CN109609417A - 提升土壤质量的微生物菌剂，制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物菌剂，其特征在于包含功能菌和保护菌，其中所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens)、绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。还涉及一种提升土壤质量的方法。所述制备方法包括如下步骤：(1)将功能菌、保护菌与生物活性物质按比例混合得到复合菌剂；(2)将步骤(1)所得复合菌剂固定于生物炭上。本发明制得的微生物菌剂在提升土壤有机质含量方面具有非常优异的效果，且方法简单、成本低、无二次污染，可协同降解土壤有机物污染，具有广阔的市场价值。

Description

提升土壤质量的微生物菌剂，制备方法及应用
技术领域
本发明属于环境工程领域，具体地涉及一种提升土壤质量的的微生物菌剂，制备方法及应用。
背景技术
目前，我国有机物污染的程度和面积均呈现增加态势，特别是设施农业的高施肥量和连作种植方式，导致酞酸酯、多环芳烃等有机污染物含量逐年累积，成为影响土壤质量和农产品品质的重要因素。微生物修复技术可利用微生物自身的生命活动，调节或控制生境内的生化反应，进而实现有机污染物的降解和去除，成本低、无二次污染，具有较大的应用潜力。然而，生物修复对于微环境要求较高、修复周期长等特点，仍然制约着土壤质量的快速提升。
发明内容
本发明涉及以下几个方面：
1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌I，所述复合菌I由功能菌和保护菌组成，所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)、绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选地，腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、绿色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的质量比为4∶3∶2∶2∶4。
2.上述1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖(例如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，优选葡萄糖)和氨基酸组成，所述复合菌剂I，糖和氨基酸组成复合菌剂II，优选所述复合菌剂I，糖和氨基酸的质量比是75∶10∶15。
3.上述1-2任一项所述的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭，优选所述生物炭来自植物，更优选来自小麦秸秆，更优选其是通过450℃热解小麦秸秆7h，过120目筛，进一步优选地，复合菌II占生物炭的质量百分比为10％。
4.制备上述3所述的微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将功能菌与保护菌培养至对数生长期，后混匀得到复合菌剂I；
(2)将步骤(1)所得复合菌剂I与生物活性物质混合，得到复合菌剂II；
(3)将步骤(2)所得复合菌剂II，与生物炭混合固定。
5.上述4的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述培养条件为：腐败假单胞菌(S.putrefaciens)和金属还原地杆菌(G.metallireducens)，37℃，厌氧条件；绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)，PDA培养基、30℃、200r.min-1、好氧条件；枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，37℃，好氧条件。
6.上述4-5任一项所述的制备方法，步骤(1)中，所述对数生长期是指腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按权利要求5所述条件培养12h，绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)权利要求5所述条件培养108h。
7.上述4-5任一项所述的制备方法，步骤(3)中，所述固定方法为：将生物炭质量比10％的复合菌剂II加入1g.100mL-1的固定化培养基，温度至30℃，固定时间为18h。
8.上述1-3任一项所述的微生物菌剂在提高土壤有机质含量或促进土壤有机物污染修复中的应用。
9.上述8所述的应用，其中所述有机物选自多环芳烃，多氯联苯，酞酸酯、有机氯农药、石油烃或其组成，优选地，所述多氯联苯选自PCB28(2，4，4’-三氯联苯)、PCB52(2，2’，5，5’-四氯联苯)、PCB101(2，2’，4，5，5’-五氯联苯)、PCB118(2，3’，4，4’，5-五氯联苯)、PCB138(2，2’，3，4，4’，5’-六氯联苯)、PCB153(2，2’，4，4’，5，5’-六氯联苯)和/或PCB180(2，2’，3，4，4’，5，5’-七氯联苯)，所述酞酸酯选自邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和/或邻苯二甲酸正辛酯。
在本发明的具体实施方案中，固定化培养基的组成为：蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5。
在本发明中，生物活性物质用来为微生物提供营养，其中所用的糖是本领域常规用于微生物培养的糖，包括，但不限于葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖。所使用的氨基酸也是本领域常规用于微生物培养的氨基酸。
