CN109576188A - 一种防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用，具体为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）MES861，保藏日期：2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号：CGMCC No.16857。将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液作为防治半夏根腐病的菌剂。防治半夏根腐病的菌剂的制备方法：将贝莱斯芽孢杆菌接种到液体营养琼脂培养基震荡培养后制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。本发明的贝莱斯芽孢杆菌对禾谷镰刀菌、腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等的致病菌有强烈的抑制作用，有效防止半夏根腐病的发生，促进半夏稳产、增收。

Description

一种防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，涉及一种防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
半夏根腐病是一种真菌性土传病害，病菌发展迅速，轻者一周植株腐烂80％，重者3-5 天使整个半夏地块全部感染而腐烂死亡，特别是长期种植半夏的地块更难控制，给半夏生产造成严重损失。
传统防治方法是选择较好土质的中壤土或者壤土，配合中耕改良土壤板结状况，与禾本科作物轮作的方法，操作比较复杂。常用的化学药剂有多菌灵、代森锰锌、青枯立克等。长期大量使用化学肥料、农药会使土壤团粒结构、理化性质遭受破坏，并且还带来抗药性积累、药物残留等一系列问题，导致土传病害加重，造成恶性循环，加大防治难度。
利用生物防治能克服上述其它方法的弊端，符合安全环保可持续发展的生态农业方向。经检索，目前尚未发现用贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)防治半夏根腐病的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用。本发明的贝莱斯芽孢杆菌对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、串珠镰刀菌(F.moniliforlle)等的致病菌有强烈的抑制作用，有效防治半夏根腐病，促进半夏稳产、增收。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种防治半夏根腐病的菌株，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MES861，保藏日期： 2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.16857。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院。
本发明还提供了一种防治半夏根腐病的菌剂，将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液作为防治半夏根腐病的菌剂。
本发明还提供了一种防治半夏根腐病的菌剂，将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液进行喷雾干燥后制得防治半夏根腐病的粉末状菌剂。
本发明还提供了防治半夏根腐病的菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)液体摇瓶培养基：营养琼脂作为培养基经121-126℃高压灭菌15-30分钟后冷却待用；
(2)挑取贝莱斯芽孢杆菌接种到步骤(1)中所述的液体营养琼脂摇瓶培养基里，在25-30 ℃、160-200rpm条件震荡培养24-36小时后，制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。
作为上述实施例的进一步改进，所述营养琼脂包括5-10g蛋白胨，1-3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH值为7.0。
作为上述实施例的进一步改进，步骤(2)中，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为1‰-3‰。
作为上述实施例的进一步改进，所述营养琼脂包括10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠， 1000mL水，pH值为7.0。
作为上述实施例的进一步改进，步骤(2)中，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为1‰。
作为上述实施例的进一步改进，将贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行喷雾干燥后制得防治半夏根腐病的粉末状菌剂。
本发明还提供了防治半夏根腐病的菌剂的应用，其特征在于，将防治半夏根腐病的菌剂应用在半夏根腐病的防治中。
原理：贝莱斯芽孢杆菌生长过程中分泌葡聚糖酶、禾烷酮、2-壬酮和2-壬醇等物质，抑制病原菌的生长，达到拮抗病原菌的作用。
菌株获得方式：
该株贝莱斯芽孢杆菌MES861是2017年8月我公司研发人员从甘肃西和国药基地半夏根腐病发病田地土壤里分离得来。贝莱斯芽孢杆菌分离过程：称取10g半夏根腐病土样，加入到盛有100mL无菌水的试管中，在180rpm在摇床上震荡30min后，吸取1mL混匀后的菌液，加入到一支新的盛有9mL无菌水的试管中，在小型震荡器上震荡1min后，吸取1mL加入到新的盛有9mL无菌水的试管中，依次稀释到10-8后从中吸取100μL加到营养琼脂培养基上，涂抹均匀，待长出单菌落后鉴定并保存。共分离6株菌种，经过平板划线，在28℃培养箱里培养24h，多次纯化，将纯化好的单菌落制成斜面菌种，4℃冷藏。挑取单菌落，经结晶紫染色，镜检，送上海生工测序后命名为贝莱斯芽孢杆菌,以半夏镰刀菌为作用靶标、贝莱斯芽孢杆菌为拮抗菌种进行平板对峙实验，28℃培养，4天后发现该贝莱斯芽孢杆菌能够显著抑制半夏镰刀菌的生长，抑菌带明显。后经农业部菌种检测机构鉴定，MES861最终确定为贝莱斯芽孢杆菌(基因序列见说明书最后)。
鉴定方法：对分离的单菌落数次纯化长成均匀一致的单菌落后，挑取单菌落接种到固体营养琼脂试管斜面上，送上海生工测序，将测序所得基因序列在NCBI上进行BLASTn后对序列进行分析。
