CN109567214B - 一种保健型蛋白粉及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种保健型蛋白粉及其制备方法与应用，属于食品领域。针对于现有技术中，产品功效维持时间较短等问题，本发明蛋白粉采用大豆蛋白粉，花生粉，低聚半乳糖，维生素，微量元素，植物发酵蛋白粉，复合BC干粒，真菌粉，乳酸菌发酵蛋白粉，该蛋白多肽粉具有延长营养功能性的特点，可在食用后的一段时间内仍然延续其抗氧化、抗衰老，并具有养胃、对抑制胃溃疡均有良好的保健功效。

Description

一种保健型蛋白粉及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于食品领域，具体涉及一种保健型蛋白粉及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白粉，一般是采用提纯的大豆蛋白、或酪蛋白、或乳清蛋白、或上述几种蛋白的组合体，或者增加其他的营养成分，构成的粉剂，其用途是为缺乏蛋白质的人补充蛋白质。但是随着生活节奏的加快和生活压力的增大，现代人的普遍存在营养不良、亚健康等状态，适当的补充蛋白粉就非常有必要，目前市场上的蛋白粉琳琅满目。
如申请号为201710360356.X的发明专利，公开了“复合蛋白粉”，其特征在于，由以下重量份的原料组成：牛奶粉12-35份，乳酸钙5-15份，杏仁粉3-15份，维生素E4-15份，糖粉10-15份，有机米粉22-50份，碳水化合物14-36份。该复合蛋白粉成本较低，老少皆宜，并且没有任何副作用，长期使用可以改善体质，增强免疫力。
如申请号为201710242868.6的的发明专利，公开了“高钙锌蛋白粉”，其特征在于，由以下重量份的原料组成：胶原蛋白12-36份，乳酸钙3-15份，大豆粉3-15份，复合维生素4-17份，糖粉10-19份，芝麻粉22-45份，虾皮14-37份，鲜奶20-50份。该高钙锌蛋白粉成本较低，老少皆宜，并且没有任何副作用，长期使用可以改善体质，增强免疫力。
虽然其蛋白粉多具有增强免疫力等功效，但其功能相对而言较为单一，且通常对于胃肠道消化能力弱的人会在食用蛋白粉的过程中产生胃部不适，使得蛋白粉的适用人群范围缩小。
此外，使用后蛋白粉功能性往往维持时间较短，需要大量长时间服用才能略加成效，在此过程中易出现副作用，因此，迫切的需要一种新的技术方案解决上述技术问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的技术问题，提供一种保健型蛋白粉，该蛋白多肽粉不仅具有营养、抗氧化、抗衰老等功能特性，且该蛋白粉特别针对胃部不适、胃溃疡等人群，也具有显著的缓解功效，且该蛋白粉可具有延长营养功能性的特点，可在食用后的一段时间内仍然延续其抗氧化、抗衰老等特性。
为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：
一种保健型蛋白粉，主要由以下重量份数的成分组成：大豆蛋白粉20-30份，花生粉5-20份，糖粉0-15份，维生素0.5-2份，微量元素0.1-0.5份，植物发酵蛋白粉5-10份，真菌粉5-20份，乳酸菌发酵蛋白粉10-20份。
优选地，所述保健型蛋白粉中还包括复合细菌纤维素(BC)干粒10-20份。
优选地，所述微量元素为硫酸锌、硫酸镁、甘氨酸铁或甘氨酸锌中的一种或多种。
优选地，所述维生素为维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、维生素D或维生素E中的一种或多种。
优选地，所述真菌粉为茯苓粉、双孢菇粉、杏鲍菇粉、金针菇粉中的一种或多种混合。
优选地，所述植物发酵蛋白粉的制备方法如下：
(1)将燕麦、苹果、番石榴、脐橙和木瓜按照重量比2-6：1-3：1-3：1-3：1-3的比例组织粉碎、离心过滤、高压匀浆后，得到果汁匀浆；
(2)按照接种量1-3％(v/v)将乳酸菌种子液接入果汁匀浆中，30-37℃，静置培养4-6h，之后按接种量1-3％(v/v)将酵母菌接入发酵液中，100-150rpm，震荡培养2-4h，得到发酵混合液；
(3)将发酵混合液经5000-8000rpm，5-15min离心后，将上清液经浓缩后，冷冻干燥制粉，得到植物发酵蛋白粉。
优选地，所述植物发酵蛋白粉的制备步骤(1)中，离心条件为4000-6000rpm，5-10min；所述高压匀浆条件为：20-30MPa，循环1-3次。
优选地，所述植物发酵蛋白粉的制备步骤(2)中，乳酸菌为嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌、动物双歧杆菌或植物乳杆菌中的至少一种。
优选地，所述乳酸菌种子液的制备方法为：将保存在甘油管中乳酸菌以接种量1％-3％接种于MRS培养基中，30-37℃，静置培养6-8h，得到乳酸菌种子液，所述乳酸菌活力为1010-1012cfu/ml。
优选地，所述植物发酵蛋白粉的制备步骤(2)中，所述酵母菌为酿酒酵母菌、富硒酵母菌中的一种。
优选地，所述酵母菌种子液的制备方法为：将保存在甘油管中的酵母菌以接种量3％-5％接种于5°-10°Bx麦芽汁培养基中，28-30℃，180-200rpm，振荡培养6-8h，得到酵母种子液,所述乳酸菌活力为1010-1012cfu/ml。
优选地，所述茯苓粉的制备方法如下：
