CN109568414A - 从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和外泌体的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和外泌体的方法及应用。该方法包括如下步骤：将玫瑰花浸泡在生理盐水或PBS中，匀浆，在500～5000g下离心20～40min取第一上清液，将所述第一上清液在10000～15000g下离心80～120min取第二上清液，将所述第二上清液在80000～130000g下离心80～120min，取上清液，得到玫瑰花精华液。本发明得到的玫瑰花外泌体和玫瑰花精华液可以激活皮肤再生，增强皮肤增殖、分化能力，进而调整生理性修复，促进损伤修复。

Description

从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和外泌体的方法及应用
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，更具体地，涉及一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和外泌体的方法及应用。
背景技术
玫瑰花性温，味甘、微苦，归肝、脾经，具有和血散瘀、疏肝解郁、理气调经、柔嫩肌肤之功效。古人喜爱使用新鲜玫瑰花瓣洗浴达到柔嫩肌肤、提神留香之目的。目前市面上玫瑰花产品大多为玫瑰精油、玫瑰纯露、玫瑰细胞液。纯露是精油在蒸馏萃取过程中留下来的水，纯正露中含有微量的酸与脂类物质，化学结构与一般纯水不同，对身体调理很有帮助。玫瑰花细胞液是玫瑰花瓣或玫瑰花蕾在低温烘干过程中蒸发出来的液体，通过物理方法对其进行收集而得到的液体。从制备过程可以看出，玫瑰纯露和玫瑰细胞液的液体除了大量的水分子外，仅含少量的低沸点水溶性物质，大部分活性物质被遗弃。
近年来研究发现植物能够分泌一种囊泡小体，直径在40-100nm，被命名为外泌体，其内选择性包裹脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，具有明确的减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学修复的作用。
皮肤损伤在日常生活极为常见，小到皮肤色素沉积、粗糙、痤疮、粉刺，大到皮肤烧烫伤，创面可大可小，可深可浅，损伤部位各不相同，都会给患者带来烦恼和痛苦。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种对玫瑰花综合利用的方法，该方法包括如下步骤：
将玫瑰花浸泡在生理盐水或PBS中，匀浆，在500～5000g下离心20～40min取第一上清液，将所述第一上清液在10000～15000g下离心80～120min取第二上清液，将所述第二上清液在80000～130000g下离心80～120min，取上清液，得到玫瑰花精华液。
使用该方法得到的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体可以增白美容、延缓皮肤衰老以及加速损伤创面愈合，减少疤痕的形成。该方法也为玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的提取方法。
在本发明一个优选实施方式中，玫瑰花为蔷薇属植物的花瓣。
在本发明一个优选实施方式中，上述方法具体包括如下步骤：
将玫瑰花浸泡在生理盐水或PBS中，匀浆，在1000～3000g下离心30～40min取第一上清液，将所述第一上清液在10000～12000g下离心100～110min取第二上清液，将所述第二上清液在100000～120000g下离心100～120min，取上清液，得到玫瑰花精华液。
在本发明一个优选实施方式中，玫瑰花与所述生理盐水或PBS的重量为1:(1～3)，优选为1:1。
在本发明一个优选实施方式中，还包括将所述玫瑰花精华液过孔径为0.22μm的滤膜。
其中，将第二上清液离心后得到沉淀即包括玫瑰花外泌体。
为了提高玫瑰花外泌体的功效，在本发明一个优选实施方式中，上述方法还包括如下步骤：
收集所述第二上清液在80000～130000g下离心80～120min后的沉淀，加入PBS混悬，加入赋形剂(所述赋形剂的浓度为8～15％)，以1～2℃/min速度降温至-50～-40℃，保持2～3h，在160～200u bar下真空冷冻干燥得玫瑰花外泌体冻干粉。
其中，第二上清液的离心速度和时间优选为在120000～130000g下离心110～120min后再加入PBS混悬。
由该方法得到的玫瑰花外泌体也可以增白美容、延缓皮肤衰老以及加速损伤创面愈合，减少疤痕的形成。该方法也为玫瑰花外泌体的提取方法。
其中，所述赋形剂的浓度优选为10～12％。其中，赋形剂优选为甘露醇。
其中，加入PBS混悬的步骤具体优选为：向沉淀中加入PBS重混，在10000～12000g下离心110～150min，取沉淀用PBS混悬。
其中，加入赋形剂混匀后，优选过孔径为0.22μm的滤膜后再进行降温，进行真空冷冻干燥。
其中，上述真空冷冻干燥的具体步骤优选为：
在160～200u bar下以1～2℃/min从-50～-40℃升至6℃后，再在220～250u bar下以1～2℃/min升至35℃。
其中，在本发明中，上述真空冷冻干燥通常置于冷冻干燥机中进行，具体可以优选为：
置于冷冻干燥机冷冻仓，以1-2℃/min速度降温至-50～-40℃，-40℃维持2～3h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
本发明得到的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体均可以促进皮肤细胞的增殖速度和向创面的迁移能力、加速损伤创面愈合、减少疤痕形成。
