(S)‑四氢非洲防己碱的含量均得到了显著提高，约提高3倍左右，能为深入研究BBE基因功能和提高博落回中苄基异喹啉类生物碱的含量提供前期基础。

Description

过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用
技术领域
本发明涉及涉及一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用，属于基因工程及分子生物学技术领域。
技术背景
药用植物是我国传统医学中具有防病治病的疗效而作为药物来源的植物，在我国医学中具有非常重要的地位。许多药用植物的有效成分就是它的次生代谢产物，由于其独特的疗效以及毒副作用小等特点引起了广泛关注。我国野生药用植物资源种类丰富，但是由于近年来自然环境的破坏加上对药用植物供不应求而致使的过度开采和滥用，导致我国的药用植物资源濒临枯竭。野生资源已经不能满足人们的需求，而人工栽培中又存在活性成分减少以及品种退化的问题，所以利用生物技术来调控药用植物的次生代谢能够有效的改善植物的代谢途径、提高植物的抗病性、抗逆性、其有效成分含量、药物的药效、产量以及品质，对于优化药用植物种质资源以及可持续发展具有重要的意义。
博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)系罂粟科博落回属多年生大型草本植物，主要生长在低山林中、灌丛中或草丛间，是一种野生的药用植物。国内外许多有关博落回化学成分的研究表明，博落回属植物的化学成分中，生物碱是最主要的次生代谢产物，其中主要包括了原阿片碱、血根碱、白屈菜红碱、小檗碱、别隐品碱、黄连碱、二氢血根碱、二氢白屈菜红碱等等。这些生物碱都具备各种用途以及多种药理作用，属于异喹啉类生物碱。研究表明，其中最主要的血根碱、博落回碱以及小檗碱具有广谱抑菌的作用。另外，博落回中还有一些其他的物质如糖类、三萜化合物、甾体、挥发油、黄酮及其苷、氨基酸、蛋白质等等。因此博落回不仅具有较高的生态以及药用价值，而且具备较高的经济效益，近年来作为饲料添加剂收到广泛的关注，博落回的需求量逐年增长。然而，随着野生资源的不断开采，使得博落回资源的野生储备量逐年递减。
苄基异喹啉类生物碱(Benzyl isoquinoline alkaloids，以下简称BIAs)是药用植物中比较重要且分布广泛、结构数目多、生理活性广的一类生物碱，它在植物次生代谢产物中是一个多样化的群体且有着很长的研究历史。许多苄基异喹啉类生物碱的药用功能已经被开发了长达数个世纪，其中包括麻醉镇痛剂可待因和吗啡，镇咳与抗癌药物那可丁，以及具有抗菌和抗肿瘤作用的小檗碱和血根碱。除此以外，其他的许多BIAs还具有抗氧化活性和中枢神经抑制剂，甚至在抗艾滋病治疗中发挥作用。苄基异喹啉类生物碱属于异喹啉类生物碱，生源合成前体是苯丙氨酸和酪氨酸。根据母核结构的结构差异可将苄基异喹啉类生物碱分为二十类，主要包括：(1)苄基异喹啉类生物碱，如罂粟中的罂粟碱、乌头中的去甲乌药碱；(2)小檗碱和原小檗碱类生物碱，如延胡索中延胡索乙素；(3)吗啡类生物碱，如青藤中的青藤碱、罂粟中的可待因；(4)苯并菲啶类生物碱，如白屈菜中的白屈菜碱；(5)双苄基异喹啉类生物碱，如粉防己中的粉防己碱；这些生物碱主要分布于防己科、毛梗科、罂粟科、小檗科、木兰科、芸香科、樟科和番荔枝科等。
在BIAs的生物合成途径中，一般都以氨基酸作为初始前体，再经过一系列的酶催化反应生成不同的化合物。以吗啡、可待因、血根碱、白屈菜红碱、小檗碱(Berberine)和延胡索乙素(Tetrahydropalmatine)为例，它们共同的生源合成前体是酪氨酸，从2种酪氨酸的衍生物多巴胺(Dopamine)和4-羟基苯乙醛(4-Hydroxyphenylacrtaldehyde)开始，经去甲乌药碱合成酶(NCS)缩合作用生成去甲乌药碱，再经过3个甲基转移酶(6OMT,CNMT,4OMT)和一个细胞色素P450氧化还原酶(NMCH)生成这些化合物的一个共同中间体(S)-网状番荔枝碱((S)-reticuline)。之后，由小檗碱桥酶(BBE)催化生成的(S)-金黄紫堇碱((S)-Scoulerine)是血根碱、白屈菜红碱、小檗碱和延胡索乙素的共同中间体。这4种生物碱中血根碱和白屈菜红碱的合成途径类似，从(S)-Scoulerine开始，都是经过6步酶催化反应，且最后4步的酶相同(TNMT,MSH,P6H,DBOX)，不同的是血根碱合成途径中的前两步是2个P450(CFS,SPS)催化的反应，而白屈菜红碱是由1个甲基转移酶(SOMT)和1个P450(TDC)催化的反应。小檗碱与延胡索乙素从共同的中间体四氢非洲防己碱开始合成，小檗碱经过1个P450(Cyp719A19)和1个黄素蛋白氧化酶(STOX)催化生成。延胡索乙素经过1个甲基转移酶(CoOMT)催化生成。与原小檗碱类和苯并菲啶类的合成途径不同，吗啡的生物合成需要将(S)-网状番荔枝碱同分异构化为(R)-网状番荔枝碱后，经过1个P450(SalSyn)、1个NADPH依赖型还原酶(SalR)、1个乙酰转移酶(SalAT)、2个双加氧酶(CODM,T6ODM)和1个脱氢酶(M6D)催化生成。
小檗碱桥接酶(BBE)，是BIAs生物合成通路中的一个关键酶，它调控着这个生物合成途径中的关键中间体(S)-网状番荔枝碱形成原小檗碱和苯并菲啶类生物碱的过程，是许多苄基异喹啉类生物碱(BIAs)如血根碱、白屈菜红碱、吗啡、小檗碱的关键中间产物。在博落回中，血根碱生物合成的第一步就是由BBE催化的，(S)-网状番荔枝碱是血根碱和吗啡生物合成的最后一种常见中间体。BBE能够催化(S)-网状番荔枝碱的N-甲基环化从而形成金黄紫堇碱，金黄紫堇碱是完整的碳环。它不仅是提供原小檗碱类生物碱合成的基本骨架，也是许多生物碱合成的前体物质，例如小檗碱以及苯并菲啶类生物碱。有研究显示，在罂粟、黄连等物种中的BBE均为合成通路中的限速酶，在罂粟和黄连中过表达该基因均能提高苄基异喹啉类生物碱的含量，具有十分重要的应用价值。
本发明拟提供一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
提供一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，具体包括如下步骤：
S1、目的基因克隆：对博落回体内催化(S)-网状番荔枝碱，产生(S)-金黄紫堇碱的功能基因McBBE，即目的基因，进行克隆；基因McBBE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
S2、过表达载体构建：利用双酶切对表达载体进行酶切，然后进行Infusion反应将步骤S1克隆的目的基因McBBE整合到切割好的表达载体中，构成过表达载体；
S3、农杆菌转化以及过表达博落回阳性植株的获得：
S31、农杆菌的转化：将构建好的过表达载体加入到已在冰上融化的农杆菌感受态中进行转化，然后对转化完成的农杆菌进行培养，接着挑取已长出的单菌落做菌落PCR鉴定，选择阳性菌落标号并进行PCR克隆，然后测序、培养、保存，即制得农杆菌浸染液；
S32、用转化后的农杆菌真空介导法浸染博落回外植体：用步骤S31制备好的农杆菌侵染液倒入博落回无菌组培苗外植体浸染，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；
S33、培养获得博落回植株：将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织；待愈伤组织分化长出抗性芽然后转至生根筛选培养基进行扩繁；
