CN109596732A - 动物体内河豚毒素快速检测方法 - Google Patents

动物体内河豚毒素快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种动物体内河豚毒素快速检测方法，包括取中毒动物体液配制成待测样液、待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱‑质谱法测定的步骤，其中，待测样液与去蛋白剂的体积比为1‑3:4‑6。该方法可以快速获得动物体内的河豚毒素检测结果。

Description

动物体内河豚毒素快速检测方法
技术领域
本发明涉及食品毒素检测，特别涉及动物体内河豚毒素快速检测方法。
技术背景
河豚毒素(Tetrodotoxin,TTX)是河豚及其它生物体内含有的一种生物碱，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一。河豚鱼肉鲜美，令众多食客向往，但河豚肉处理不当，极其容易发生中毒事故。
目前，在流通行业中，多采用免疫试剂条进行快速检测，这种方法灵敏度低，且易出现假阳性。文献报道常见河豚毒素检验方法有荧光检测法、液相色谱检测法以及气相、串联四级杆液质联用检测法等。但是常用的串联四极杆液质联用仪MRM模式监测到的分子量只能精确到个位数，对分子量相同或相近的物质不能准确鉴别，由于河豚体内物质繁多，利用低分辨质谱容易造成误判。发生应急情况时，无法采取快速准确的检测方法，容易占用病人的抢救时间。
发明内容
本发明提供了一种动物体内河豚毒素快速检测方法，该方法可以对河豚毒素中毒检测结果进行更快速准确的检测。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下的技术方案：动物体内河豚毒素的快速检测方法，包括以下步骤：
(1)取中毒动物体液，配制成待测样液；
(2)将所述步骤(1)待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定，即可。
进一步的，所述步骤(2)中的高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A:流动相B的体积比为90-10:10-90。
进一步的，所述质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
进一步的，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为1-3:4-6。
进一步的，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为2:5。
进一步的，所述去蛋白剂为乙腈。
进一步的，所述步骤(1)中中毒动物体液为尿液、血液和胃内容物中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明的动物体内河豚毒素快速检测方法的有益效果为：方法简单易行、机理明确；通过HRMS以及结合色谱柱的分析，可快速准确检测动物体内河豚毒素含量，有助于也能够应用于后期对于治疗药物的筛选、评价治疗方法。
附图说明
下面结合附图中的具体实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1为河豚毒素标准样品的工作曲线；
图2为胃液中河豚毒素的主成分分析图；
图3为血液中河豚毒素的主成分分析图；
图4为尿液中河豚毒素的主成分分析图；
图5为河豚毒素的主成分分析对比图。
具体实施方式
实施例1
取中毒小鼠尿液3mL配制成待测样液，然后取待测样液1mL加入4mL的乙腈除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
实施例2
取中毒小鼠血液4mL，配制成待测样液，然后取待测样液2mL加入5mL的乙腈除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
实施例3
取中毒小鼠胃内容物5mL配制成待测样液，然后取待测样液3mL加入6mL的乙腈除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定。其中，高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中，0-2min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，2-5min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5-5.1min，流动相A与流动相B的体积比为10:90，5.1-7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10，第7min，流动相A与流动相B的体积比为90:10；所述质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
实验例1
1.提取河豚中的河豚毒素提取液，并检测浓度
称取10g河豚肝脏于离心管中，剪碎，加入10mL 1％甲酸水溶液，均质10分钟后超声提取30分钟，100℃水浴10min，4000rpm离心5分钟后，可见溶液分4层，取第三层水相2mL清液于50mg PEP管中，振荡3分钟，15000rpm离心5分钟，取上清液，同步提取2份，分别为肝脏提取液1和肝脏提取液2；利用HPLC-QTOF对肝脏提取液1和肝脏提取液2进行全扫描采集，色谱条件为Agilent HPH-C18(3×100mm，1.9μm)、进样量1μL；质谱条件为：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V检测浓度的结果如表1所示，肝脏提取液1和肝脏提取液2的浓度分别为0.255ug/mL、0.291ug/mL。
表1河豚肝脏提取液浓度检测结果
肝脏提取液1 0.255ug/mL
肝脏提取液2 0.291ug/mL
2.动物模型的制备
取12只SPF级小鼠并分为三组，第一组：5只(1-5号)灌以上述提取的河豚肝脏提取液1(0.5mL/10g)(0.5mL/10g是指小鼠的体重每10g加0.5ml的提取液)；第二组：5只(6-10号)灌以上述提取的河豚肝脏提取液2(0.5mL/10g)；第三组：2只(11-12号)作为空白组，灌以1％甲酸水溶液(0.5mL/10g)。
