CN109580941A

CN109580941A - 一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接elisa方法

Info

Publication number: CN109580941A
Application number: CN201811376701.XA
Authority: CN
Inventors: 王桂军; 周祺; 徐前明; 刘红梅; 宋祥军; 苏观志; 许泽军; 顾香雪; 黄荣
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2018-11-19
Filing date: 2018-11-19
Publication date: 2019-04-05

Abstract

本发明公开了一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，利用鸭坦布苏病毒全基因序列设计一对引物以扩增NS1基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达获得重组表达蛋白包涵体，以包涵体经纯化、复性、浓缩后作为包被抗原，建立检测鸭血血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。本发明的抗体为非结构蛋白中的NS1蛋白，检验结果中假阳性少，IFA符合率高，且检验结果重复性好，敏感性强，检测时间快，5小时内基本可以检测出结果。动物试验结果显示抗体在感染鸭坦布苏病毒后出现阳性时间早，持续时间长。

Description

一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法

技术领域

本发明属于动物传染病检测技术领域，具体涉及一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

背景技术

鸭坦布苏病毒病是由DTMUV引起的一种新的传染病，该病主要发生于鸭，可引起蛋鸭产蛋率下降，雏鸭生长迟缓和死亡。鸭群中的发病率可达到80％，蛋鸭产蛋率可由90％降到10％。感染后耐过的鸭需要长时间才能恢复生产性能，而且难以达到感染前的生产水平。2010年我国出现首例鸭坦布苏病毒病后，国内大部分养鸭地区都相继出现鸭群感染DTMUV的报道，该病给我国养鸭业带来了重大的经济损失，而且严重影响到我国养鸭业的健康发展，也给我国的公共卫生带来一系列的潜在威胁。

该病近年来在我国水禽养殖区域的广泛流行以及其造成的巨大经济损失，针对养殖场及基层兽医检疫部门技术欠缺，设备简单的现状，须创建一种简便有效的抗体检测方法以防控鸭坦布苏病毒病的爆发以及了解鸭坦布苏病毒病的流行情况。

发明内容

本发明的目的正是为了解决上述问题，而提出一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，该方法抗体为非结构蛋白中的NS1蛋白，检验结果中假阳性少，IFA符合率高，且检验结果重复性好，敏感性强。动物试验结果显示抗体在感染鸭坦布苏病毒后出现阳性时间早，持续时间长。

本发明提供了一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，利用鸭坦布苏病毒全基因序列设计一对引物以扩增NS1基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达获得重组表达蛋白包涵体，以包涵体经纯化、复性、浓缩后作为包被抗原，建立检测鸭血血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。其中，蛋白表达载体制备如下：分别取20μLpMD19T-NS1质粒和pET32a质粒同时用BamH I和HindⅢ进行双酶切。酶切产物NS1片段和pET32a片段胶回收后进行连接，连接产物转化DH5α。包涵体的纯化用含2mol/L尿素的Tris缓冲液，复性用含尿素的TGE，用蔗糖浓缩。

作为优选手段，所述鸭坦布苏病毒为鸭黄病毒AH-F10株，保藏编号为：CCTCCV201213。

作为进一步地优选手段，所述鸭坦布苏病毒为鸭黄病毒AH-F10株，保藏编号为：CCTCC V201213。

作为进一步地优选手段，利用鸭坦布苏病毒全基因序列采用Oligo7设计一对用于扩增鸭坦布苏病毒NS1基因特异性引物，所述一对引物的引物序列如下：

NS1-up：5’-CGGGATCCATGGACACGGGGTGCTCAATC-3’；

NS1-dw：5’-CCCAAGCTTTCAAGCCATGACCTTTGATTTG-3’。

NS1目的基因大小为1056bp，上下游引物两端分别添加BamH I、HindⅢ酶切位点。

作为进一步地优选手段，所述NS1基因的基因序列如SEQ ID No.1所示。NS1基因对应的氨基酸序列如如SEQ ID No.2所示。

一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)用鸭坦布苏病毒全基因序列设计一对引物以扩增NS1基因，通过构建原核表达系统获得重组融合蛋白包涵体，包涵体经过纯化、复性、浓缩后作为包被抗原；