生物炭是生物有机材料(生物质)在缺氧或绝氧环境中，经高温热裂解后生成的固态产物，其既可作为高品质能源、土壤改良剂，也可作为还原剂、肥料缓释载体及二氧化碳封存剂等，已广泛应用于固碳减排、水源净化、重金属吸附和土壤改良等，可在一定程度上为气候变化、环境污染和土壤功能退化等全球关切的热点问题提供解决方案。本发明针对作物秸秆产量大、处理处置效率低及资源化利用程度低等问题，将秸秆高温炭化制备生物质材料，既避免了秸秆资源的浪费，又提供了新型高效生物质环境材料。
在本发明的研发过程中，本发明的发明人发现利用微生物修复土壤有机污染技术存在普适性差的问题，将微生物固定在生物炭上，可大大提高微生物的菌剂的作用面积，提高对污染物的降解效率。此外，生物炭可作为土壤腐殖质中高度芳香化结构组分的来源，腐殖质的存在会强化微生物菌剂的作用，同时增加土壤中的有机质含量。经过大量的实验探究和反复的实践验证，本发明的发明人发现，经过本发明的微生物菌剂，在降解有机污染物、提高土壤有机质含量、改善土壤营养结构、团粒结构等方面均有优异理想的效果，从而完成了本发明。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
本发明的优点在于本发明的微生物菌剂在降解污染物、提升土壤有机质含量方面都具有非常优异的效果。此外，可经济高效地实现秸秆处理处置，避免二次污染。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
下面列举一些具体实施例，以对本发明的实施和技术效果做更进一步的说明。
以下实施例中所用的菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其它试剂包括氨基酸均是常规购自公司的试剂。
实施例1
(1)微生物菌剂的制备方法：
将腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)和金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)活化，于LB液体培养基中37℃、170r.min-1，厌氧条件培养11h，绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)于液体PDA培养基中30℃、200r.min-1，好氧条件培养108h，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)于LB液体培养基中37℃、180r.min-1，好氧条件培养12h。将上述菌体收集后冻干，将腐败假单胞菌(S.putrefaciens)：金属还原地杆菌(G.metallireducens)：绿色木霉(T.viride)：哈茨木霉(T.harzianum)：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按4∶3∶2∶2∶4质量比混合，得到复合菌剂I，将复合菌剂I：葡萄糖：氨基酸为75∶10∶15质量比混合，得到复合菌剂II
(2)生物炭的制备方法：
将小麦秸秆于450℃马弗炉内热解7h，过120目筛。
(3)微生物菌剂的固定方法：
以生物炭质量比10％的复合菌剂II，加入1g.100mL-1的固定化培养基(蔗糖10g、牛肉膏6g、酵母浸膏1.5g、蒸馏水1000mL，调节pH 7.0～7.5)，调节转速至170r.min-1，温度至30℃，固定时间为18h，离心后的沉淀，采用无菌生理盐水清洗3次，即获得本发明所述微生物菌剂。
该待修复土壤中的有机物主要包括多环芳烃。
将制得的微生物菌剂应用于北京某化工厂附近多环芳烃(PAHs)污染土壤(PAHs总量为352μg·kg-1(218～536μg·kg-1))修复试验，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，添加20％所述菌剂、修复20天的土壤中，多环芳烃含量较未添加菌剂的对照降低了43％，具有明显的促进作用，加快了多环芳烃的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加了7.5％。
实施例2
将实施例1制得的微生物菌剂应用于土壤质量提升试验，以检测该菌剂对土壤质量的改善能力。结果显示，按照质量百分比添加20％所述菌剂、处理20天，处理组有机质含量较未添加菌剂的对照提高了7％以上，增加了土壤中微团粒数量，改善土壤孔隙度，具有明显的改善作用。此外，对土壤环境中有机物(如河北某造纸厂附近多氯联苯(PCBs)污染农田土壤(PCB28、PCB52、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180等7种指示性PCBs平均值为95.82μg/kg)，处理20天后上述多氯联苯含量平均值较未添加菌剂的对照降低了51％)或重金属(如湘潭市某矿区附近Cd污染农田土壤，原始浓度52.69mg/kg，较未添加的样品对Cd的去除率提高了46％)等污染物也具有协同降解作用。
实施例3
将实施例1制得的微生物菌剂应用于北京怀柔区蔬菜大棚酞酸酯污染土壤(邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、邻苯二甲酸正辛酯等6种酞酸酯总浓度为0.58～3.26mg/kg)，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，按照质量百分比添加20％所述菌剂、修复15天的土壤中，6种酞酸酯总浓度较未添加菌剂的对照降低了48％，具有明显的促进作用，加快了酞酸酯的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加了7.3％。
实施例4