(1)将冷冻甘油菌分别点接至茯苓固体发酵培养基平板中，将平板于15-20℃静置培养25-35h，之后调节温度10-15℃，静置培养20-30h，调节温度15-20℃静置培养20-35h，再降低温度10-15℃静置培养25-35h；
(2)选择菌丝铺满培养基的平板，将菌体挑入茯苓种子培养基中，15-20℃，140-160rpm摇瓶振荡培养1.5-2.5d；
(3)将种子液按照接种量5-15％接种于茯苓发酵培养基中，在15-20℃条件下，150-165rpm摇瓶振荡培养25-35h，之后向发酵培养基中接入0.1-2％(V/V)的吐温80，低温10-15℃条件下150-165rpm摇瓶振荡培养25-30h，之后向发酵培养基中接入0.1-2％(V/V)的吐温-80，同时将质量浓度为40-50％的葡萄糖水按照接入量5-10％(V/V)接入发酵液，调整20-25℃条件下140-160rpm摇瓶振荡培养20-35h，之后调整温度10-15℃条件下150-165rpm摇瓶振荡培养20-30h，得到发酵液混合物；
(4)将发酵液混合物200-500rpm离心，10-20min，收集菌体，将菌体经过冷冻干燥；将发酵液经纳滤除盐后，将滤液进行旋蒸浓缩，并冻干；将冻干菌体和冻干滤液进行粉碎。
优选地，所述纳滤除盐利用公知技术中的纳滤除盐装置，所选择滤膜为1.4040型纳滤膜元件，透过液为120L，或2.8040型纳滤膜元件，透过液为500L中的一种。
优选地，所述旋蒸浓缩的温度为20-25℃。
所述茯苓种子培养基组成：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母粉2-6g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，余量为水，初始pH值5.5-7。
所述茯苓液体发酵培养基组成：葡萄糖20.0g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，维生素B1 0.01-0.05g/L，余量为马铃薯提取液，pH6.0。
所述茯苓固体发酵培养基组成：葡萄糖20.0g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，添加琼脂15.0g/L，维生素B1 0.01-0.05g/L，余量为马铃薯提取液，pH6.0。
其中，马铃薯提取液：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法如下：
(1)种子液培养：将酵母菌、德氏乳杆菌从冷冻甘油管中分别按照接种量0.5-1％(质量比)混合接种到大豆混合培养基中，于30℃-37℃下，50-100rpm恒温震荡培养8-12h，得种子发酵液；所述种子发酵液中，酵母菌和德氏乳杆菌含量均达1010-1012cfu/ml。
(2)发酵罐培养：将所述种子发酵液按照接种量3％-5％，接种至大豆混合培养基的发酵罐中，50-100rpm，30-37℃条件下恒温震荡培养3-5h后，补加混合籽蛋白溶液，使得混合发酵体系中的混合籽蛋白溶液终浓度(体积百分比)为10％-25％；同时流加质量浓度为0.01-0.08％(质量百分比)的复合微量元素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养0.5-2h后，开始流加质量浓度为0.01-0.06％(质量百分比)的复合维生素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养，发酵罐总发酵时间为12-20h，最终得到乳酸菌发酵液；
(3)乳酸菌发酵蛋白粉的提取：将所述乳酸菌发酵液在5000-8000r/min的转速下离心5-10min，留上清液；将上清液经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液；将所述乳酸菌胞外蛋白的粗提液经喷雾干燥得到乳酸菌发酵蛋白粉。
经测定，乳酸菌发酵蛋白粉中，其蛋白分子量为3000Da的小分子蛋白占总蛋白粉的35％(质量百分比)以上。
优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(1)种子液培养中，所述大豆混合培养基组成为：大豆分离蛋白10-20g/L，葡萄糖20-30g/L，番茄籽粉15-30g/L，pH6.5-6.8，115℃灭菌15min。
优选地，所述大豆混合培养基中，所述番茄籽粉的制备方法如下：将番茄籽经干燥粉碎后，通过挤压膨化装置进行挤压膨化后，继续粉碎后，过200-500目筛，得到番茄籽粉。
优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(1)种子液培养中，所述酵母菌、德氏乳杆菌是经过筛选的菌种，具体筛选方法如下：
(a)液体发酵活化：将酵母菌、德氏乳杆菌从冷冻甘油管中分别接种到大豆混合培养基中进行液体发酵活化，将酵母菌于28-30℃，180-200rpm震荡培养15-20h，将德氏乳杆菌于30-37℃条件下静置培养7-12h，分别得到酵母菌种子液以及德氏乳杆菌种子液；
(b)筛选：将所述酵母菌种子液以及德氏乳杆菌种子液分别稀释涂布到检测培养基上，分别置于28-30℃、30-37℃条件下静置培养12-24h，分别筛选挑去较大菌落，