本发明的另一目的在于提供上述方法得到的玫瑰花精华液。
本发明的另一目的在于提供上述方法得到的玫瑰花外泌体。
本发明的另一目的在于由上述方法得到的玫瑰花精华液或玫瑰花外泌体在制备增白美容、延缓皮肤衰老以及加速创口愈合的产品中的应用。
本发明所述的产品可以接受的至少一种赋形剂(药物载体)。所述的赋形剂为本领域技术人员所理解，包括但并不局限于崩解剂、润滑剂、分散剂等，本领域技术人员可依据制剂的实际需求加以选择。还可以根据需要向其中加入保湿剂、防腐剂、增白剂、增稠剂、或/和乳化剂。
本发明的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体可用于医药、保健品和化妆品中。
其中，含玫瑰花外泌体的产品的制剂可以是水剂、膏剂、霜剂、膜剂、喷雾剂等形式。为了制备外观和疗效俱佳的制剂，制剂中可以添加各种赋形剂、保湿剂、防腐剂、增白剂、增稠剂、或/和乳化剂。为了增强产品的防腐生肌效果，制剂中还可以添加抗生素、抗病毒、抗感染类药物。含玫瑰花精华液产品的制剂可以是水剂、膏剂、霜剂、膜剂、喷雾剂等形式。本发明的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体可以单独使用，也可复配使用。
本发明的再一目的在于提供一种增白美容、延缓皮肤衰老以及加速创口愈合的制品，该制品包括甘油、吐温和玫瑰花提取物，所述玫瑰花提取物为上述玫瑰花精华液和/或上述的玫瑰花外泌体。
该制品可以包括甘油、丙二醇、吐温、对羟基苯甲酸乙酯、本发明的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体。
制品制备方法可以为(w/v)：将1-5％甘油、1-10％丙二醇，增稠剂为；1-2％吐温、0.1％对羟基苯甲酸乙酯，与10～20ml本发明的玫瑰花精华液混合，再加入10～50μg本发明的玫瑰花外泌体冻干粉，混合后补PBS至100ml终体积，过滤后即得一种水剂。制成的含玫瑰花外泌体和精华素水剂，可以作为喷雾剂、润肤水等，可以喷、涂的方法，用于损伤部位，外泌体与创面接触，释放精华因子，达到加速皮肤的营养更新和修复目的。
本发明的制品也可以包括甘油、吐温、胆固醇、卵磷脂、尼泊金乙酯和本发明的玫瑰花精华液。
本发明的制品可以为含玫瑰花精华液的乳剂形式的产品。乳化形式的产品制备可有水包油或油包水的不同的方法，如可以将10％甘油、2％吐温80、2％胆固醇、5％卵磷脂、0.2％尼泊金乙酯与20ml玫瑰花精华液，补PBS缓冲液至100ml终体积，混合加热均质乳化，均质均匀后0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，即得。
本发明的制品也可以包括甘油、凡士林、羊毛脂、吐温、PEG400、甘油单硬脂酸酯、尼泊金乙酯和本发明的玫瑰花外泌体。
本发明的制品可以为含玫瑰花外泌体的膏、霜剂形式的产品。霜膏剂的制备可有如下组成制剂作为实施例。5％甘油、10％凡士林、2％羊毛脂、1％吐温、5％PEG400、2％甘油单硬脂酸酯、0.2％尼泊金乙酯和60mlPBS缓冲液混合加热均质乳化，再加入10-50μg玫瑰花外泌体冻干粉，加入5ml 0.01M磷酸盐缓冲液，混合后补水至100ml终体积，均质均匀后0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，即得。
本发明的制品还可以与抗生素、抗病毒、抗感染的药物组合，防止感染，增强愈合功效的作用。
本发明的制品也可以包括甘油、凡士林、羊毛脂、吐温、PEG400、甘油单硬脂酸酯、尼泊金乙酯、磺胺嘧啶银、本发明的玫瑰花外泌体和玫瑰花精华液。
本发明的制品也可以为玫瑰花外泌体、玫瑰花精华液和抗生素的组合，制备方法可以为5％甘油、10％凡士林、2％羊毛脂、1％吐温、5％PEG400、2％甘油单硬脂酸酯、0.2％尼泊金乙酯、0.3％磺胺嘧啶银和50mlPBS缓冲液混合加热均质乳化，再加入1-10μg玫瑰花外泌体冻干粉，加入10ml玫瑰花精华液，加入曲酸、光果甘草定、Vc、Ve、熊果苷等物质中一种或几种，混合后补PBS至100ml终体积，均质均匀后0.45μm滤膜过滤除菌和不溶物，得到一种具有预防和治疗损伤继发创面感染、减轻色素沉着、加速创口愈合的产品。
本发明得到的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体可以激活精华再生，增强精华增殖、分化能力，进而调整生理性修复或者清除机体损伤，病变和衰老的精华，促进损伤修复。本发明得到的玫瑰花外泌体应用于保健和美容领域，具有广泛的应用前景，可以将其根据需要加入到化妆品中，开发成具有生物活性功能的产品。本发明得到的玫瑰花外泌体可以制成冻干粉，长期保存，玫瑰精华液去除蛋白成分而保留了其他活性物质，不仅功效明显而且长期储存不易变质。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
本实施例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤如下：
1)取新鲜玫瑰花瓣，加入等量的生理盐水浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，3000g离心30min，收集第一上清液；
2)将步骤1)中第一上清液在10000g离心100min，收集第二上清液；
3)将步骤2)中第二上清液在100000g离心100min，收集上清液，过孔径为0.22μm的滤膜，得玫瑰花精华液；
4)将步骤3)中得到的沉淀加入PBS重混后，在120000g离心120min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬；