2)将步骤1)的包被抗原用碳酸盐包被液稀释成40μg/mL，100μL/孔加入酶标板内，37℃包被60min；

3)甩掉步骤2)中酶标板孔内的包被液，PBST清洗4次，每次2min，拍干，加入5％脱脂奶粉200μL/孔，37℃封闭90min；

4)甩掉步骤3)孔内的封闭液，，用PBST清洗4次，每次2min，拍干，按100μL/孔加入用PBS 1:400稀释的一抗标准阴阳性血清，37℃孵育30min；

5)甩掉步骤4)孔内一抗液体，用PBST清洗4次，每次2min，拍干，按100μL/孔加入用PBS 1：2000稀释的羊抗鸭酶标二抗，37℃孵育30min；

6)甩掉步骤5)孔内的二抗，用PBST清洗5次，每次2min，拍干，按100μL/孔加入TMB显色液，避光反应15min，按100μL/孔加入显色终止液，终止反应；

7)在酶标仪上测步骤6)孔中液体OD_450nm值，根据临界值判定阴阳性，当OD₄₅₀nm值大于0.305时是阳性，小于0.305时是阴性。

其中，PBST：磷酸盐吐温缓冲液；PBS：磷酸盐缓冲液；TMB：显色液；显色终止液：2mol/LH₂SO₄溶液。

本发明有益效果：本发明检测的抗体为非结构蛋白中的NS1蛋白，检验结果中假阳性少，IFA符合率高，且检验结果重复性好，敏感性强。动物试验结果显示抗体在感染鸭坦布苏病毒后出现阳性时间早，持续时间长。

附图说明

图1是NS1基因RT-PCR扩增结果(M：DNA分子质量标准；1：NS1基因PCR扩增产物。

图2是pMD19T-NS1双酶切鉴定结果(M：DNA分子质量标准；1：pMD19T-NS1经BamH I/HindⅢ酶切产物)。

图3是pET32a-NS1双酶切鉴定结果(M：DNA分子质量标准；1：pET32a-NS1经BamH I/HindⅢ酶切产物)。

图4是重组NS1重组融合蛋白可溶性分析结果(M：蛋白分子质量标准；1：沉淀；2：上清)。

图5是纯化的重组NS1蛋白SDS-PAGE分析结果(M：蛋白分子质量标准；1：纯化的重组NS1蛋白)。

图6是标准阴阳性血清IFA鉴定结果(A-C：感染DTMUV(以阳性鸭血清为一抗)和D-F(以阴性鸭血清为一抗)的BHK-21细胞。A：病毒蛋白的表达；B：DAPI染色的细胞；C：A和B的合并图像；D：病毒蛋白的表达；E：DAPI染色的细胞；F：D和E的合并图像。)

保藏说明

本发明使用的DTMUVAH-F10株，该细菌保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在中国，武汉，武汉大学；保藏编号CCTCC NO：V201213；该培养物已于2012年4月18日送到保藏中心保藏，并登记入册。从该日起保藏三十年，该培养物的存活性已于2012年4月23日检测完毕，结果为存活。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细描述：

具体实施方案如下：

1.1NS1基因引物的设计

参考DTMUV AH-F10株，(GenBank登录号：KM102539)的全基因序列，使用Oligo7设计一对用于扩增DTMUVNS1基因的特异性引物，引物序列为：

NS1-up：5’-CGGGATCCATGGACACGGGGTGCTCAATC-3’；

NS1-dw：5’-CCCAAGCTTTCAAGCCATGACCTTTGATTTG-3’；

目的基因大小为1056bp，上下游引物两端分别添加BamH I、HindⅢ酶切位点。

1.2病毒RNA的提取

病毒RNA的提取根据实验室常规方法进行，步骤如下：

1、取少量冻融好的鸭坦布苏病毒液，8000r/min离心3min，取上清液；

2、取200μL上清加入1mL TRIzol酶，4℃裂解15min；

3、加入200μL氯仿后充分振荡，12000r/min离心10min；

4、取上清到一个无菌的EP管，加入同等体积的异丙醇，4℃放置20min；

5、12000r/min离心10min，弃上清，加入750μL 75％乙醇后手动上下颠倒混匀；

6、12000r/min离心10min；

7、倒去上清，倒置在滤纸上，吹干，加10μL ddH₂O后置于-20℃保存。

1.3NS1基因的RT-PCR扩增

(1)反转录

提取的RNA用M-MLV反转录，步骤如下：往PCR管中加入RNA模板10μL，dNTPs(10mmol/L)3μL，随机引物1μL，于70℃水浴5min后迅速冰浴2min，加入5×M-MLV Buffer 5μL，M-MLV反转录酶1μL，ddH₂O 5μL，于42℃水浴50min，反转录完成的cDNA置于-20℃保存备用。