(c)复壮、保存：将所述菌种筛选方法的步骤(b)中挑取的大菌落继续接入大豆混合培养基中，并重复所述步骤(a)的液体发酵活化步骤，将所得发酵液按照发酵液与20-35％甘油体积比1-3：1混合，-4—-80℃冷冻保存。
优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(2)发酵罐培养中，所述复合微量元素为柠檬酸铵、乙酸钠、FeSO4、MnSO4或CaCO3中的两种或两种以上。
更优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(2)发酵罐培养中，所述复合微量元素的组成为：柠檬酸铵0.01-0.025％、乙酸钠0.005-0.02％、FeSO40.001％-0.005％、MnSO40.001-0.01％、CaCO30.01-0.02％。
更优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(2)发酵罐培养中，所述复合维生素为维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酰胺中一种或两种以上的组合。
优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(2)发酵罐培养中，所述混合籽蛋白溶液主要由紫苏籽、西瓜籽以及碳酸氢钠溶液组成。
更优选地，所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤(2)发酵罐培养中，所述混合籽蛋白溶液具体制备方法如下：
(a)粉碎：将紫苏籽、西瓜籽分别进行干燥粉碎后，按照质量比5-20：1-5混合后，并通过挤压膨化装置进行挤压膨化处理，并粉碎得到混合粉；
(b)溶液混合：向所述混合粉中加入质量浓度为0.05％-0.25％的碳酸氢钠溶液中，混合，所述混合粉与碳酸氢钠溶液的质量比为：4-10：5-15,得到碳酸氢钠溶液混合液；
(c)将所述混合籽蛋白溶液制备步骤(b)中，得到的碳酸氢钠溶液混合液进行高压脉冲电场处理，电场强度10-15kV/cm，脉冲时间100-350μs，脉冲频率100-200Hz，经脉冲后，调节pH6.0-7.0，得到混合籽蛋白溶液。
优选地，所述复合BC干粒的制备方法如下：
(1)种子液培养：从斜面培养基上挑取木醋杆菌两环，接入BC培养基中，28-30℃，120-180rpm恒温摇床培养18-24h，在无菌环境中利用单层脱脂纱布(已灭菌)过滤，收集滤液即为种子液；
(2)发酵培养：将种子液按照接种量1-3％接种于BC培养基中，28-30℃静置培养25-30h后，将培养基置于冰浴中，进行超声处理，电功率200-350W，频率为15-20kHz，作用时间为60-100s，之后将培养基于28-30℃继续静置培养1-3h后，重复上述超声操作(电功率200-350W，频率为15-20kHz，作用时间为60-100s)，继续静置培养1-10h，将发酵培养物以及培养基转置入电场发生装置中，开启电流，电场强度为1-20v，28-30℃静置培养10-40h后，加大电场强度10-30V，静置培养1-5h后，关闭电流，并向电场发生装置中倒入酵母处理液，所述酵母处理液添加量为1-4ml/g纤维素湿膜，继续28-30℃静置培养5-10h，得到BC湿膜；
(3)切块干燥：将BC湿膜机械切块后，进行冷冻干燥，得到BC干粒。
优选地，所述切块后的BC平均粒径为0.5-3mm。
所述，BC湿膜的持水率为80％-90％。
进一步地，所述BC培养基按照重量份数组成为：葡萄糖1-5份、山楂1-20份、苹果1-10份、菊花1-5份、蜂蜜1-10份、葡萄1-20份、石榴1-20份、水50-100份，pH 5.0-6.0；
所述BC培养基的制备方法为：将上述原料按照重量份数比混合，榨汁，经过滤，滤掉颗粒物后，得到BC培养基。
优选地，所述复合BC干粒的制备步骤(2)中，酵母处理液的制备方法，具体步骤如下：
(a)发酵培养：从斜面上挑取两环酵母菌接种于5°-10°Bx麦芽汁培养基中，28-30℃，180-200rpm，振荡培养8-10h，得到酵母种子液；将酵母种子液按照接种量1-5％接种于5°-10°Bx麦芽汁培养基中，28-30℃，180-200rpm，振荡培养8-12h，得到酵母发酵液；
(b)菌体处理：将发酵液经离心5000-6000rpm，5-15min，收集菌体，将菌体重悬浮于质量浓度为0.75-0.90％的NaCl溶液中，控制菌体浓度为(2-8)×(1010-1011)cfu/mL，将菌悬液进行高压脉冲处理，控制电场强度3-6kV/cm，脉冲宽度25-45μs，脉冲数1-4，间隔时间为1-5s，得到酵母处理液。
更优选地，所述复合BC干粒的制备步骤中，所述酵母为富硒酵母。
本发明的另一目的是提供上述保健型蛋白粉的制备方法，具体如下：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉以及乳酸菌发酵蛋白粉以及根据需求选择性添加复合BC干粒，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
本发明的另一目的是提供上述保健型蛋白粉的用途。
所述保健型蛋白粉用途的具体方法为：向所述保健型蛋白粉中加入55-75℃温开水，每日食用10-15g蛋白粉。
有益效果：