S34、采用GUS染色筛选过表达博落回阳性植株。
上述方案中：In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术；GUS为葡萄糖苷酶(Glucosidase)的英文缩写，这里是指一种应用GUS的基因标记技术。
进一步地，步骤S2具体：
配置双酶切反应体系，采用两种内切酶切割表达载体，之后通过Infusion反应连接目的基因McBBE，然后将连接好的产物转入大肠杆菌感受态中，之后用已转化的大肠杆菌菌液提取的质粒，以McBBE-F为上游引物、McBBE-R下游引物进行PCR扩增反应，然后采用凝胶电泳对扩增产物进行检测，若大肠杆菌中的表达载体中已经成功导入目的基因McBBE形成新的过表达载体，则可作为下一步导入农杆菌的载体。
进一步地，
步骤S33中将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织的方法具体为：
(1)浸染完成后除去菌液，用无菌滤纸吸干无菌组培苗外植体表面菌液，然后将其转移至含有AS(乙酰丁香酮)的固体培养基中；
(2)培养3～4天后，用MS培养基清洗外植体，吸干其表面水分，转移至含有50mg/LKM(卡那霉素)和400mg/L Tic(特美汀)的MS培养基上进行暗培养；
(3)根据农杆菌覆盖情况，重复步骤(2)进行脱菌处理，继代培养直至无菌，15天进行一次继代培养；
(4)暗培养条件下培养三周，无菌组培苗外植体长出愈伤组织，待其抗性芽长至2-2.5cm，转至光培养条件下培养，将单株转至生根培养基上进行扩繁即得；所述生根培养基为含有50mg/L KM(卡那霉素)、300mg/L Tic(特美汀)、5.7mmol/L IAA(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)、5mmol/LKT(kinetin，激动素，一种人工合成的细胞分裂素)以及5mmol/L2,4-D(2，4-二氯苯氧乙酸，一种生长素类似物)的MS培养基。
进一步地，
步骤S34中制备博落回无菌组培苗外植体的方法为：
将采摘的博落回外植体进行消毒灭菌处理；然后在无菌工作台中，在博落回外植体上轻划伤口后接种到MS固体培养基(市场上直接购买的MS加水调节成4.42g/L，加30g/L蔗糖，调节pH＝5.8，加入0.3％植物凝胶调成固体培养基)上，置于25℃暗培养箱中培养；待长出愈伤，置于25℃光暗结合培养长出无菌组培苗，然后对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。
进一步地，
步骤S34中的博落回无菌组培苗外植体为新鲜的博落回组培无菌苗叶片或新鲜的博落回组培无菌苗茎段；优选博落回组培无菌苗茎段。
在抽真空的条件下，博落回茎段的发愈伤能力远远高于叶片，原因可能是茎段伤口处本身就有待分化的叶柄细胞，茎也是营养物质的输送器官，即使在带有抗性的筛选培养基上也能给叶柄细胞提供营养物质，所以使得茎段的存活率比叶片高。
优选的，步骤S2中双酶切采用KpnI-HF、XBaI-HF两种内切酶。
优选的，步骤S2中的表达载体采用PCAMBIA2301(一种商业表达载体)。
本发明还提供上述过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法的应用，具体是在制备异喹啉类生物碱中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明通过PCR技术扩增博落回中参与生物碱代谢的关键基因小檗碱桥接酶(BBE)全长编码序列并结合In-Fusion同源重组法高效率载体构建技术将博落回中BBE基因成功整合到植物表达载体pCAMBIA2301D，然后利用农杆菌介导的方法将表达载体导入至博落回外植体中。本发明方法获得的过表达博落回阳性植株中(S)-网状番荔枝碱、(S)-金黄紫堇碱、(S)-华紫堇碱、(S)-四氢非洲防己碱的含量均得到了显著提高，约提高3倍左右，这几种生物碱是博落回中的苄基异喹啉类生物碱，也是血根碱、白屈菜红碱、小檗碱合成的重要共同前体物质，为进一步开发博落回资源提供前期研究基础。
2、本实验在前期已建立的博落回遗传转化体系的基础上，对博落回遗传转化体系进行进一步优化，利用抽真空的辅助方式对博落回无菌组培苗外植体(叶片、茎段)进行侵染，可以有效提高外植体的愈伤诱导率和转化率，且博落回茎段的愈伤诱导率以及转化率要优于博落回叶片。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为表达载体pCAMBIA2301D的载体图；
图2为2301-McBBE大肠杆菌质粒PCR电泳图；其中,M：DL 2000DNA Marker；1～4：转化成功质粒；5：未转化成功质粒；
图3为2301-PsBBE大肠杆菌提质粒电泳图；其中，M：DL 2000DNA Marker；1～4：转化成功质粒，5：未转化成功质粒；
图4为G2301-McBBE的电泳检测结果；其中，M：DL 5000DNA Marker；1～5：转化成功的单菌落；
图5为G2301-PsBBE的电泳检测结果；其中，M：DL 5000DNA Marker；1～5：转化成功的单菌落；
图6为G2301的电泳检测结果；其中，M：DL 2000DNA Marker；1～5：转化成功的单菌落；
图7为过表达BBE的博落回叶片、茎段与未进行BBE过表达的博落回叶片、茎段在筛选培养基上的分化情况，其中，A：过表达BBE博落回叶片；B：未进行BBE过表达的博落回叶片；C：过表达博落回茎段；D：未进行过表达的博落回茎段；
图8为侵染后的博落回茎段(过表达博落回)在抗性培养基上产生的愈伤组织以及幼苗的形态；A-D为不同时期产生的愈伤组织以及幼苗的形态；
图9a为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中(S)-网状番荔枝碱含量比较；
图9b为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中(S)-金黄紫堇碱含量比较；
图9c为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中(S)-华紫堇碱含量比较；
图9d为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中(S)-四氢非洲防己碱含量比较；
图10为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中BBE基因相对表达量；
图11为阳性的McBBE植株、PSBBE植株以及转入空载体的植株和普通非转基因博落回植株中SMT基因相对表达量。
具体实施方式
为了更好地阐述该发明的内容，下面通过具体实施例对本发明进一步的验证。
一、McBBE和PsBBE基因的克隆
1.1材料
1.1.1试剂