重复实施例1的实验，仅是将土壤中的有机物替换为有机氯农药或石油烃等，以检测该菌剂对有机污染物降解的促进能力。结果显示，按质量百分比添加20％所述菌剂、修复20天的土壤中，该有机物含量较未添加菌剂的对照降低(其中含有机氯农药土壤来自山东某农田，其原始含量为65.37μg/kg，添加菌剂后有机氯农药残留含量降低了62％；含石油烃土壤来自黑龙江某采油厂，其原始总量平均值为60.37mg/kg，添加菌剂后石油烃含量降低了83％)，具有明显的促进作用，加快了有机物的降解。此外，处理组土壤有机质含量较对照组增加(其中含有机氯农药土壤有机质含量增加了7.2％；含石油烃土壤有机质含量增加了7.0％)。
按照Environmental，Science&Techology，2017，51，3176-3186的方法，测量上述实施例1-4中有机质(腐殖质)的含量：
腐殖质是土壤有机质中最活跃的部分，腐殖质质量分数的多少，是土壤肥力高低的一项重要标志。因此，本专利中土壤有机质含量以腐殖质含量为代表，参照国际腐殖质协会提供的方法进行测定[1]。具体地：
1、腐殖质的提取
称取土壤样品于离心管中，按1g∶10ml比例加入提取液(0.1MNa4P2O7∶0.1M NaOH，1∶1)并充分混匀，用N2持续吹30min。然后在60℃的恒温水浴中振荡15h，离心弃去下层沉淀物，所得滤液用6M的HCl溶液调pH至1～2，在60℃恒温条件下水浴1h，静置过夜，离心15min，下层沉淀为胡敏酸粗品，上层清液为富里酸溶液。
2、腐殖质的纯化
将胡敏酸粗品通过碱溶酸沉法进行反复沉淀，重复3次后，采用电渗析法除去其中的金属离子，60℃减压浓缩，真空干燥后得到纯的胡敏酸干样；富里酸溶液过大孔吸附树脂(XAD-8)与氢型阳离子交换树脂，然后进行冷冻干燥后得到纯的富里酸干样。将干样称重加和即得到腐殖质含量。

Claims (9)

1.微生物菌剂，其特征在于包含复合菌I，所述复合菌I由功能菌和保护菌组成，所述功能菌由腐败假单胞菌(Shewanella putrefaciens)、金属还原地杆菌(Geobactermetallireducens)、绿色木霉(Trichoderma viride)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)组成，所述保护菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，优选地，腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、绿色木霉(T.viride)、哈茨木霉(T.harzianum)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的质量比为4∶3∶2∶2∶4。
2.权利要求1的微生物菌剂，其特征在于还包含生物活性物质，所述生物活性物质由糖(例如葡萄糖，果糖，乳糖，麦芽糖，优选葡萄糖)和氨基酸组成，所述复合菌剂I，糖和氨基酸组成复合菌剂II，优选所述复合菌剂I，糖和氨基酸的质量比是75∶10∶15。
3.权利要求1-2任一项所述的微生物菌剂，其特征在于还包含生物炭，优选所述生物炭来自植物，更优选来自小麦秸秆，更优选其是通过450℃热解小麦秸秆7h，过120目筛，进一步优选地，复合菌II占生物炭的质量百分比为10％。
4.制备权利要求3所述的微生物菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将功能菌与保护菌培养至对数生长期，后混匀得到复合菌剂I；
(2)将步骤(1)所得复合菌剂I与生物活性物质混合，得到复合菌剂II；
(3)将步骤(2)所得复合菌剂II，与生物炭混合固定。
5.权利要求4的制备方法，其特征在于步骤(1)中，所述培养条件为：腐败假单胞菌(S.putrefaciens)和金属还原地杆菌(G.metallireducens)，37℃，厌氧条件；绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)，PDA培养基、30℃、200r.min-1、好氧条件；枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，37℃，好氧条件。
6.权利要求4-5任一项所述的制备方法，步骤(1)中，所述对数生长期是指腐败假单胞菌(S.putrefaciens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)按权利要求5所述条件培养12h，绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)权利要求5所述条件培养108h。
7.权利要求4-5任一项所述的制备方法，步骤(3)中，所述固定方法为：将生物炭质量比10％的复合菌剂II加入1g.100mL-1的固定化培养基，温度至30℃，固定时间为18h。
8.权利要求1-3任一项所述的微生物菌剂在提高土壤中有机质含量或促进土壤有机物污染修复中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其中所述有机物选自多环芳烃，多氯联苯，酞酸酯、有机氯农药、石油烃或其组合，优选地，所述多氯联苯选自2，4，4’-三氯联苯、2，2’，5，5’-四氯联苯、2，2’，4，5，5’-五氯联苯、2，3’，4，4’，5-五氯联苯、2，2’，3，4，4’，5’-六氯联苯、2，2’，4，4’，5，5’-六氯联苯和/或2，2’，3，4，4’，5，5’-七氯联苯，所述酞酸酯选自邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸丁基苄基酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯和/或邻苯二甲酸正辛酯。
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