1、本发明制备的蛋白多肽粉不仅具有营养、抗氧化、抗衰老等功能特性，且该蛋白粉特别针对胃部不适、胃溃疡等人群，也具有显著的缓解功效，且该蛋白粉可具有延长营养功能性的特点，可在食用后的一段时间内仍然延续其抗氧化、抗衰老等特性。其中植物发酵蛋白利用多种高纤维、维生素食品发酵获得的产品不仅将食品蛋白分子细化，促进消化吸收，而且更有助于促进胃肠道蠕动、排毒养颜等多重功效。
2、利用本发明发酵方法，通过德氏乳杆菌、酵母菌发酵所得的乳酸菌发酵蛋白粉，含有丰富的小分子蛋白肽(蛋白分子量3000Da)，且本发明制备的乳酸菌发酵蛋白粉产率较高，其含量占总乳酸菌发酵蛋白粉的35％以上。此外该蛋白粉不仅有益于人体吸收，达到养胃的功效，此外，其特别针对胃部不适、胃溃疡等人群，也具有显著的缓解功效；其蛋白具有成膜性：可有效抑制胃酸对胃溃疡的侵害，于此同时其可与胃蛋白酶形成竞争关系，(正电荷)通过吸附作用结合胃蛋白酶，从而减轻胃蛋白酶对为溃疡的损伤；此外，该蛋白粉可阻断幽门螺旋杆菌对营养的吸收，抑制幽门螺杆菌活性，从而阻断幽门螺杆菌对人体胃部的侵害。经测定，加入本发明制备的乳酸菌发酵蛋白粉，在小鼠乙醇致胃粘膜损伤的影响的试验中，其抑制率达到80％以上。
此外，在添加有番茄籽蛋白、紫苏籽蛋白以及西瓜籽蛋白后，配合乳酸菌和酵母菌的发酵，具有显著的防腐抑菌效果，蛋白粉成品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌均有显著的抑菌效果，此外通过德氏乳杆菌、酵母菌对于番茄籽的利用驯化，使得其菌株更好地利用番茄籽进行发酵，番茄籽粉经菌种发酵后，产生更有益于人体吸收以及更为显著的抗氧化性的效果经测定，产品的DPPH自由基清除率均在80％以上。
3、本发明发酵制备真菌粉中，茯苓发酵的培养的制备过程中，种子液培养经过连续的梯度降温、回升温度再至降温的驯化培养，使得茯苓在发酵过程中的氨基酸和胞外多糖产生更多的积累，且在茯苓发酵过程中，进行梯度的降温、回升温度、降温过程中，特别选择在第一次降温以及回升温度过程中补加吐温、葡萄糖，更获得了显著的技术效果，再次更突显出添加碳源以及添加时机的重要性。经测定，发酵反应器中茯苓菌细胞干重可达20.53g/L，经测定，其发酵液中的胞外多糖和茯苓酸产量分别为16.23g/L、1.52mg/L，较常规发酵得到的茯苓在干重上，明显提高了38％，在胞外多糖和茯苓酸产量上，分别提高了89％以及53.7％。
此外，本发明制备的茯苓在特定温度环境的生长过程中，其氨基酸含量发生了显著的变化，其总氨基酸含量显著提高，其中其缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸菌有不同程度的提高，特别是丙氨酸以及脯氨酸的含量，较对照组2分别显著提高了52.7％以及44.9％。该性能同时也加强了本发明蛋白粉的提高免疫力功能、抗疲劳等功能特性。
4、经测定，纤维素干重可达到12.98g/L，比空白对照实验提高了31.25％，BC膜对于酵母菌的加载率达到80％以上(通过测定经BC膜结合酵母之后的酵母处理液中的酵母数量，采用梯度稀释平板计数法)。
BC在静电场的作用下，随着孔径的扩大会显著提高其对酵母的加载率，从而在经过人体消化吸收后达到缓释的效果。酵母细胞经过温和脉冲处理后，使其对BC的结合力增强，且酵母的活性物质仍然有所保留，可使酵母及其内溶物等营养成分在肠道内在消化的过程中达到缓释的效果。因此BC膜在静电场作用下的培养与经脉冲处理后的酵母菌的结合作用具有协同性，显著提高了BC对于酵母的负载率，加强了机体中，酵母及其内溶物的缓释作用，可有效延长蛋白粉的功效。
本发明制备的BC，不仅具有优质天然膳食纤维，而且低热量，不含胆固醇，在用温开水引用含有复合BC干粒的蛋白粉中，BC干粒会吸水膨胀，口感滑爽、脆嫩、细腻而有弹性的独特口感。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1原料的制备
植物发酵蛋白粉的制备方法如下：
将燕麦、苹果、番石榴、脐橙和木瓜按照重量比4：1.5：1：1：2的比例组织粉碎、4000rpm，离心5min过滤、高压匀浆20MPa，循环2次，得到果汁匀浆；
按照接种量1％(v/v)将乳酸菌种子液接入果汁匀浆中，37℃，静置培养5h，之后按接种量2％(v/v)将入酵母菌接入发酵液中，120rpm，震荡培养3h，得到发酵混合液；
将发酵混合液经6000rpm，10min离心后，将上清液经浓缩后，冷冻干燥制粉，得到植物发酵蛋白粉。
其中，乳酸菌为嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌按任意比例混合。
所述乳酸菌种子液的制备方法为：将保存在甘油管中乳酸菌以接种量2％接种于MRS培养基中，37℃，静置培养7h，得到乳酸菌种子液，所述乳酸菌活力为1011cfu/ml。
其中，酵母菌为酿酒酵母菌、富硒酵母菌按任意比例混合。
所述酵母菌种子液的制备方法为：将保存在甘油管中的酵母菌以接种量4％接种于6°Bx麦芽汁培养基中，29℃，190rpm，振荡培养7h，得到酵母种子液,所述乳酸菌活力为1011cfu/ml。
所述乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法如下：
(1)种子液培养：将酵母菌、德氏乳杆菌冷冻甘油菌分别按照接种量0.5-1％(质量比)混合接种到大豆混合培养基中，于30℃下，80rpm恒温震荡培养8h，得种子发酵液；