植物多糖多酚总RNA提取试剂盒(TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit)购自天根生物有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit)、cDNA反转录试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司。dsRNA HS Assay Kit、Taq酶购自购于宝生物工程(大连)有限公司。In-HD Cloning Kit、限制性内切酶KpnI-HF和XbaI-HF购自NEB,DNAmarker购自天根生物有限公司。无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。PsBBE(罂粟体内小檗碱桥接酶)基因片段合成于金瑞斯生物科技有限公司，PsBBE的基因序列如下SEQ ID NO：2所示。
1.1.2引物设计
根据infusion原理设计的McBBE和PsBBE基因上下游引物由上海生工合成(表1-1)并参见序列SEQ ID NO：3-6.
表1-1 PCR引物序列
1.1.3仪器
PCR扩增仪(Applied Biosystems，2720Thermal Cycler)；凝胶成像系统(东胜创新生物科技有限公司，Bio-Imaging Systems 910)；移液枪(德国Eppendorf公司)；电泳仪(美国Bio-RAD)；超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司，CJ-1D)；旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂，XM-80A)。
1.2方法
1.2.1RNA的提取
植物多糖多酚总RNA提取试剂盒以博落回叶片为材料进行RNA提取。
1.2.2总RNA反转录成cDNA
使用PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒将上一步提取到的总RNA反转录成双链cDNA。转录完成后置于-20℃保存，备用。
1.2.3McBBE和PsBBE基因的克隆
选用合成的McBBE-F、McBBE-R引物和PsBBE-F、PsBBE-R引物分别对McBBE和PsBBE基因进行扩增，PCR反应体系如下表1-2所示：
表1-2 McBBE和PsBBE基因PCR扩增体系
反应条件如下表1-3所示：
表1-3 PCR扩增循环反应
扩增后的产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，120V，20min。
1.2.4目的基因片段胶回收
扩增出来的目的条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit)进行胶回收。
1.2.5含量测定
回收好的目的片段用2.0Fluorometer进行含量测定。
上述以博落回的叶片为材料提取的RNA，经过凝胶电泳检测，表明McBBE、PsBBE的RNA具有良好的完整性，即可继续进行下一步的实验。
二、载体构建
2.1材料
2.1.1试剂与实验材料
Q5酶、限制性内切酶KpnI-HF、XBaI、Sph-HF购自New England Biolabs(NEB)公司。In-HD Cloning Kit、限制性内切酶KpnI-HF和XbaI-HF购自NEB公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)。Taq酶购自购于宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒(TIANprep mini plasmid kit)。大肠杆菌感受态(Escheriachia coil)DH5α购于天根生化科技(北京)有限公司。ZymocleanTM Gel DNARecovery Kit购自北京天漠科技开发有限公司。YEAST EXTRACT、TRYPTON、Agar均购自Thermo Fisher Scientific公司。NaCl购自国药集团化学试剂有限公司。PCAMBIA2301D植物表达载体为本实验室改造保存。
氨苄青霉素(Amp)配置成母液(100mg/mL)：称取1g Amp粉末，加无菌蒸馏水定容至10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL每管，-20℃保存。
2.1.2引物设计
根据infusion引物的设计原则分别设计McBBE、PsBBE基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成，引物序列见(表2-1)并参见序列SEQ ID NO：3-6。
表2-1 PCR引物序列
2.1.3培养基
LB固体培养基：200ml超纯水，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，2gNaCl，溶解在200mL蒸馏水中，用1mol/LNaOH调至pH＝5.8，加3g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。
LB液体培养基：200ml超纯水，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，2gNaCl，溶解在200mL蒸馏水中，用1mol/LNaOH调至pH＝5.8，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2.2方法
2.2.1双酶切植物表达载体
用KpnI-HF、XBaI-HF两种内切酶切植物表达载体PCAMBIA2301D，反应体系如下表2-2所示：
表2-2双酶切反应体系
将配制好的反应体系放于PCR或者恒温水浴锅中，37℃孵育30min。取出的产物后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后用ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit试剂盒进行载体PCAMBIA2301D胶回收。
2.2.2PCAMBIA2301D表达载体的含量测定
用2.0Fluorometer对回收好的目的片段进行含量测定。
2.2.3infusion连接目的基因
用In-HD Cloning Kit，试剂盒连接载体PCAMBIA2301D和目的基因片段McBBE和PsBBE，反应体系如下表2-3所示：
表2-3 Infusion反应体系
计算候选基因体积网站：
http://www.clontech.com/US/Support/xxclt_onlineToolsLoad.jsp？citemId ＝http://bioinfo.clontech.com/infusion/molarRatio.do&section＝16260&xxheight ＝750根据载体和目的基因的片段大小，计算出载体和基因所需的浓度。再根据3.2.2所测得的基因和载体的含量，计算出相应的体积，加入Infusion酶充分混匀后，整个过程于冰上操作，将连接好的产物置于PCR仪上，50℃放置20min。在10min时取出-80°冰箱保存的大肠杆菌感受态DH5α放于冰上溶解。
2.2.4转大肠杆菌
在超净工作台内将连接好的产物转入大肠杆菌感受态中。
2.2.5阳性克隆体系的检测
抗性培养基经过过夜的暗培养后，培养基上长出许多圆润单菌落，随机挑选长势良好的5个单菌落进行标号：1、2、3、4、5，然后进行菌落PCR阳性鉴定，PCR体系如下表2-4所示：
表2-4 PCR检测阳性克隆体系
扩增体系如下表2-5所示：
表2-5 PCR扩增循环反应