该株贝莱斯芽孢杆菌经鉴定为芽孢杆菌属革兰氏阳性好氧细菌，内生孢子椭圆形。过氧化氢酶阳性，接触酶阳性，脂酶阳性，明胶液化阳性，运动性阴性，吲哚阳性，V-P测定阴性，分解淀粉，不分解纤维素。
有益效果
将本发明的菌液防治半夏根腐病，防治效果显著，防治效果达80％以上，并且无公害、无污染、有望大面积推广使用。
贝莱斯芽孢杆菌生长过程中分泌葡聚糖酶、禾烷酮、2-壬酮和2-壬醇等物质，抑制病原菌的生长，达到拮抗病原菌的作用。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌对半夏根腐病的拮抗效果；
其中，a为接种贝莱斯芽孢杆菌后拮抗效果；b为根腐病病原菌对照。
图2为贝莱斯芽孢杆菌对半夏根腐病的盆栽抗病效果；
1为喷清水对照；2为化学药剂；3为使用贝莱斯芽孢杆菌液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种防治半夏根腐病的菌株，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MES861，保藏日期： 2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.16857。
贝莱斯芽孢杆菌MES861微生物菌液的制备，按照以下步骤进行
(1)液体摇瓶培养基：营养琼脂(述营养琼脂包括10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH值为7.0)，配好的培养基经121℃高压灭菌20分钟后冷却待用。
(2)挑取贝莱斯芽孢杆菌接种到100mL步骤(1)中所述液体营养琼脂摇瓶培养基里，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为1‰，在25℃、200rpm条件震荡培养24小时后待用，制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液为防治半夏根腐病的菌剂。
实施例2
一种防治半夏根腐病的菌株，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MES861，保藏日期： 2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.16857。
贝莱斯芽孢杆菌MES861微生物菌粉的制备，按照以下步骤进行
(1)液体摇瓶培养基：营养琼脂(5g蛋白胨，1g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH 值为7.0)，配好的培养基经126℃高压灭菌30分钟后冷却待用。
(2)挑取贝莱斯芽孢杆菌接种到100mL步骤(1)中所述液体营养琼脂摇瓶培养基里，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为3‰，在28℃、180rpm条件震荡培养36小时后待用，制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液进行喷雾干燥，喷雾干燥的工艺为现有技术中常用的制备工艺，控制喷雾干燥塔内的热进风温度控制在170～180℃，热排风温度控制在75～95℃左右。
实施例3
一种防治半夏根腐病的菌株，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)MES861，保藏日期： 2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.16857。
贝莱斯芽孢杆菌MES861微生物菌液的制备，按照以下步骤进行
(1)液体摇瓶培养基：营养琼脂(10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH 值为7.0)，配好的培养基经123℃高压灭菌15分钟后冷却待用。
(2)挑取贝莱斯芽孢杆菌接种到100mL步骤(1)中所述液体营养琼脂摇瓶培养基里，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为3‰，在30℃、160rpm条件震荡培养30小时后待用，制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液，即得防治半夏根腐病的菌株。
二、功能检测
贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病的拮抗试验
(一)试验时间和地点：2018年8月在公司研发中心实验室内进行。
(二)试验方法：
(1)供试半夏根腐病菌来源：半夏根腐病病菌06-1来自甘肃西和半夏根腐病病田土壤里，经公司研究人员分离纯化，分子检测鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，致病力测定为强致病力菌株。
(2)平板对峙实验：
配制营养琼脂固体培养基，配方为10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH值为7.0，121℃高压灭菌30分钟后，冷却到50℃左右制成平板。先在培养皿中央接种少量的半夏根腐病菌体，将活化后的贝莱斯芽孢杆菌MES861接种在距病原菌接种点2.0厘米处，设空白对照。28℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，观察抑菌效果，测量半夏根腐病菌的对照生长量(菌落面积)和处理生长量(接种MES861后的菌落面积)，用拮抗作用抑菌率(抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量*100)表示。
(3)结果(表1、附图1)贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病的抑制率达87.5％；透明的抑菌带宽5毫米。说明贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病具有明显的抑制作用，可以作为防治半夏根腐病的生防菌种。
表1贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病的拮抗试验结果
菌株名称 对照生长量(mm) 处理生长量(mm) 抑菌率(％)
MES861 64.86 11.25 82.65
实施例3贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病的防治效果试验
(一)试验药剂
(1)微生物菌液