3.体液的采集和处理方法
上述小鼠灌胃后放入代谢笼观察记录动物行为，3h后取血液、胃液，收集实验过程中的尿液。
⑴尿液：收集代谢笼所得小鼠尿液，取0.4mL加入乙腈1.0mL混匀，离心上机分析；
⑵血液：血液置于肝素钠润洗过的离心管中混匀，离心取血浆0.4mL加入乙腈1.0mL混匀，离心上机分析；
⑶胃内容物：取小鼠胃内容物于1％甲酸水溶液2mL中剪碎常温浸泡30min，离心取上清液0.4mL，加入乙腈1.0mL混匀，离心上机分析。
4.标准曲线及回收率
通常为了消除体液效应和提取过程中的影响，采用体液加标准溶液来进行定量分析。精密称取0.96mg河豚毒素(Affix Scientific,AF3014-AF02,纯度>98％)，置10mL容量瓶中，加1％甲酸水溶液溶解并到刻度，使成96μg/ml对照储备液。精密量取1mL对照储备液，置100mL容量瓶中，加1％甲酸水溶液稀释到刻度，使成0.96μg/mL对照品原液，即TTX。标准溶液系列稀释方法及浓度见表2。标准溶液的工作曲线如图1所示，以TTX响应值对其标准溶液浓度(C，μg/ml)进行线性回归，对于TTX组分定量测定的标准曲线为y＝28.019229x，曲线相关系数r2大于0.999，线性范围4.8～48μg/ml内，可满足实际样品分析需要。
分别取空白组小鼠的尿液、胃液、血浆各0.4mL加S2标准品溶液0.6mL配制成1mL的体液加标准品溶液，并测定其回收率，如表3所示，尿液、胃内容物以及血液的体液加标准品回收率分别为99.70％、99.81％和99.55％，数据显示本方法的回收率具有较高水平，得出的结果可信度也比较高。
表2标准溶液系列稀释方法及浓度
表3体液加标准品回收率
以上分析条件为：
色谱条件：高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流动相A和流动相B的体积比见表4；质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
表4各时间段流动相体积比例
时间 流动A(5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸) 流动B(乙腈)
0～2min 90 10
2～5min 10 90
5～5.1min 10 90
5.1～7min 90 10
7min 90 10
5.中毒小鼠体液分析
对中毒小鼠体液进行检测分析，条件与上述4中的相同。对小鼠灌胃之后的3h的行为表现以及体液分析结果如表5所示，对小鼠灌胃河豚毒素之后均出现萎靡、精神不振的表现，个别小鼠有明显抽搐和嗜睡的表现，通过动物表现和体液中河豚毒素浓度的结果显示，所用提取方法、分析方法在对于体液中河豚毒素的应用有效。
表5动物实验结果
6.统计学差异分析
通过HRMS分别对血液、胃内容物和尿液中河豚毒素的主成分分析，结合MassProfiler Professional软件(利用t-test p<0.05和强度倍数变化FC>2过滤)分析，分别得到图2、3、4中胃内容物、血液以及尿液中的成分分析，为了方便比较提取的胃内容物、血液以及尿液中的河豚毒素的成分，得到图5。
经过主成分分析，结合色谱对TTX对照溶液、体液(血液、胃内容物及尿液)空白、空白组、TTX-体液以及发病后小鼠体内河豚毒素的数据能明显分析，所用提取方法、分析方法在对于体液中河豚毒素的应用有效，其中胃内容物与血液的差异性更大，所以应急采样中，优先提供血液或胃内容物进行检验，其次用到尿液。由以上筛选方法通过动物实验结合HRMS模拟测定动物服用河豚毒素后，体内胃液、血液、尿液河豚毒素的分布情况，可以对动物中毒后体内河豚毒素含量进行快速准确的检测。
以上所述为本发明的优选实施方式，并不限制于本发明。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下做出的若干改进和变型，也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取中毒动物体液，配制成待测样液；
(2)将所述步骤1待测样液用去蛋白剂除杂、净化后，再用高效液相色谱-质谱法测定，即可。
2.根据权利要求1所述的动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的高效液相色谱采用3×100mm，1.9μm的C18色谱柱；进样量为1μL；柱温为35℃；5mmol/L乙酸铵-0.1％甲酸为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A：流动相B的体积比为90-10:10-90。
3.根据权利要求2所述的动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，所述质谱条件：离子源为ESI+，扫描范围为100～1700amu，采集频率为3张/秒；参比离子为121.050873，322.048121，922.009798，1221.990637，1521.971475；干燥气温度为200℃；干燥气流量为15L/min；鞘气温度为325℃；鞘气流量为11L/min；喷雾器压力为35psi；毛细管电压为3500V；锥孔电压为正离子模式500V；负离子模式为1500V。
4.根据权利要求1所述的动物体内河豚毒素快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为1-3:4-6。
5.根据权利要求1所述的动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中待测样液与去蛋白剂的体积比为2:5。
6.根据权利要求1或4或5所述的动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，所述去蛋白剂为乙腈。
7.根据权利要求1或7或8所述的动物体内河豚毒素的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中小鼠体液为尿液、血液和胃内容物中的一种或几种。
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