将扩增完的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，挑取初步检测正确且明亮条带对应序号的菌落进行菌落小摇，即在超净工作台内用移液枪枪头挑取单菌落，将枪头打至带有卡那抗性以及利福平抗性的4mlLB培养基中，摇床中37℃，200rpm过夜摇。
2.2.6提质粒测序
先在超净工作台内取800μl培养过夜菌液加200μl甘油，保存于-80℃冰箱。余下3.2ml菌液使用TIANprep mini plasmid kit试剂盒提取质粒。
2.2.7pCAMBIA2301D-McBBE及pCAMBIA2301D-PsBBE表达载体验证
(1)pCAMBIA2301D载体图如附图1所示。Infusion反应后，用已转化的大肠杆菌菌液提取的质粒，以McBBE-F为上游引物、McBBE-R下游引物进行PCR扩增反应，用1％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测结果如图2所示，表明：序号为1、2、3、4的大肠杆菌中的pCAMBIA2301D中已经成功导入目的基因McBBE形成了过表达载体，将标记好序号的质粒，各取20μL然后将其送至上海生工进行测序，将测序结果进行比对，测序结果同样表明序号为1、2、3、4的大肠杆菌已经转入成功，可以作为下一步导入农杆菌的载体。从4℃中选出序号为1的大肠杆菌菌液，保存于-80℃冰箱，将其命名为2301-McBBE。
(2)Infusion反应后，用已转化的大肠杆菌菌液提取的质粒，以PsBBE-F为上游引物、PsBBE-R为下游引物进行PCR扩增反应，用1％的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，检测结果如图3所示，表明：序号为1、2、3、4的大肠杆菌中的pCAMBIA2301 D中已经成功导入目的基因PsBBE形成了过表达载体，将标记好序号的质粒，各取20μL然后将其送至上海生工进行测序，将测序结果进行比对，测序结果同样表明序号为1、2、3、4的大肠杆菌已经转入成功，可以作为下一步导入农杆菌的载体。从4℃中选出序号为2的大肠杆菌菌液，保存于-80℃冰箱，将其命名为2301-PsBBE。
三、农杆菌转化以及博落回过表达植株的获得
3.1材料
3.1.1试剂与实验材料
KM、TIC、AS、RIF、IAA均购于索莱宝公司。KT、2,4-D、植物凝胶购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。MS培养基购自青岛日水生物技术有限公司。蔗糖、CaCl2、NaCl、NaOH购自国药集团化学试剂有限公司。YEAST EXTRACT、TRYPTON、Agar均购自Thermo FisherScientific公司。NaH2PO4、DMSO均购自上海生工生物工程有限公司。农杆菌GV3101感受态(由本实验室自制并保存)。博落回组培苗(由本实验室保存，光照时间为16h/d，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃)。10×PBS、X-Gluc、Triton-X-100、均购于索莱宝公司；亚铁氰化钾购自上海生工生物工程有限公司；铁氰化钾、EDTA购自阿拉丁生物技术有限公司。植物DNA提取试剂盒(TIANGEN DNA secure Plant Kit)购自天根生物有限公司；dsRNAHS Assay Kit、Taq酶购自购于宝生物工程(大连)有限公司；
上述所提KM试剂配制成母液100mg/L，TIC试剂配制200mg/L，AS配制成50mg/L，配制成用0.22μm的无菌滤膜过滤然后分装于-20℃冰箱保存。
3.1.2培养基
LB液体培养基：200ml超纯水，2g胰蛋白胨，1g酵母提取物，2g NaCl，溶解在200mL超纯水中，用1mol/L NaOH调至pH＝5.8，121℃高压蒸汽灭菌20min。
MS固体培养基：1L超纯水，30g蔗糖，4.42gMS培养基溶解于900ml的超纯水中，用1mol/L NaOH调至pH＝5.8，再加水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
3.1.3引物序列
由上海生工设计的McBBE、PSBBE、GUS和NPT等普通PCR上下游引物序列如下表，并参见序列SEQ ID NO：7-14。
表3-1普通PCR引物序列
4.2方法
4.2.1农杆菌感受态的制备
从-80℃取出农杆菌GV3101，制备好农杆菌感受态后，保存于-80℃。此处也可采用购买的农杆菌GV3101感受态。
4.2.2农杆菌的活化
在农杆菌转化前首先取出-80℃条件下保存的农杆菌融化后，进行活化，取活化的菌液1ml至50ml新鲜LB液体培养基中，于摇床28℃，180rpm振荡培养至所需浓度时，一般为当天下午，约7h，0.6<OD600<0.8。5000rpm离心10min，除去上清液，后用无菌水重悬再离心10min，去除上清，再用等体积的MS重悬后使0.6<OD600<0.8即可用于浸染。
4.2.3农杆菌转化
(1)吸取5ul已构建好的植物表达载体2301-McBBE、2301-PsBBE以及空载体2301，将其加入到已在冰上融化的50ul的农杆菌感受态GV3101，用移液枪吹打混匀10秒，冰上静置30min，将其取出放于液氮速冻5min，再移到恒温水浴锅37℃水浴5min，置于冰上冷却2min，然后加入500ul无抗LB培养基，28℃慢摇2～4h；
(2)取出已转化完成的农杆菌，5000rpm，离心5min，移液枪打掉450ul上清液，余下的100ul LB重悬细胞，用涂布棒涂布于LB+K+Rif的平板上，28℃倒置培养26～48h；
(3)挑取已长出的单菌落做菌落PCR鉴定，选择5个阳性菌落标号，进行PCR克隆，然后送至上海生工进行测序。再将对应序号的单菌落每个加4ml的LB+K+Rif液体培养基摇菌，-80℃保存菌种，按序号将其命名。
4.2.4G2301-McBBE、G2301-PsBBE、G-2301农杆菌分别按照如下步骤侵染博落回叶片、茎段：
1)在超净工作台内，取新鲜的博落回组培无菌苗叶片若干片，将其剪成大小0.5×0.5cm左右，每片用刀片在中间部位划几刀，放于锥形瓶中。
2)用制备好的0.6<OD600<0.8的农杆菌侵染液倒入锥形瓶侵染叶片，25℃摇床暗培养120rpm摇10min，随后放入冷冻干燥机抽真空10min。
3)10min后取出锥形瓶，倒去菌液，用无菌滤纸吸干叶片表面菌液，将叶片转至AS固体培养基中，每皿放20片。
4)3天后，用MS培养基清洗叶片，吸干叶片表面水分，转移至MS+50mg/L KM+400mg/L Tic培养上进行暗培养。
5)根据农杆菌覆盖情况，重复上述步骤进行脱菌处理，继代培养直至无菌。
6)15天进行一次继代培养，暗培养6周后统计叶片的存活率以及发愈伤率。
博落回叶片经过侵染后，暗培养条件下培养三周左右，在MS+50mg/L KM+400mg/LTic培养基上诱导长出愈伤组织，待其抗性芽长至2cm左右后，转至光培养条件下培养，将单株转至MS+50mg/L KM+300mg/L Tic+5.7mmol/L IAA+5mmol/L KT+5mmol/L 2,4-D的生根培养基进行扩繁。
实验过程中发现：
如图7所示，在筛选培养基(上述步骤4)中KM+Tic+MS培养基)上，转基因的叶片以及茎段能分化出抗性的愈伤组织，而没有转化的叶片以及茎段则全部褐化死亡。将愈伤组织分化长出的抗性芽转至生根筛选培养基上，进行了过表达的博落回植株均能生根并且正常生长，对照植株则不能。