(2)PCR扩增

以反转录后的cDNA为模板，NS1-up和NS1-dw为引物进行PCR扩增，PCR体系为50μL(表1-1)，PCR条件为94℃预变性3min，94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，32个循环后72℃延伸10min，反应结束后取10μL PCR产物进行凝胶电泳鉴定，条带大小正确的PCR产物送公司测序。

表1PCR扩增体系

1.4PCR产物的胶回收与克隆

NS1基因的PCR产物用胶回收试剂盒按照说明书进行回收，回收得到的NS1基因片段与pMD-19T载体连接，构建重组质粒pMD19T-NS1，连接条件为16℃4h，连接体系如下(表1-2)。

表2NS1基因片段与pMD-19T载体连接体系

连接产物转化DH5α，转化步骤如下：

1、取100μLDH5α在冰盒上解冻，加入10μL连接产物；

2、冰浴30min，42℃热休克90s后，迅速冰浴3min；

3、加入600μL 37℃预热的LB液体培养基，置于摇床37℃200r/min培养50min；

4、6000r/min离心3min，弃上清并保留100μL重悬；

5、涂布于LB/AMP平板培养基，37℃培养过夜。

1.5pMD19T-NS1阳性质粒的鉴定

(1)阳性菌株的筛选

分别挑取Amp平板培养基上的10个单克隆于2mL LB/AMP液体培养基中，37℃220r/min培养2h，对菌液进行PCR鉴定，挑选出阳性菌株。

(2)pMD19T-NS1质粒的提取

阳性菌株按照常规试剂盒步骤提取质粒，提取的质粒-20℃保存。

(3)pMD19T-NS1质粒的酶切鉴定

取20μLpMD19T-NS1质粒，用BamH I和HindⅢ进行双酶切，产物进行凝胶电泳，双酶切鉴定正确的质粒保存于-20℃。双酶切体系如下(表1-3)：

表3pMD19T-NS1的双酶切鉴定体系

1.6原核表达载体pET32a-NS1的构建

分别取20μLpMD19T-NS1质粒和pET32a质粒同时用BamH I和HindⅢ进行双酶切，酶切体系同上。酶切产物NS1基因片段和pET32a片段胶回收后进行连接(表1-4)，连接产物转化DH5α，37℃培养过夜后，挑取单克隆用NS1基因的引物进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性的菌株提取质粒进行双酶切鉴定，对鉴定结果正确的质粒测序。

表4NS1基因片段与pET32a连接体系

1.7重组质粒的诱导表达

测序结果正确的质粒pET32a-NS1转化表达菌BL21(DE3)，无菌涂布于LB/AMP平板培养基，37℃培养18h。挑取单克隆用NS1基因的引物进行PCR鉴定，鉴定结果阳性的菌株按照1:100接种到10mL LB/AMP液体培养基中，于摇床37℃、200r/min培养到OD_600nm值约为0.6时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃、150r/min诱导表达2h。取1mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，用50μL PBS重悬，加入50μL2×蛋白上样缓冲液，100℃水煮5min，离心取上清进行SDS-PAGE分析。

1.8重组NS1蛋白的大量表达

选取蛋白表达阳性的菌株摇床培养过夜，按照1:100的比例接种到含有300mL LB/AMP液体培养基中，在优化后的条件下进行诱导表达。菌液8000r/min离心5min，菌体用灭菌PBS吹打，再离心，重复几次直至上清变清亮为止。最后得到的菌体用30mL灭菌PBS吹散，冰浴超声破碎，超声程序为：超声3s间隔8s，每次十分钟，超声3次。超声完的菌体在4℃，12000r/min离心10min，收集包涵体。