试验所用微生物菌液为实施例1中所述贝莱斯芽孢杆菌MES861微生物菌液；
化学药剂：40％多菌灵悬浮剂(江苏蓝丰生物化工股份有限公司生产)，用水稀释1000 倍。
(二)试验时间和地点：2018年8月在本公司实验室内进行
(三)试验方法：每个花盆称取900克从甘肃半夏病田中取的土壤加清水拌匀，放入一致规格的花盆中，挑选大小均匀的半夏球茎播种在花盆中，每个处理5盆(每盆3株)，重复三次，在室内自然温度下生长。待半夏球茎刚露芽时在球茎部位浇灌贝莱斯芽孢杆菌菌液或多菌灵，同时设置浇清水对照。调查发病情况，并计算病情指数和防治效果。
(四)试验结果
试验结果见表2和附图2，贝莱斯芽孢杆菌MES861菌液处理后，病情指数(8.27)显著低于空白对照处理后的病情指数(81.28)，而与化学药剂处理后的病情指数(6.35)差异不显著，MES861对半夏根腐病的防治效果达86.43％，说明贝莱斯芽孢杆菌MES861及其微生物菌剂对半夏根腐病防治效果较好。
表2贝莱斯芽孢杆菌MES861对半夏根腐病防效
处理 病情指数 防效(％)
MES861菌液 8.27b 86.43
化学药剂 6.35bc 91.52
空白对照 81.28a 0.00
SEQUENCE LISTING
<110> 天津开发区坤禾生物技术有限公司
<120> 一种防治半夏根腐病菌剂及其制备方法和应用
<140> 201811625699.5
<160> 1
<210> 1
<211> 1492
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis
<400> 1
tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60
gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120
actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac cgcatggttc 180
agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt 240
ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca 360
atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag 420
ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga cggtacctaa 480
ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc 600
cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc 720
gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga cgtccccttc 1020
gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg ggcactctaa 1140
ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa accgcgaggt 1260
taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt 1440
atggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac aa 1492

Claims (10)

1.一种防治半夏根腐病的菌株，其特征是：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）MES861，保藏日期： 2018年12月03日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号：CGMCC No. 16857。
2.根据权利要求1所述的防治半夏根腐病的菌剂，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液为防治半夏根腐病的液态菌剂。
3.根据权利要求2所述的防治半夏根腐病的菌剂，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌发酵制得的发酵液进行喷雾干燥后制得防治半夏根腐病的粉末状菌剂。
4.根据权利要求2所述的防治半夏根腐病的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
液体摇瓶培养基：营养琼脂作为培养基经121-126℃高压灭菌15-30分钟后冷却待用；
挑取贝莱斯芽孢杆菌接种到步骤（1）中所述的液体营养琼脂摇瓶培养基里，在25-30℃、160-200rpm条件震荡培养24-36小时后，制得贝莱斯芽孢杆菌发酵液。
5.根据权利要求4所述的防治半夏根腐病的贝莱斯芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，所述营养琼脂包括5-10g 蛋白胨，1-3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH值为7.0。
6.根据权利要求4所述的防治半夏根腐病的贝莱斯芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为1‰-3‰。
7.根据权利要求5所述的防治半夏根腐病的贝莱斯芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，所述营养琼脂包括10g 蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化钠，1000mL水，pH值为7.0。
8.根据权利要求6所述的防治半夏根腐病的贝莱斯芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，贝莱斯芽孢杆菌的接种量为1‰。
9.根据权利要求4所述的防治半夏根腐病的贝莱斯芽孢杆菌的制剂的制备方法，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌发酵液进行喷雾干燥后制得防治半夏根腐病的粉末状菌剂。
10.根据权利要求2-3任一所述的防治半夏根腐病的菌剂的应用，其特征在于，将防治半夏根腐病的菌剂应用在半夏根腐病的防治中。
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