在筛选培养基上，转基因的茎段的存活率和出愈率都比叶片要高，叶片褐化死亡的数量较多。如图8所示，茎段产生愈伤的部位是两端伤口处，伤口处还有新的叶柄生成，可能原因是茎段伤口处本身就有待分化的叶柄细胞，另外茎也是营养物质的输送器官，即使在带有抗性的筛选培养基上给叶柄细胞提供营养物质，使得在侵染之后茎段的存活率会比叶片高。
4.2.5GUS染色筛选阳性植株
将上述通过侵染后所发愈伤进行培养所获过表达植株各取50株进行GUS染色，根据所需体积进行配置，GUS染色液配置体系如下表3-2所示：
表3-2 GUS染色液配制体系
取博落回组培苗(已成苗)植株50株放入40ml锥形瓶中，对瓶子进行编号，然后加入GUS染色液，使叶片以及茎段全部浸在染色液中，封好膜，放入冷冻干燥机抽真空1h，37℃暗培养箱中孵育放置24～48小时后，用95％乙醇摇床慢摇进行脱色1～3h，在显微镜下拍照观察记录。
由于植株表达载体上有基因筛选标记GUS，通过GUS染色来鉴定阳性植株，成功转入表达载体的植株经过GUS染色后茎段以及叶片呈蓝色，假阳性植株以及对照植株叶片则无色。
在各取的50株植株中，转入McBBE的植株有6株染色成功；转入PsBBE的植株有5株染色成功；转入空载体2301的植株有6株染色成功。
4.2.6PCR检测阳性植株
(1)过表达博落回植株DNA的提取
取100mg的过表达组培苗McBBE、PSBBE植株各20株，2301、对照植株各10株分别放入研钵，加入液氮使叶片充分研磨，将研磨后的材料放入对应编号的无DNA酶离心管中加入缓冲液充分混匀，涡旋振荡，再离心机离心分离，上清液用移液器移至新的无DNA酶离心管中，之后利用CB3吸附柱提取目的DNA，最后将目的DNA溶液收集到对应编号离心管中。
(2)将上一步所提DNA用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，120V，20min，检测提取DNA。然后将DNA完整提出的编号选出进行普通PCR，检测阳性植株。
如图4所示，从过表达组培苗McBBE组中提取出的DNA片段长度为1600bp，序号为1的条带亮度较弱，将序号2、3、4、5送至上海生工测序，将测序结果进行比对，测序结果与电泳图吻合，证明植物表达载体2301-McBBE已成功转入农杆菌GV3101。从-4℃中选出序号为5的农杆菌菌液，保存于-80℃冰箱，将其命名为G2301-McBBE，G2301-McBBE电泳图如图4所示。
如图5所示，从过表达组培苗PsBBE组中提取出的DNA片段长度为1600bp，将序号1、2、3、5送至上海生工测序，将测序结果进行比对，测序结果与电泳图吻合，证明植物表达载体2301-PsBBE已成功转入农杆菌GV3101。从-4℃中选出序号为2的农杆菌菌液，保存于-80℃冰箱，将其命名为G2301-PsBBE。G2301-PsBBE电泳图如图5所示。
如图6所示，空载体2301组的DNA片段长度为730bp，将序号1、2、3、4送至上海生工测序，将测序结果进行比对，测序结果与电泳图吻合，证明空载体2301已成功转入农杆菌GV3101。从-4℃中选出序号为2的农杆菌菌液，保存于-80℃冰箱，将其命名为G2301。G-2301电泳图如图6所示。
五、博落回过表达植株代谢产物分析
5.1材料
5.1.1试剂
标准品:原阿片碱(批号：130-86-9，质量分数：96％)；盐酸白屈菜红碱(批号：111718-200501，纯度＝80.5％)；盐酸血根碱(批号：201101，纯度≥98.0％)和二氢血根碱(批号：3606-45-9，质量分数：96％)均由中国食品药品检定研究院购得。别隐品碱(ALL批号：809101504，纯度＝98.0％)、网状番荔枝碱(批号：BBP03263，纯度96％)、华紫堇碱(批号：00019368-326，纯度98.9％)，四氢非洲防己碱(批号：8-GUY-124-1，纯度98％)由湖南省中药提取工程研究中心提供；二氢白屈菜红碱(DHCHE)、金黄紫堇碱由本实验室分离得到，其纯度经LC-MS和1H-NMR检测大于98％。甲酸(质谱级，上海安谱科学仪器有限公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯(德国默克股份有限公司)；水(Milli-Q水系统)；其他常规化学试剂为国产分析纯产品。
5.1.2材料
第四部分所验证为阳性的McBBE植株、PSBBE植株、转入空载体的植株以及普通非转基因博落回植株。
5.2方法
5.2.1样品的制备
(1)将研钵洗净，180℃烘干3小时；
(2)将转入McBBE、PsBBE和2301的博落回过表达植株以及空白植株分别取5株用液氮研磨成粉放入1.5ml离心管中，放入-80℃冰箱冻存24h；
(3)用保鲜膜将管口封住，戳几个小洞，放入冷冻干燥剂干燥24h；
(4)去皮称重，移至5ml离心管，1mg干样加入5ml无水乙醇，封膜(防止甲醇挥发)，室温，超声提取60min；
(5)高速离心12000rpm，5min，使用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶中，置4℃冰箱保存，待上机检测。
5.2.2标准曲线的制备
使用电子天平精密称取(S)-网状番荔枝碱、(S)-金黄紫堇碱、(S)-华紫堇碱、原阿片碱、(S)-四氢非洲防己碱、二氢血根碱、血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、二氢白屈菜红碱标准品用甲醇稀释溶解配制成10种生物碱的混标储备液(10μg/mL)。吸取适量的混标储备液依次倍比稀释制成浓度分别为2000ng/mL、1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL的标准品溶液。
采用UPLC-QQQ MS(超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法)进行测定，记录色谱峰面积。以峰面积积分值为纵坐标(Y)，质量浓度(ng/mL)为横坐标(X)绘制标准曲线，拟合得到线性回归方程Y＝aX+b。
5.2.3UPLC-QQQ MS分析
色谱条件：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)，流动相：0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)，采用梯度洗脱方式：0-10min，8％-20％B；10-15min，20％B；15-20min，20％-75％B；20-25min，75％-85％B；25-25.1min，85％-95％B；25.1-29.5min，95％-95％B；29.5-30min，95％-8％B；30-35min，8％B；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL。
离子源参数设置：电喷雾离子源(ESI)；离子化模式：正离子模式；毛细管电压：4000V；干燥气和雾化气为氮气发生器制氮气；雾化气温度：335℃；脱溶剂气流量：12L/min；雾化气压力：40psi；检测方式：多反应监测(MRM)。
检测离子：原阿片碱m/z 354.1([M+H]+)→m/z 189.1(Fragment 108V，碰撞能34eV)，血根碱m/z 332.1([M+H]+)→m/z 274(Fragment 141V，碰撞能34eV)。