1.9重组NS1蛋白的纯化

包涵体使用Tris缓冲液洗涤三次后，用含2mol/L尿素的Tris缓冲液洗去杂蛋白(纯化)，离心取沉淀用含8mol/L尿素的TGE缓冲液于4℃过夜溶解，离心取上清置于透析袋中，分别用含6mol/L、5mol/L、4mol/L、3mol/L、和2mol/L尿素的TGE复性溶液进行梯度复性，用蔗糖浓缩，SDS-PAGE分析收集的蛋白，核酸蛋白浓度测量仪进行蛋白浓度的测定，测得浓度为2.664mg/mL。

1.10临床血清的检测

2017年4月17日于安徽黄山鸭场采集58日龄的樱桃谷鸭血清27份；于安徽铜陵鸭场采集200日龄麻鸭血清100份；于马鞍山鸭场采集150日龄的樱桃谷鸭蛋鸭血清20份，蛋鸭出现产蛋下降的症状；大部分鸭出现采食量下降的症状，部分出现神经症状。用建立的NS1-ELISA方法进行检测，具体步骤如下：

1)用鸭坦布苏病毒全基因序列设计一对引物以扩增NS1基因，构建重组表达载体经诱导表达获得重组表达蛋白包涵体，包涵体经过纯化、复性、浓缩后作为包被抗原；

3)甩掉步骤2)中酶标板孔内的包被液，PBST清洗4次，，每次2min，拍干，加入5％脱脂奶粉200μL/孔，37℃封闭90min；

7)在酶标仪上测步骤6)孔中液体OD_450nm值，根据临界值判定阴阳性，当OD₄₅₀nm值大于0.372时是阳性，小于0.372时是阴性。

检测结果显示不同鸭场的鸭血清抗体水平普遍较高，其中抽检的147份血清中检出DTMUV阳性的有135份，阳性率达到91.84％。

表5临床血清的检测

一抗标准阴阳性血清的制备如下：

本实验选用4只鸭子，分为实验组(2只)和对照组(2只)。实验组肌肉注射TCID₅₀＝10^-5/100μL鸭坦布苏病毒，7天后使用IFA检测血清抗体的特异性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法

<130> 2018/10/26

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

SEQ ID No.1

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> Pabellonia incrassata

<400> 1

gacacggggt gctcaatcga cttggctagg aaagaattga aatgtggaca aggcatgttc 60

gtcttcaacg atgttgaggc ttggaaagat aattataagt actatccatc cacaccaagg 120

agacttgcca aagtcgtggc agaagctcat gaggctggaa tttgtggcat acgatcagtc 180

agcaggctcg agcacaacat gtgggtaagc atcaaacatg agttgaacgc gatcttggaa 240

gacaacgcca ttgacttgac tgtggtggtt gaagaaaatc ctggaagata caggaaaact 300

aatcagaggc tgccgaacgt tgatggagag ctcatgtacg gatggaagaa atgggggaaa 360

agtattttta gcagcccgaa gatgtcaaat aatacatttg tcatcgatgg accaaaaact 420

aaagagtgcc cagatgagag aagagcatgg aatagtatga agattgaaga ctttgggttt 480

ggagtgttgt ccacaaaggt atggatggaa atgcggacag aaaatacaac tgattgtgac 540

accgcagtaa tgggcacagc aattaaagga aatagagctg tgcacagtga cctgagctat 600

tggatagaga gcaagaataa tggaagctgg aaactggaga gagctgtgct gggcgaggtg 660

aagtcatgca catggccgga aacccacaca ctgtggagtg acagcgttgt ggagagtgaa 720

ctcatcatac ctaaaacatt gggaggaccg aagagtcatc acaacacgag gacaggatac 780

aaggttcaga gttccggacc gtgggatgag aaagagattg tagtagactt cgactactgc 840

cctggaacaa ctgtcacagt aacgagctcg tgccgcgaca gagggccttc agctaggaca 900

acaacagcga gtgggaaact gataacagat tggtgttgta ggtcttgcac caccccacca 960

ctgagatttg ttacaaaaag tggatgctgg tatgggatgg aaattcggcc aactgctcac 1020

ggagacgaca tgttgatcaa atcaaaggtc atggct 1056

SEQ ID NO.2

<210> 2

<211> 352

<212> PRT

<213> Pabellonia incrassata

<400> 2

Asp Thr Gly Cys Ser Ile Asp Leu Ala Arg Lys Glu Leu Lys Cys Gly

1 5 10 15

Gln Gly Met Phe Val Phe Asn Asp Val Glu Ala Trp Lys Asp Asn Tyr

20 25 30

Lys Tyr Tyr Pro Ser Thr Pro Arg Arg Leu Ala Lys Val Val Ala Glu

35 40 45

Ala His Glu Ala Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Ser Arg Leu Glu