5)将步骤4得到的混悬液加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
6)将步骤5)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间约为20～24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，时间约为4～6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
实施例2
本实施例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤如下：
1)取新鲜玫瑰花瓣，加入等量的PBS浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，1000g离心40min，收集第一上清液；
2)将步骤1)中第一上清液在12000g离心100min，收集第二上清液；
3)将步骤2)中第二上清液在120000g离心100min，收集上清液，过孔径为0.22μm的滤膜，得玫瑰花精华液；
4)将步骤3)中得到的沉淀加入PBS重混后，在130000g离心110min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬；
5)将步骤4得到的混悬液加入甘露醇至终浓度为12％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
6)将步骤5)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间约为20～24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，时间约为4～6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
实施例3
本实施例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤如下：
1)取新鲜玫瑰花瓣，加入生理盐水浸泡(玫瑰花瓣和生理盐水的重量为1:3)，组织匀浆机打碎制成匀浆，5000g离心20min，收集第一上清液；
2)将步骤1)中第一上清液在15000g离心80min，收集第二上清液；
3)将步骤2)中第二上清液在130000g离心80min，收集上清液，过孔径为0.22μm的滤膜，得玫瑰花精华液；
4)将步骤3)中得到的沉淀加入PBS重混后，在100000g离心150min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬；
5)将步骤4得到的混悬液加入甘露醇至终浓度为8％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
6)将步骤5)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间约为20～24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，时间约为4～6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
实施例4
本实施例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤如下：
1)取新鲜玫瑰花瓣，加入等量的生理盐水浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，500g离心40min，收集第一上清液；
2)将步骤1)中第一上清液在10000g离心120min，收集第二上清液；
3)将步骤2)中第二上清液在80000g离心120min，收集上清液，过孔径为0.22μm的滤膜，得玫瑰花精华液；
4)将步骤3)中得到的沉淀加入PBS重混后，在100000g离心150min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬；
5)将步骤4得到的混悬液加入甘露醇至终浓度为8％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
6)将步骤5)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间约为20～24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，时间约为4～6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
实施例5
本实施例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤和实施例1中步骤相同，不同在于：
6)将步骤5)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，快速降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，搁板温度由-40℃上升至35℃，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
对比例1
本对比例提供了一种从玫瑰花中提取玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体的方法，具体步骤如下：