5.2.4转化率计算方法
生物碱百分含量＝n×c×v×10-6/m×100％
n为稀释倍数；C为生物碱浓度(ng/mL)；v为提取生物碱时加入的甲醇量体积(mL)；m为样品质量(g)，生物碱含量(mg/g)。
5.2.5样品的UPLC-QQQ MS定量分析
用UPLC-QQQ MS对转基因植株进行21种生物碱含量进行定量分析，含量有明显提高的(S)-网状番荔枝碱、(S)-金黄紫堇碱、(S)-华紫堇碱、(S)-四氢非洲防己碱。
如图9所示，转入McBBE基因的博落回植株中(S)-网状番荔枝碱的含量是转入PsBBE基因，2301空质粒以及空白对照植株的3倍多(图9a)。转入McBBE基因的博落回植株中(S)-金黄紫堇碱的含量是转入PsBBE基因，2301空质粒以及空白对照植株的4倍多(图9b)。转入McBBE基因的博落回植株中(S)-华紫堇碱的含量是转入PsBBE基因，2301空质粒以及空白对照植株的3倍多(图9c)。转入McBBE基因的博落回植株中(S)-四氢非洲防己碱的含量是转入PsBBE基因，2301空质粒以及空白对照植株的2倍多(图9d)。
上述分析结果显示：McBBE基因过表达的博落回植株中，(S)-网状番荔枝碱、(S)-金黄紫堇碱、(S)-华紫堇碱以及(S)-四氢非洲防己碱这四种生物碱的含量均明显提高，均提高了3倍左右。这4种含量提高的生物碱均靠近小檗碱桥接酶，可能因为BBE基因的过表达导致合成集中在(S)-金黄紫堇碱的位置，所以(S)-金黄紫堇碱的含量明显提高，所以下游两条分支上的生物碱(S)-华紫堇碱以及(S)-四氢非洲防己碱的含量也明显提高。而转入PsBBE基因的植株的生物碱含量跟转入空载体以及普通非转基因植株中的生物碱含量并无差异，表明罂粟体内克隆出的BBE基因并不能影响博落回通路上苄基异喹啉类生物碱的合成。虽然McBBE基因过表达的博落回植株中血根碱、白屈菜红碱、别隐品碱、原阿片碱的含量并无提高，但是还是能为未来提高上述生物碱含量的研究提供参考。
六、博落回过表达植株荧光定量分析血根碱合成通路基因
6.1材料
6.1.1实验材料
第4部分所验证为阳性的McBBE植株、PSBBE植株、转入空载体的植株以及普通非转基因博落回植株。
6.1.2引物
由上海生工根据荧光定量PCR的引物要求以及McBBE和PSBBE基因的序列设计出的符合荧光定量PCR条件的McBBE、TDC、SMT、CFS、P6H、DBOX、18S等7对基因上下游引物，内参基因选择18S，它是看家基因，在博落回体内能稳定表达，不受环境变化的影响，具体引物序列见表6-1，并参见序列SEQ ID NO：15-28。
表6-1荧光定量PCR引物序列
6.1.3试剂
RT-PCR Buffer(FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)购自Roche公司；植物多糖多酚总RNA提取试剂盒(TIANGEN RNAprep Pure Plant Kit)购自天根生物有限公司；CDNA反转录试剂盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购自宝生物工程(大连)有限公司。
6.2方法
6.2.1过表达博落回植株RNA的提取
6.2.2总RNA反转录成cDNA
6.2.3Q-PCR检测
荧光定量PCR之前先对cDNA进行浓度测定，然后稀释10倍作为模板cDNA，以7个目的基因的上下游引物进行反应，反应体系共25ul，重复两次，体系如下表6-2所示：
表6-2 Q-PCR反应体系
(1)将反转录的单链cDNA模板稀释5～10倍，混匀，离心收集，放于四度待用。将3uM的正向和方向引物混匀，离心收集，放于四度待用。
(2)配制水和RT-PCR Buffer(2×)的混合物
做2次重复：24.5ul(水7ul、RT-PCR Buffer 17.5ul)×检测基因数×模板数
计算出理论值，实际需要多配一些，下一步分样过程中，枪头会损失一些。
(3)第一次分样
做2次重复按24.5×基因数来分。
注意：分样前样品要充分混匀，离心收集。
(4)加入稀释后的模板
把不同的模板加入上述分好的样品中。做两次重复，加入量为3.5ul×基因数目。
(5)第二次分样
将已加入模板的样品，根据基因数目分成相应的数目，做两次重复，按照每个分26ul。
注意：分样前样品需要充分混匀，离心收集。
(6)加入引物
将混好的引物加入上一次的分好的样品中。如果做2次重复，加入量为7ul。
(7)最后一次分样
取出96孔板和膜，注意带手套，不要说话，避免污染。按每个孔15ul加入，记住加样的顺序。加完后封好膜，注意分样前样品需要充分混匀，不要用手去碰膜的中央，瞬时离心，上机操作。实验全程要勤换手套，不要说话，避免污染，将样品按顺序放入荧光定量PCR仪中，注意不能碰到管盖，连接电脑设置程序进行反应，反应结束再收集数据。qPCR反应程序如下表6-3所示：
表6-3 Q-PCR反应程序
6.3结论与分析
用McBBE、TDC、SMT、CFS、P6H、DBOX、18S等7对基因的特异性上下游引物检测这7个基因在博落回血根碱合成通路中的表达情况。
以野生型博落回为空白对照，检测结果如图10所示，McBBE基因转入后，博落回转基因植株中McBBE的基因表达量有明显提高，其表达量是转入PsBBE的植株的3.2倍，空载体的2.6倍，以及空白对照的3倍。转入空载体的植株中McBBE表达量和空白对照中McBBE表达量相差不大。
如图11所示，转入McBBE的博落回植株中紧挨着金黄紫堇碱的下游产物SMT((s)-金黄紫堇碱-O-甲基转移酶)的基因表达量有明显提高，是转入PsBBE的植株的4.4倍，是空载体的5.1倍，是空白对照的5.7倍。而转入PsBBE的植株中SMT的含量和转入空载体的植株以及空白对照植株差异也不大。
因而分析在血根碱合成通路上，BBE基因的过表达导致合成集中在金黄紫堇碱，从而导致下游距离金黄紫堇碱最近的SMT(s-金黄紫堇碱-O-甲基转移酶)基因表达量的明显升高。TDC、CFS、P6H、DBOX等基因含量无明显变化。
以上所述为本发明的具体实施方式，但不能对本发明构成任何限制，因此需特别指出，凡是以本发明为基础，做得任何修改与改进均落在本发明保护范围之内。
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ttagcgaagt tttacgatta tttggaaccg ttcgtgtcga aagaaccaag ggttggttat 1380
gttaatcata ttgatcttga tattggaggg atagattgga gaaataaaag tagtactacc 1440
aatgctgttg agatagctag aaattggggt gaaagatatt tttcatcgaa ttatgaacgt 1500
ttggttaagg ctaagacatt gattgatcca aataatgtgt ttaaccatcc acagagtata 1560
cctccaatga tgaaatttga ggaaatttac atgttgaagg aattgtag 1608
<210> 2
<211> 1608
<212> DNA
<213> 罂粟（Papaver somniferumL.）PsBBE基因序列
<400> 2
atgatgtgca gaagcttaac attacgtttc ttcttattca ttgttttatt acaaacatgc 60