(2)发酵罐培养：将所述种子发酵液按照接种量5％，接种至大豆混合培养基的发酵罐中，80rpm，30℃条件下恒温震荡培养4h后，补加混合籽蛋白溶液，使得混合发酵体系中的混合籽蛋白溶液终浓度为15％；同时流加质量浓度为0.04％的复合微量元素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养2h后，开始流加质量浓度为0.03％的复合维生素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养，发酵罐总发酵时间为12h，最终得到乳酸菌发酵液；
(3)乳酸菌发酵蛋白粉的提取：将所述乳酸菌发酵液在8000r/min的转速下离心10min，留上清液；将上清液经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液；将所述乳酸菌胞外蛋白的粗提液经喷雾干燥得到乳酸菌发酵蛋白粉。
经测定，乳酸菌发酵蛋白粉中，其分子量在3000Da的小分子蛋白占总蛋白粉的45％(质量百分比)。
所述大豆混合培养基组成为：大豆分离蛋白10g/L，葡萄糖30g/L，番茄籽粉25g/L，pH6.5-6.8，115℃灭菌15min。
所述步骤(1)种子液培养中，所述酵母菌、德氏乳杆菌是经过筛选的菌种，具体筛选方法如下：
(a)液体发酵活化：将酵母菌、德氏乳杆菌冷冻甘油菌分别接种到大豆混合培养基中进行液体发酵活化，将酵母菌于28℃，180rpm震荡培养15h，将德氏乳杆菌于37℃条件下静置培养10h，分别得到酵母菌种子液以及德氏乳杆菌种子液；
(b)筛选：将所述酵母菌种子液以及德氏乳杆菌种子液分别稀释涂布到检测培养基上，分别置于28℃、37℃条件下静置培养12h，分别筛选挑去较大菌落，
(c)复壮、保存：将所述菌种筛选步骤(b)中挑取的大菌落继续接入大豆混合培养基中，并重复所述步骤(a)的液体发酵活化步骤，将所得发酵液按照发酵液与30％甘油体积比1：1混合，-80℃冷冻保存。
所述步骤(2)发酵罐培养中，所述复合微量元素的组成为：柠檬酸铵0.01-0.025％、乙酸钠0.005-0.02％、FeSO40.001％-0.005％、MnSO40.001-0.01％、CaCO30.01-0.02％。
所述步骤(2)发酵罐培养中，所述复合维生素为维生素A、维生素B1、维生素B2按照质量比1：1：1混合。
所述步骤(2)发酵罐培养中，所述番茄籽粉的制备方法如下：将番茄籽经干燥粉碎后，通过挤压膨化装置进行挤压膨化后，继续粉碎后，过300目筛，得到番茄籽粉。
所述步骤(2)发酵罐培养中，所述混合籽蛋白溶液主要由紫苏籽、西瓜籽以及碳酸氢钠溶液组成，具体制备方法如下：
(a)粉碎：将紫苏籽、西瓜籽分别进行干燥粉碎后，按照质量比9：5混合后，并通过挤压膨化装置进行挤压膨化处理，并粉碎得到混合粉；
(b)溶液混合：向所述混合粉中加入质量浓度为0.05％-0.25％的碳酸氢钠溶液中，混合，所述混合粉与碳酸氢钠溶液的质量比为：6：5，得到碳酸氢钠溶液混合液；
(c)将所述混合籽蛋白溶液制备步骤(b)溶液混合中，得到的碳酸氢钠溶液混合液进行高压脉冲电场处理，电场强度10kV/cm，脉冲时间200μs，脉冲频率150Hz，经脉冲后，调节pH6.0-7.0，得到混合籽蛋白溶液。
复合BC干粒的制备方法：
(1)种子液培养：从斜面培养基上挑取木醋杆菌两环，接入BC培养基中，28℃，130rpm恒温摇床培养20h，在无菌环境中利用单层脱脂纱布(已灭菌)过滤，收集滤液即为种子液；
(2)发酵培养：将种子液按照接种量2％接种于BC培养基中，28℃静置培养25h后，将培养基置于冰浴中，进行超声处理，电功率200W，频率为15kHz，作用时间为80s，之后将培养基继续培养2h后，重复超声操作，继续静置培养5h，将发酵培养物以及培养基转置入电场发生装置中，开启电流，电场强度为10v，28℃静置培养30h后，加大电场强度25V，静置培养3h后，关闭电流，并向电场发生装置中倒入富硒酵母处理液，所述富硒酵母处理液添加量为2.5ml/g纤维素湿膜，继续28℃静置培养8h，得到BC湿膜；
(3)切块干燥：将BC湿膜机械切块后，进行冷冻干燥，得到BC干粒，所述切块后的BC平均粒径为1-3mm；BC湿膜的持水率为80％-90％。
BC培养基按照重量份数组成为：葡萄糖3份、山楂10份、苹果5份、菊花3份、蜂蜜4份、葡萄5份、石榴6份、水80份，pH 5.0-6.0；
BC培养基的制备方法为：将上述原料按照重量份数比混合，榨汁，经过滤后，得到BC培养基。
所述富硒酵母处理液的制备方法，具体步骤如下：
(a)从斜面上挑取两环酵母菌接种于5°Bx麦芽汁培养基中，28℃，180rpm，振荡培养8h，得到酵母种子液；将酵母种子液按照接种量5％接种于麦芽汁培养基中，28℃，180rpm，振荡培养10h，得到酵母发酵液；
(b)菌体处理：将发酵液经离心5500rpm，10min，收集菌体，将菌体重悬浮于质量浓度为0.80％的NaCl溶液中，控制菌体浓度为6×1010cfu/mL，将菌悬液进行高压脉冲处理，控制电场强度4kV/cm，脉冲宽度25μs，脉冲数1，间隔时间为5s，得到富硒酵母处理液。
茯苓粉的制备方法：
(1)将冷冻甘油菌分别点接至固体发酵培养基平板中，将平板于16-17℃静置培养30h，之后调节温度12-13℃，静置培养25h，调节温度16-17℃静置培养30h，再降低温度12-13℃静置培养30h；
