CN109602737A - 羟基红花黄色素b在制备治疗胃癌药物中的应用及药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用及药物，涉及药物技术领。本发明公开了一种羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用。本发明还公开了一种治疗胃癌的药物，所述药物的有效成分包括羟基红花黄色素B。所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。所述羟基红花黄色素B提取自植物红花。所述羟基红花黄色素B的化学分子式为C27H32O16。所述羟基红花黄色素B的纯度为98％。本发明通过研究羟基红花黄色素B对胃癌治病机理，首次提出羟基红花黄色素B可用于治疗胃癌，为治疗胃癌又提供一种新的药物。

Description

羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用及药物
技术领域
本发明涉及药物技术领域，尤其涉及一种羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用及药物。
背景技术
胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织/国际癌症研究中心(IARC)公布的统计数据显示，2012年胃癌新增病例95.2万，中国癌症新发病例40.5万，占全球胃癌发病的42.6％；2012年全球范围内胃癌死亡病例72.3万，死亡率为10.2/10万，我国胃癌死亡病例32.5万，死亡率为21.9/10万。可见，胃癌是一种严重危害我国人民身体健康的重大疾病。
肿瘤是一种细胞周期性疾病。细胞周期的调控主要是由细胞周期蛋白(Cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(cyclin-dependent kinases inhibitors,CDKIs)完成，在DNA合成前期(G1期)/DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)/有丝分裂期(M期)，这两个关键性的限制点进行调控。Cyclins异常表达与CDKs结合形成复合物，将导致细胞周期调控异常、细胞增殖失控。Sugui等发现Cyclin D1在胃癌前病变胃腺瘤中阳性表达率高达80％，认为其可能成为胃癌早期诊断的指标。Choi等通过研究166例胃癌组织，发现在胃癌组织中Cyclin E1表达阳性为46.4％～55.93％，显著高于正常胃粘膜中的阳性表达率(10.53％)。Begnami等通过研究482例胃癌组织样本，发现Cyclin A的阳性表达率为69％。可见，胃癌细胞常表现为周期失常，因而可以通过一定手段干预胃癌的细胞周期达到治疗胃癌的目的。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)是有丝分裂原激活激酶(mitogen-activated kinase,MAPK)信号通路中重要的作用分子，参与并调控多种肿瘤的发生发展过程。ERK可以分为ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，通过磷酸化激活而实现其生物效应。研究表明，用ERK1/2抑制剂作用肺腺癌A549细胞后，使ERK1/2活化被抑制，能够显著抑制A549细胞增殖与迁移。
目前，对于胃癌的致病机理及治疗药物的研究还需更多样化，以便开发出更多可用于治疗胃癌的药物。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例提供了一种羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用及药物，主要目的是通过研究治病机理，开发另一种可用于治疗胃癌的药物。
为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：
一方面，本发明实施例提供了一种羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用。
另一方面，本发明实施例提供了一种治疗胃癌的药物，所述药物的有效成分包括羟基红花黄色素B。
作为优选，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。
作为优选，所述羟基红花黄色素B提取自植物红花。
作为优选，所述羟基红花黄色素B的化学分子式为C27H32O16。
作为优选，所述羟基红花黄色素B的纯度为98％。
红花(Carthamus tinctorius L.)又称草红花，为菊科植物干燥的花，具有活血化瘀、祛瘀止痛的功效，是传统的活血化瘀类中药。羟基红花黄色素B(hydroxysaffloryellow B,HSYB)是一种来源于红花中的黄烷酮类化合物。Yue等2014年首次在红花水提物中分离得到一种新的喹诺查尔酮C糖苷类化合物，并将其命名为羟基红花黄色素B，其为羟基红花黄色素A的同分异构体。羟基红花黄色素B分子式为C27H32O16，分子量为611.1612，化学结构如下：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过研究首次证明了HSYB能够有效控制胃癌细胞的增殖，通过阻滞胃癌细胞在G1/S期，其分子机制涉及上调磷酸化ERK表达。证明了HSYB阻滞细胞周期来抑制胃癌细胞增殖的生物学特性，因此本发明具有重要的临床意义。本发明还证明了HSYB是一种ERK调控剂，能够上调磷酸化ERK表达进而导致胃癌细胞周期阻滞，从而达到抑制肿瘤增殖的效果，因此也具有重要的临床意义。本发明通过研究HSYB对胃癌的治病机理，提出了上述羟基红花黄色素B(HSYB)可作为治疗胃癌药物中的有效组分，并结合药学上可接受的载体，形成一种用于治疗胃癌的药物，上述药物的剂型可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。本发明的上述研究为治愈胃癌又提供了一种可靠药物。
附图说明
图1是本发明实施例提供的不同浓度HSYB对胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用(A)及对胃癌SGC-7901细胞集落形成能力的影响图(B，C)，(**表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.01)；