50 55 60

His Asn Met Trp Val Ser Ile Lys His Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu

65 70 75 80

Asp Asn Ala Ile Asp Leu Thr Val Val Val Glu Glu Asn Pro Gly Arg

85 90 95

Tyr Arg Lys Thr Asn Gln Arg Leu Pro Asn Val Asp Gly Glu Leu Met

100 105 110

Tyr Gly Trp Lys Lys Trp Gly Lys Ser Ile Phe Ser Ser Pro Lys Met

115 120 125

Ser Asn Asn Thr Phe Val Ile Asp Gly Pro Lys Thr Lys Glu Cys Pro

130 135 140

Asp Glu Arg Arg Ala Trp Asn Ser Met Lys Ile Glu Asp Phe Gly Phe

145 150 155 160

Gly Val Leu Ser Thr Lys Val Trp Met Glu Met Arg Thr Glu Asn Thr

165 170 175

Thr Asp Cys Asp Thr Ala Val Met Gly Thr Ala Ile Lys Gly Asn Arg

180 185 190

Ala Val His Ser Asp Leu Ser Tyr Trp Ile Glu Ser Lys Asn Asn Gly

195 200 205

Ser Trp Lys Leu Glu Arg Ala Val Leu Gly Glu Val Lys Ser Cys Thr

210 215 220

Trp Pro Glu Thr His Thr Leu Trp Ser Asp Ser Val Val Glu Ser Glu

225 230 235 240

Leu Ile Ile Pro Lys Thr Leu Gly Gly Pro Lys Ser His His Asn Thr

245 250 255

Arg Thr Gly Tyr Lys Val Gln Ser Ser Gly Pro Trp Asp Glu Lys Glu

260 265 270

Ile Val Val Asp Phe Asp Tyr Cys Pro Gly Thr Thr Val Thr Val Thr

275 280 285

Ser Ser Cys Arg Asp Arg Gly Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Ala Ser

290 295 300

Gly Lys Leu Ile Thr Asp Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Thr Pro Pro

305 310 315 320

Leu Arg Phe Val Thr Lys Ser Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg

325 330 335

Pro Thr Ala His Gly Asp Asp Met Leu Ile Lys Ser Lys Val Met Ala

340 345 350

Claims

1.一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：利用鸭坦布苏病毒全基因序列设计一对引物以扩增NS1基因，构建蛋白表达载体，通过IPTG诱导表达获得重组表达蛋白包涵体，以包涵体经纯化、复性、浓缩后作为包被抗原，建立检测鸭血血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。

2.根据权利要求1所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒为鸭黄病毒AH-F10株，保藏编号为：CCTCC V201213。

3.根据权利要求1所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述一对引物的引物序列如下：

NS1-up：5’-CGGGATCCATGGACACGGGGTGCTCAATC-3’；

NS1-dw：5’-CCCAAGCTTTCAAGCCATGACCTTTGATTTG-3’。

4.根据权利要求1所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述NS1基因的基因序列如SEQIDNo.1所示。

5.根据权利要求1所述一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：具体步骤如下：

2)对包被抗原放入酶标板内进行包被、封闭，得封闭液；

3)甩掉步骤2)中封闭液，用一抗孵育，然后再用二抗孵育；

4)甩掉步骤3)中二抗孵育液，采用TMB显色液显色，加入显色终止液，终止反应；

5)利用酶标仪测定步骤4)酶标板孔中液体OD_450nm值，根据临界值判定阴阳性。

6.根据权利要求5所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述步骤2)中封闭采用5％脱脂奶粉200μL/孔，37℃封闭90min。

7.根据权利要求5所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述一抗为用PBS 1:400稀释的标准阴阳性血清，二抗为用PBS 1：2000稀释的羊抗鸭酶标抗体。

8.根据权利要求5所述的一种检测鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于：所述临界值判定阴阳性的标准为：当OD_450nm值大于0.305时是阳性，小于0.305时是阴性。