(2)选择菌丝铺满培养基的平板，将菌体挑入种子培养基中，16-17℃，150rpm摇瓶振荡培养2d；
(3)将种子液按照接种量10％接种于发酵培养基中，在16-17℃条件下，160rpm摇瓶振荡培养30h，之后向发酵培养基中接入1％(V/V)的吐温80，低温12-13℃条件下160rpm摇瓶振荡培养25h，之后向发酵培养基中接入1.5％(V/V)的吐温-80，同时将质量浓度为45％的葡萄糖水按照接入量5％(V/V)接入发酵液，调整20℃条件下150rpm摇瓶振荡培养25h，之后调整温度12-13℃条件下160rpm摇瓶振荡培养25h，得到发酵液混合物；
(4)将发酵液混合物300rpm离心，15min，收集菌体，将菌体经过冷冻干燥；将发酵液晶经纳滤除盐后，将滤液进行旋蒸浓缩，并冻干；将冻干菌体和冻干滤液进行粉碎。
所述纳滤除盐利用公知技术中的纳滤除盐装置，所选择滤膜为1.4040型纳滤膜元件，透过液为120L。
所述旋蒸浓缩的温度为20-25℃。
所述种子培养基组成：葡萄糖10-20g/L，蛋白胨5-10g/L，酵母粉2-6g/L，K2HPO40.1-0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，余量为水，初始pH值5.5-7。
所述液体发酵培养基组成：葡萄糖20.0g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，维生素B1 0.01-0.05g/L，余量为马铃薯提取液，pH6.0。
其中，马铃薯提取液：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
所述固体发酵培养基组成：在液体发酵培养基基础上，添加琼脂15.0g/L。
以下实施例2-5所涉及的植物发酵蛋白粉、乳酸菌发酵蛋白粉、复合BC干粒以及茯苓粉的制备方法均按照实施例1中的制备方法制备获得。
实施例2蛋白多肽粉的制备
一种保健型蛋白粉，由以下重量份数的原料组成：大豆蛋白粉25份，花生粉15份，糖粉0份，维生素1份，微量元素0.3份，植物发酵蛋白粉7份，复合BC干粒15份，真菌粉15份，乳酸菌发酵蛋白粉15份。
所述微量元素为硫酸锌、硫酸镁、甘氨酸铁按照质量比1：1：1混合。
所述维生素为维生素A、维生素B2按照质量比1：1混合。
真菌粉为茯苓粉。
保健型蛋白粉的制备方法，具体如下：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉、乳酸菌发酵蛋白粉、复合BC干粒，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
向所述保健型蛋白粉中加入60℃温开水，每日食用10g蛋白粉。
实施例3蛋白多肽粉的制备
一种保健型蛋白粉，由以下重量份数的原料组成：大豆蛋白粉25份，花生粉15份，糖粉1份，维生素0.5份，微量元素0.4份，植物发酵蛋白粉7份，真菌粉15份，乳酸菌发酵蛋白粉15份。
所述微量元素为甘氨酸铁、甘氨酸锌按照质量比1：1混合。
所述维生素为维生素B2、维生素C、维生素D、维生素E按照质量比1：1：2：1混合。
所述真菌粉为茯苓粉。
保健型蛋白粉的制备方法，具体如下：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉以及乳酸菌发酵蛋白粉，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
向所述保健型蛋白粉中加入65℃温开水，每日食用11g蛋白粉。
实施例4蛋白多肽粉的制备
一种保健型蛋白粉，由以下重量份数的原料组成：大豆蛋白粉30份，花生粉20份，糖粉10份，维生素2份，微量元素0.1份，植物发酵蛋白粉10份，复合BC干粒5份，真菌粉20份，乳酸菌发酵蛋白粉10份。
所述微量元素为甘氨酸锌。
所述维生素为维生素B1。
真菌粉为茯苓粉、双孢菇粉、杏鲍菇粉按照质量比5：1：1进行混合。
保健型蛋白粉的制备方法，具体如下：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉、乳酸菌发酵蛋白粉、复合BC干粒，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
向所述保健型蛋白粉中加入70℃温开水，每日食用12g蛋白粉。
实施例5蛋白多肽粉的制备
一种保健型蛋白粉，由以下重量份数的原料组成：大豆蛋白粉28份，花生粉8份，糖粉2份，维生素1.5份，微量元素0.2份，植物发酵蛋白粉6份，复合BC干粒15份，真菌粉16份，乳酸菌发酵蛋白粉10份。
所述微量元素为硫酸锌、硫酸镁、甘氨酸铁及甘氨酸锌按照质量比1：2：3：2混合。
所述维生素为维生素A、维生素B2、维生素B6、维生素E按照质量比1：1：1：2混合。
所述真菌粉为茯苓粉与金针菇粉按照质量比2：0.5。
保健型蛋白粉的制备方法，具体如下：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉、乳酸菌发酵蛋白粉、复合BC干粒，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