1)取新鲜玫瑰花瓣，加入等量的生理盐水浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，在100000g下离心230min，收集上清液，过孔径为0.22μm的滤膜，得玫瑰花精华液；
2)将步骤1)中得到的沉淀加入PBS混悬；
3)将步骤2)得到的混悬液加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后，过孔径为0.22μm的滤膜；
4)将步骤3)得到的滤液分装后置于冷冻干燥机冷冻仓，以1～2℃/min速度降温至-40℃，-40℃维持2h；然后开启真空，使干燥箱获得必要的真空度，建立真空干燥的压力条件，给搁板升温，向产品提供冰晶升华需要的能量。干燥箱真空度维持在160～200μbar，冷凝器温度控制在-50℃～-60℃，搁板温度由-40℃逐步上升至6℃，时间约为20～24h，随后进入解析干燥阶段；搁板温度由6℃上升至35℃，真空度维持在220～250μbar，时间约为4～6h，当制品温度与搁板温度相差1～2℃范围内时，在关闭大蝶阀60s内干燥箱内压力没有明显上升，冻干过程结束，随后压盖，得到玫瑰花外泌体冻干粉。
实验例
防腐性测试
参照个人护理产品委员会(PCPC，前为美国化妆品、盥洗用品和香精协会CTFA)推荐的防腐体系效能评价方法，以经典的防腐单次挑战实验，结果显示，实施例1～5以及对比例1中所提供的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体均可以通过测试。
在动物皮肤损伤实验治疗中，效果依次为实施例1，其次是实施例2，再次是实施例3和4，再优于实施例5，最后为对比例1。
人的皮肤效果实验
随机选取25～40年龄段140皮肤有小缺损的志愿者，随机分为14组，每组10人，将实施例1至5以及对比例1中的玫瑰花精华液以及玫瑰花外泌体冻干粉和市售的含有玫瑰花提取物的产品分别试用于志愿者有小缺损的皮肤上，对比分析各组制剂的效果。其中，冻干粉的用法是与常用量与少量PBS混合，涂抹在小缺损处。
结果显示，统计分析得出，分别试用实施例1的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉志愿组中小缺损的愈合效果最好，最快愈合，其次为分别试用实施例2中的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉的志愿组，再次为分别试用实施例3、4和5中的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉的志愿组，试用对比例1中的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉的效果与市售的效果相差不大。实施例1～5的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉的效果均好于对比例1的玫瑰花精华液和玫瑰花外泌体冻干粉以及市售的含有玫瑰花提取物的产品。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种对玫瑰花综合利用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将玫瑰花浸泡在生理盐水或PBS中，匀浆，在500～5000g下离心20～40min取第一上清液，将所述第一上清液在10000～15000g下离心80～120min取第二上清液，将所述第二上清液在80000～130000g下离心80～120min，取上清液，得到玫瑰花精华液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
将玫瑰花浸泡在生理盐水或PBS中，匀浆，在1000～3000g下离心30～40min取第一上清液，将所述第一上清液在10000～12000g下离心100～110min取第二上清液，将所述第二上清液在100000～120000g下离心100～120min，取上清液，得到玫瑰花精华液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述玫瑰花与所述生理盐水或PBS的重量为1:(1～3)；
和/或，所述玫瑰花为蔷薇属植物的花瓣。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
收集所述第二上清液在80000～130000g下离心80～120min后的沉淀，加入PBS混悬，加入赋形剂，以1～2℃/min速度降温至-50～-40℃，保持2～3h，在160～200u bar下真空冷冻干燥得玫瑰花外泌体冻干粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的具体步骤为：
在160～200u bar下以1～2℃/min从-50～-40℃升至6℃后，再在220～250u bar下以1～2℃/min升至35℃。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述加入PBS混悬的步骤具体为：向沉淀中加入PBS重混，在10000～12000g下离心110～150min，取沉淀用PBS混悬。
7.权利要求1至3中任一项所述的方法得到的玫瑰花精华液。
8.权利要求4至6中任一项所述的方法得到的玫瑰花外泌体。
9.权利要求7所述的玫瑰花精华液或权利要求8所述的玫瑰花外泌体在制备增白美容、延缓皮肤衰老以及加速皮肤创口愈合的产品中的应用。
10.一种增白美容、延缓皮肤衰老以及加速创口愈合的制品，其特征在于，包括甘油、吐温和玫瑰花提取物，所述玫瑰花提取物为权利要求7所述的玫瑰花精华液和/或权利要求8所述的玫瑰花外泌体。
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