图2是本发明实施例提供的不同浓度的HSYB对胃癌SGC-7901细胞周期的影响图；(A：流式细胞仪检测不同浓度HSYB作用后对胃癌SGC-7901细胞周期的影响；B：蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞周期S期监控点相关蛋白的表达；C：统计学分析图B蛋白条带的相对灰度值(*表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.05，**表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.01)；
图3是本发明实施例提供的不同浓度的HSYB对胃癌SGC-7901细胞磷酸化ERK表达的影响图；(A：蛋白质免疫印迹(Western blot)条带显示不同浓度HSYB对胃癌SGC-7901细胞磷酸化ERK蛋白表达的影响；B：统计学分析图A蛋白条带的相对灰度值(*表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.05，**表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.01)；
图4是本发明实施例提供的HSYB通过上调磷酸化ERK诱导胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的作用；(A：蛋白质免疫印迹(Western blot)条带显示HSYB对胃癌SGC-7901细胞磷酸化ERK及S期监控点相关蛋白表达的影响；B：统计学分析图A蛋白条带的相对灰度值(*表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.05，**表示给药组与对照组对比后统计学p值小于0.01)。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下以较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、技术方案、特征及其功效，详细说明如后。下述说明中的多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
本发明以下实施例选用的主要材料及来源分别如下：
细胞培养基：DMEM(Hyclone公司产品)、胎牛血清(Thermo公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)，二氧化碳培养箱(Thermo公司产品)，噻唑蓝(索莱宝公司产品)，结晶紫(罗莱宝公司产品)，细胞周期检测试剂盒(凯基公司产品)，ERK、p-ERK、Cyclin A2、Cdk2、β-actin抗体(Cell signaling公司产品)，BCA蛋白定量试剂盒(索莱宝公司产品)。
超净工作台，酶标仪，倒置显微镜，台式离心机，流式细胞仪，凝胶成像系统。
羟基红花黄色素B(中检所)，96(6)孔板(Corning公司)。
胃癌SGC-7901细胞购于中科院上海细胞所。
实施例1
(1)羟基红花黄色素B的配置：由江西本草天工公司购得羟基红花黄色素B(纯度98％)，称取100mg后用1mL细胞培养级二甲基亚砜(DMSO)溶解，制成终浓度为100mg/mL的羟基红花黄色素B母液，再用培养基稀释至不同浓度的应用液。
(2)羟基红花黄色素B对胃癌SGC-7901细胞体外增殖的影响：将胃癌SGC-7901细胞接种在96孔板中，细胞密度为8000个/孔，加入不同浓度的羟基红花黄色素B应用液进行刺激，终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，15μg/mL，25μg/mL，作用24h后每孔加入20mL浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)母液，孵育4h后，吸出孔中上清，每孔加入100μL DMSO溶解孔内结晶，用微孔震荡器混匀10min后，置于酶标仪在490nm处测定吸光值。
结果显示，15μg/mL HSYB即能够明显抑制胃癌SGC-7901细胞增殖，抑制率达到68.15％，并且这种抑制作用与HSYB浓度呈浓度依赖性，如图1，**表示给药组与对照组比较后具有非常显著的差异，统计学p值小于0.01。
(3)羟基红花黄色素B对胃癌SGC-7901细胞平板克隆集落形成的影响：将胃癌SGC-7901细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，15μg/mL，25μg/mL的HSYB作用24h，用PBS洗涤细胞一次，去除洗液，用4％多聚甲醛固定10min，再用PBS洗涤细胞一次，加入1mL结晶紫染液染色10min，用PBS洗涤细胞两次后拍照。
结果显示，与对照组相比，25μg/mL的HSYB能够明显降低胃癌SGC-7901细胞集落形成率，并且集落明显变小，如图2，**表示给药组与对照组比较后具有非常显著的差异，统计学P值小于0.01。
实施例2(羟基红花黄色素B对胃癌SGC-7901细胞周期的影响)
(1)羟基红花黄色素B的配置及稀释同实施例1。
(2)羟基红花黄色素B诱导胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的作用：将胃癌SGC-7901细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，15μg/mL，25μg/mL的HSYB作用24h，用PBS洗涤细胞一次，2000rpm离心5min，收集并调整细胞浓度为1×106/mL，取1mL单细胞悬液，上述细胞悬液离心后去除上清，加入体积分数为70％冷乙醇500uL置于4℃固定过夜，2000rpm离心5min去除固定液后，加入500μLPI/RNase A染色工作液，室温避光孵育30min，用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光。
结果显示，与对照组相比，25μg/mL HSYB能够使胃癌SGC-7901细胞周期明显阻滞在S期，如图2(A)所示。
(3)将胃癌SGC-7901细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，15μg/mL，25μg/mL的HSYB作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，2000rpm离心5min去除上清，每个样品加入60μL RIPA裂解液，冰水浴裂解30min后，6000rpm离心10min后，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调蛋白上样量为40μg，加入loading buffer后将样品煮沸10min，至此制备好western blot样品，接着进行western blot。