向所述保健型蛋白粉中加入55℃温开水，每日食用15g蛋白粉。
实施例6：茯苓菌体氨基酸的测定
按中华人民共和国国家标准GB/T 5009.124-2003测定茯苓菌体的氨基酸含量。
实验组：本发明实施例1制备的茯苓；
对照组1：天然茯苓；
对照组2：常规发酵茯苓，具体方法为利用本发明相同的茯苓菌种进行发酵，(1)将冷冻甘油菌分别点接至固体发酵培养基平板中，将平板于静置培养2d；
(2)选择菌丝铺满培养基的平板，将菌体挑入种子培养基中，23-28℃，140-160rpm摇瓶振荡培养1.5-2.5d；
(3)将种子液按照接种量5-15％接种于发酵培养基中，在23-28℃条件下，140-160rpm摇瓶振荡培养5-5.5d；
(4)将发酵液混合物200-500rpm离心，10-20min，收集菌体，将菌体经过冷冻干燥并粉碎。
测定其氨基酸含量见下表1：
表1氨基酸含量
组别 总氨基酸％ 丙氨酸％ 缬氨酸％ 亮氨酸％ 天冬氨酸％ 谷氨酸％ 脯氨酸％ 赖氨酸％
对照组1 1.95±0.09 0.06±0.00 0.76±0.04 0.18±0.01 0.08±0.01 0.08±0.00 0.05±0.00 0.04±0.00
对照组2 27.68±0.15 1.65±0.01 2.54±0.02 1.55±0.10 1.98±0.14 3.1±0.24 2.65±0.12 2.05±0.12
实验组 35.45±0.15 2.52±0.12 3.01±0.07 1.75±0.12 2.56±0.13 3.45±0.21 3.84±0.14 2.51±0.01
由表1可以看出，本发明制备的茯苓在特定温度环境的生长过程中，其氨基酸含量发生了显著的变化，其总氨基酸含量显著提高，其中其缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸菌有不同程度的提高，特别是丙氨酸以及脯氨酸的含量，较对照组2分别显著提高了52.7％以及44.9％。
实施例7蛋白多肽粉的应用实验
试验动物
体重20-25g的健康雄性昆明小白鼠45只。
1.2主要试剂
超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒。
1.3试验设计
将45只小白鼠，随机分为3组，即实验组1、对照组1和对照组2，每组3个重复，每个重复5只，按重复在同一代谢笼中喂养，个体间差异不显著。第一组：投喂期15d，在15d中每日饲喂基础日粮同时灌胃蛋白粉，灌胃容量为0.4ml/20g体重，蛋白粉浓度为5g/100ml，投喂期15d后，测定数据；第二组：同样的方式和蛋白投喂剂量，在第15d后，第16d继续每天喂食饲料，停止喂食蛋白粉，在第20d测定数据；第三组：同样的方式和蛋白投喂剂量，在第15d后，第16d继续每天喂食饲料，停止喂食蛋白粉，在第25d测定数据。
其中：对照组1：饲喂基础日粮，同时喂食蒸馏水；
对照组2：饲喂基础日粮，同时灌胃普通蛋白粉混合物，蛋白粉混合物为普通市售蛋白粉，其中市售蛋白粉中，按照质量百分比0.5％混入由实施例1对照组2制备的茯苓粉，按照质量百分比0.2％添加市售乳酸菌发酵蛋白粉(嗜热乳杆菌、植物乳杆菌发酵得到)，按照质量百分比0.1％加入普通的未经实施例处理的富硒酵母。
实验组1：饲喂基础日粮，同时灌胃本发明实施例2制备的蛋白粉。
实验组2：饲喂基础日粮，同时灌胃本发明实施例3制备的蛋白粉。
基础日粮成分包括：玉米粉、小麦粉、小埋伏、豆饼、鱼粉、燕麦皮。
1.4饲养管理
试验期间保证充足饲料，自由饮水，详细记录剩料量、添加量和损耗量。温度(25±3)℃，相对湿度为55％，自然光照。
1.5测定项目及方法
1.5.1样品采集
在试验最后3d收集各个代谢笼中的粪便，除杂烘干后回潮，制成分析样。试验第28天时所有小白鼠空腹12h后称重并记录。随机从每组选择6只小白鼠，摘眼球采血，3500r/min离心10min，分离血清，分装于EP管中，做好标记，-20℃保存，备用。采血结束后迅速剖开腹腔，剥离脾脏、肝脏、肾脏，用生理盐水冲洗，-70℃保存，备用。
1.5.2表观消化率的测定
采用常规分析方法测定饲料及粪样分析样中的水分、脂肪、蛋白质、灰分、钙、磷的含量，计算饲料表观消化率。
1.5.3生长性能的测定
根据饲料剩余量、添加量和损耗量来计算平拘日采食量；根据初始和结束小鼠空腹重量计算平均日增重；根据平均日采食量与平均日增重计算料重比。
1.5.4脏体比的测定
将取下的脾脏、肾脏、肝脏等脏器称重，计算脏体比。
1.5.5血液指标的测定
取分离后血清分别测定谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量。
1.6数据的统计分析
采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，结果以“平均值±标准误”表示。
2结果与分析
2.1蛋白粉对小鼠表观消化率的影响
表2蛋白粉对小鼠表观消化率的影响
Figure BDA0001850972260000141
Figure BDA0001850972260000142
由表1可以看出，与对照组1相比，实验组1和实验组2在喂食普通蛋白粉的小鼠表现出其干物质、灰分、蛋白质以及脂肪的消化率有所提高，但随着停止喂食，其各成分的消化率又逐渐回复到正常的状态。而喂食本发明的蛋白粉，具有持续发挥其功能的作用，在停止喂食的第25天后，在第30d和第35d，其蛋白粉仍有效持续发挥功能性的作用，从而说明蛋白粉中的益生菌不仅定植在胃肠道中，且其有效成分在肠道内发挥了缓释的功效。