gtacgaggtg gtgatgttaa tgataatctc ctctcgtcat gtttaaactc ccatggtgtt 120
cacaacttca ccacgctatc aaccgataca aattccgact acttcaaact gctgcatgca 180
tccatgcaga acccgttgtt cgcgaagcct acggtatcga aaccgtcgtt tattgtaatg 240
cccggcagca aagaagaatt atcgagcacc gttcattgtt gtacaagaga atcatggact 300
attcgactgc ggagcggcgg tcatagttat gaagggttgt cttatactgc tgatacacct 360
tttgtgattg ttgatatgat gaacttgaat cgaatttcca ttgatgtctt gtcggaaaca 420
gcttgggttg aatctggggc aacacttgga gaactctatt atgcgattgc gcagtcgacg 480
gataccctgg ggtttactgc tggttggtgt ccgactgttg gtagcggagg acatataagc 540
ggtggtggtt ttggtatgat gtcgaggaag tacggattag ctgcggataa tgtcgtggac 600
gcgattctta tagatagcaa tggagcgatt cttgaccgtg aaaaaatggg tgacgatgtt 660
ttttgggcta ttcgtggtgg cggcggaggt gtttggggtg caatttacgc gtggaaaatc 720
aaactattgc cagttccgga gaagctgacc gtttttcgtg tgacaaagaa tgtaggaatc 780
gaagacgctt catctttact tcacaaatgg caatatgttg cagatgaatt agacgaggat 840
tttacggtat ccgtgcttgg gggagtaaac ggaaatgatg cctggttaat gttcttaggc 900
ttacacttgg gacgtaaaga tgctgcgaaa actattatcg atgaaaaatt ccctgaactg 960
gggttagtag ataaagagtt tcaagaaatg agttggggtg aatccatggc tttcttatca 1020
ggattagata ccatctctga actaaacaac aggttcttga aatttgatga aagagctttt 1080
aagactaaag ttgattttac taaagtatca gtacccctaa acgtgtttag acatgcatta 1140
gagatgttat cagaacagcc cggtgggttt atagctctaa atggtttcgg agggaaaatg 1200
agtgaaatta gcactgattt taccccgttt cctcatcgga aaggcactaa attgatgttc 1260
gaatatataa tcgcttggaa ccaagatgaa gaatcgaaaa tcggcgagtt tagcgaatgg 1320
ttagcgaagt tttacgatta tttggaaccg ttcgtgtcga aagaaccaag ggttggttat 1380
gttaatcata ttgatcttga tattggaggg atagattgga gaaataaaag tagtactacc 1440
aatgctgttg agatagctag aaattggggt gaaagatatt tttcatcgaa ttatgaacgt 1500
ttggttaagg ctaagacatt gattgatcca aataatgtgt ttaaccatcc acagagtata 1560
cctccaatga tgaaatttga ggaaatttac atgttgaagg aattgtag 1608
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> McBBE-F引物序列
<400> 3
gttgatagcg gccgcatgga tacaaaaatc agaaac 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> McBBE-R引物序列
<400> 4
gatgttttgc ccgggttgta caattccttc tacatt 36
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> PsBBE-F引物序列
<400> 5
gttgatagcg gccgcatgat gtgcagaagc ttaaca 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> PsBBE-R引物序列
<400> 6
gatgttttgc ccgggcaatt ccttcaacat gtaaat 36
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> McBBE-detect-F引物序列
<400> 7
atggatacaa aaatcagaaa c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> McBBE-detect-R引物序列
<400> 8
ttgtacaatt ccttctacat t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> PsBBE-detect-F引物序列
<400> 9
atgatgtgca gaagcttaac a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> PsBBE-detect-R引物序列
<400> 10
caattccttc aacatgtaaa t 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> GUS-F引物序列
<400> 11
gccatttgaa gccgatgtca cgcc 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> GUS-R引物序列
<400> 12
gttctgcgac gctcacaccg atac 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> NPT-F引物序列
<400> 13
tgctcctgcc gagaaagtat 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> NPT-R引物序列
<400> 14
aatatcacgg gtagccaacg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> McBBE-QP-F引物序列
<400> 15