如图2(B)所示25μg/mL的HSYB作用后能够使胃癌SGC-7901细胞Cyclin A2，Cdk2，p21蛋白表达明显增加，图2(C)为统计学分析目的蛋白的相对灰度值，*表示给药组与对照组比较后具有显著的差异，统计学P值小于0.05；**表示给药组与对照组比较后具有非常显著的差异，统计学P值小于0.01。
实施例3(羟基红花黄色素B上调ERK表达)
(1)羟基红花黄色素B的配置及稀释同实施例1。
(2)羟基红花黄色素B对磷酸化ERK表达的影响：将胃癌SGC-7901细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，15μg/mL，25μg/mL的HSYB作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，2000rpm离心5min去除上清，每个样品加入60μL RIPA裂解液，冰水浴裂解30min后，6000rpm离心10min后，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调蛋白上样量为40μg，加入loading buffer后将样品煮沸10min，至此制备好western blot样品，接着进行western blot。
如图3(A)显示，15、25μg/mL的HSYB作用后能够使胃癌SGC-7901细胞磷酸化ERK蛋白表达明显增加，图3(B)为统计学分析目的蛋白的相对灰度值，*表示给药组与对照组比较后具有显著的差异，统计学P值小于0.05；**表示给药组与对照组比较后具有非常显著的差异，统计学P值小于0.01。
实施例4(HSYB通过上调磷酸化ERK表达诱导胃癌SGC-7901细胞周期阻滞)
(1)羟基红花黄色素B的配置及稀释同实施例1。
(2)羟基红花黄色素B通过上调磷酸化ERK表达导致胃癌SGC-7901细胞周期阻滞的作用：SCH772984为一种新型特异性ERK1/2抑制剂，能够有效抑制ERK1/2的表达。为了验证HSYB能够上调磷酸化ERK表达，引入SCH772984给药组作为阴性对照。将胃癌SGC-7901细胞接种在6孔板中，调整细胞密度为100000个/孔，待细胞贴壁后，分别加入0μg/mL，25μg/mLHSYB以及4nM SCH772984、4nM SCH772984+25μg/mL HSYB作用24h，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，2000rpm离心5min去除上清，每个样品加入60μL RIPA裂解液，冰水浴裂解30min后，6000rpm离心10min后，收集上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调蛋白上样量为40μg，加入loading buffer后将样品煮沸10min，至此制备好western blot样品，接着进行western blot。
结果显示，如图4(A)所示HSYB能够使磷酸化ERK表达明显增加，并且加入ERK抑制剂SCH772984使磷酸化ERK表达下降，与只HSYB给药组比较，HSYB和SCH772984联用后使磷酸化ERK表达下降；同样，HSYB作用后能够使Cyclin A2和Cdk2表达升高，而SCH772984作用后使Cyclin A2和Cdk2表达下降，与只HSYB作用组比较，HSYB和SCH772984联用后使Cyclin A2和Cdk2表达下降，以上结果说明HSYB能够通过影响磷酸化ERK表达诱导胃癌SGC-7901细胞周期阻滞；图4(B)为统计学分析目的蛋白的相对灰度值，*表示给药组与对照组比较后具有显著的差异，统计学P值小于0.05；**表示给药组与对照组比较后具有非常显著的差异，统计学P值小于0.01。
通过上述实施例1-4研究，本发明通过研究首次证明了HSYB能够有效控制胃癌细胞的增殖，通过阻滞胃癌细胞在G1/S期，其分子机制涉及上调磷酸化ERK表达。证明了HSYB阻滞细胞周期来抑制胃癌细胞增殖的生物学特性，因此本发明具有重要的临床意义。本发明还证明了HSYB是一种ERK调控剂，能够上调磷酸化ERK表达进而导致胃癌细胞周期阻滞，从而达到抑制肿瘤增殖的效果，因此也具有重要的临床意义。本发明通过研究HSYB对胃癌的治病机理，提出了HSYB可作为治疗胃癌药物中的有效组分，并结合药学上可接受的载体，形成一种用于治疗胃癌的药物，上述药物的剂型可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。本发明的上述研究为治愈胃癌又提供了一种可靠药物。
本发明实施例中未尽之处，本领域技术人员均可从现有技术中选用。
以上公开的仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以上述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.羟基红花黄色素B在制备治疗胃癌药物中的应用。
2.治疗胃癌的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括羟基红花黄色素B。
3.如权利要求2所述的治疗胃癌的药物，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂或糖浆剂。
4.如权利要求2所述的治疗胃癌的药物，其特征在于，所述羟基红花黄色素B提取自植物红花。
5.如权利要求2所述的治疗胃癌的药物，其特征在于，所述羟基红花黄色素B的化学分子式为C27H32O16。
6.如权利要求2所述的治疗胃癌的药物，其特征在于，所述羟基红花黄色素B的纯度为98％。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Application and application of hydroxysafflower yellow B in the preparation of drugs for the treatment of gastric cancer

Effective date of registration: 20211214

Granted publication date: 20210219

Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd.

Pledgor: BINZHOU MEDICAL University

Registration number: Y2021980014859

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right