ttcacagccg gttggtgccc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> McBBE-QP-R引物序列
<400> 16
ccgcctcgga tcgcccaaaa 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> TDC-QP-F引物序列
<400> 17
tggtgggact gccctccaag t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> TDC-QP-R引物序列
<400> 18
tcaggcatgt cgcgagctga a 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> SMT-QP-F引物序列
<400> 19
gccgggaagg agccgaggat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> SMT-QP-R引物序列
<400> 20
tgatgccgcg gatgtgtggg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> CES-QP-F引物序列
<400> 21
aatttgggtc ggttcatggc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> CFS-QP-R引物序列
<400> 22
ggcaccacct tgaagacctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> P6H-QP-F引物序列
<400> 23
caataagcag aataaaaatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> P6H-QP-R引物序列
<400> 24
acggcctcct cctcaccacg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> DBOX-QP-F引物序列
<400> 25
actgttgcca cggtcgatag 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> DBOX-QP-R引物序列
<400> 26
tggaggagct tgtcaacacc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 18S-QP-F引物序列
<400> 27
cttcgggatc ggagtaatga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 18S-QP-R引物序列
<400> 28
gcggagtcct agaagcaaca 20

Claims (8)

1.一种过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、目的基因克隆：对博落回体内催化(S)-网状番荔枝碱，产生(S)-金黄紫堇碱的功能基因McBBE，即目的基因，进行克隆；基因McBBE的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
S2、过表达载体构建：利用双酶切对表达载体进行酶切，然后进行Infusion反应将步骤S1克隆的目的基因McBBE整合到切割好的表达载体中，构成过表达载体；
S3、农杆菌转化以及过表达博落回阳性植株的获得：
S31、农杆菌的转化：将构建好的过表达载体加入到已在冰上融化的农杆菌感受态中进行转化，然后对转化完成的农杆菌进行培养，接着挑取已长出的单菌落做菌落PCR鉴定，选择阳性菌落标号并进行PCR克隆，然后测序、培养、保存，即制得农杆菌浸染液；
S32、用转化后的农杆菌真空介导法浸染博落回外植体：用步骤S31制备好的农杆菌侵染液倒入博落回无菌组培苗外植体浸染，置25～30℃摇床上80～120rpm慢摇8～12min，然后置于真空冷冻干燥机中连续抽真空8～12min；
S33、培养获得博落回植株：将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织；待愈伤组织分化长出抗性芽然后转至生根筛选培养基进行扩繁；
S34、采用GUS染色筛选过表达博落回阳性植株。
2.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：
配置双酶切反应体系，采用两种内切酶切割表达载体，之后通过Infusion反应连接目的基因McBBE，然后将连接好的产物转入大肠杆菌感受态中，之后用已转化的大肠杆菌菌液提取的质粒，以McBBE-F为上游引物、McBBE-R下游引物进行PCR扩增反应，然后采用凝胶电泳对扩增产物进行检测，若大肠杆菌中的表达载体中已经成功导入目的基因McBBE形成新的过表达载体，则可作为下一步导入农杆菌的载体。
3.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，
步骤S33中将浸染后的无菌组培苗外植体培养得到博落回愈伤组织的方法具体为：
(1)浸染完成后除去菌液，用无菌滤纸吸干无菌组培苗外植体表面菌液，然后将其转移至含有AS的固体培养基中；
(2)培养3～4天后，用MS培养基清洗外植体，吸干其表面水分，转移至含有50mg/L KM和400mg/L Tic的MS培养基上进行暗培养；
(3)根据农杆菌覆盖情况，重复步骤(2)进行脱菌处理，继代培养直至无菌，15天进行一次继代培养；
(4)暗培养条件下培养三周，无菌组培苗外植体长出愈伤组织，待其抗性芽长至2-2.5cm，转至光培养条件下培养，将单株转至生根培养基上进行扩繁即得；所述生根培养基为含有50mg/L KM、300mg/L Tic、5.7mmol/L IAA、5mmol/L KT以及5mmol/L 2,4-D的MS培养基。
4.根据权利要求1所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法，其特征在于，
步骤S34中制备博落回无菌组培苗外植体的方法为：
将采摘的博落回外植体进行消毒灭菌处理；然后在无菌工作台中，在博落回外植体上轻划伤口后接种到MS固体培养基上，置于25℃暗培养箱中培养；待长出愈伤，置于25℃光暗结合培养长出无菌组培苗，然后对获得的无菌组培苗通过继代培养或植株再生或外植体引发愈伤的手段进行扩繁。
5.根据权利要求1所述的获取小檗碱桥接酶过表达的博落回植株的方法，其特征在于，
步骤S34中的博落回无菌组培苗外植体为新鲜的博落回组培无菌苗叶片或新鲜的博落回组培无菌苗茎段。
6.根据权利要求1所述的获取小檗碱桥接酶过表达的博落回植株的方法，其特征在于，
步骤S2中双酶切采用KpnI-HF、XBaI-HF两种内切酶。
7.根据权利要求1所述的获取小檗碱桥接酶过表达的博落回植株的方法，其特征在于，
步骤S2中的表达载体采用PCAMBIA2301D。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的过表达小檗碱桥接酶提高博落回中BAIs含量的方法在制备异喹啉类生物碱中的应用。
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