2.2小鼠生长性能的影响
表3小鼠生长性能测试
Figure BDA0001850972260000143
Figure BDA0001850972260000151
2.3蛋白粉对小鼠血液指标的影响
仅测定饲喂第15d和第25d的组别数据
表4小鼠的血液指标测定
Figure BDA0001850972260000152
由表3可以看出，与对照组相比，在喂食有普通蛋白粉的小鼠富硒组小鼠血清MDA含量有明显的降低趋势；SOD活性明显提高；GSH-Px含量有所提高；而在第25d停止喂食蛋白粉后，其各项指标又逐渐恢复到不添加蛋白粉的初始状态。而喂食添加有本发明的蛋白粉的的小鼠，其MDA含量呈现明显降低的趋势，SOD活性以及GSH-Px含量显著提高。特别在第25d后，其MDA含量仍然呈现出下降的趋势，其SOD活性以及GSH-Px含量仍然维持在较高的水平。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例7的性能测定中具有相近的技术效果。
实施例8蛋白多肽粉的应用实验
1负重游泳试验：
实施例8中的小鼠品种、体重、育龄、灌喂方式以及分组同实施例7，仅在在第15d和第25d测定相关数据。
投喂第15d、第20d时，在投喂30分钟后，将小鼠放入水中游泳，水深20cm，水温25±1.0℃，鼠尾根部负载6％体重的实心重物，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。结果如表5所示，
表5：样品对小鼠负重游泳时间的影响
Figure BDA0001850972260000161
2血乳酸的测定：
分别在投喂第15d、20d时，在喂食30分钟后，在温度30℃水中游泳15分钟，取出，测量血乳酸，热风烘干后，安静20分钟，再测血乳酸。试验结构如表
表6：样品对小鼠运动前后血乳酸的影响
Figure BDA0001850972260000162
3尿素测定：
分别在投喂第15d、20d时，在喂食30分钟后，将小鼠放入30℃水中游泳90分钟，取出，热风烘干，使安静，取鼠血，离心，取血清测尿素。结果如表15所示。
表7：样品对小鼠运动后血清尿素的影响
Figure BDA0001850972260000171
本发明蛋白粉能明显有效延长小鼠负重游泳时间，有效减缓小鼠血乳酸升高，降低血清尿素含量。说明本发明的蛋白粉对小鼠具有增强免疫力功能，对小鼠具有缓解体力疲劳功能。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例8的性能测定中具有相近的技术效果。
实施例9蛋白多肽粉的应用实验肝糖原测定
实施例9中的小鼠品种、体重、育龄、灌喂方式以及分组同实施例7，仅在在第15d测定相关数据。
在连续给样15天后，于末次给样后60分钟，取出小鼠肝脏，测肝糖原。结果见表8
表8样品对小鼠肝糖原的影响
Figure BDA0001850972260000172
同时由肝糖原的消耗，也可以看出本发明的蛋白粉对小鼠具有增强免疫力功能，对小鼠具有缓解体力疲劳功能。特别是具有高含量丙氨酸的茯苓真菌粉可以有效发挥缓解低血糖、改善身体能量的作用。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例9的性能测定中具有相近的技术效果。
实施例10蛋白粉在预防治疗胃溃疡中的应用
对照组1：饲喂基础日粮，同时喂食蒸馏水；
对照组2：饲喂基础日粮，同时灌胃普通蛋白粉混合物，蛋白粉混合物为普通市售蛋白粉，其中市售蛋白粉中，按照质量百分比0.5％混入由实施例1对照组2制备的茯苓粉，按照质量百分比0.2％添加市售乳酸菌发酵蛋白粉(嗜热乳杆菌、植物乳杆菌发酵得到)，按照质量百分比0.1％加入普通的未经实施例处理的富硒酵母。
对照组3：饲喂基础日粮，同时灌胃对比例1制备的蛋白粉。
对比例1：蛋白粉的其他组成和制备方法同实施例3制备的蛋白粉，唯一不同的乳酸菌发酵蛋白粉的制备，其中乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法如下：
(1)种子液培养：同实施例1；
(2)发酵罐培养：将所述种子发酵液按照接种量5％，接种至大豆混合培养基的发酵罐中，80rpm，30℃恒温震荡培养48h(发酵最佳时间)，最终得到乳酸菌发酵液；
(3)乳酸菌发酵蛋白粉的提取：同实施例1
所述大豆混合培养基组成同实施例1。
经测定，乳酸菌发酵蛋白粉中，其分子量在3000Da的小分子蛋白占20％左右。
对照组4：饲喂基础日粮，同时灌胃对比例2制备的蛋白粉。
对比例2：蛋白粉的其他组成和制备方法同实施例3制备的蛋白粉，唯一不同的乳酸菌发酵蛋白粉的制备，其中乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法如下：
(1)种子液培养：同实施例1；
(2)发酵罐培养：将所述种子发酵液按照接种量3％，接种至大豆混合培养基的发酵罐中，80rpm，30℃恒温震荡培养6-8h后，流加浓度为65g/L的葡萄糖，流加速度为20-30mL/h，继续震荡培养20-25h，
(3)乳酸菌发酵蛋白粉的提取：同实施例1
所述大豆混合培养基组成同实施例1。
经测定，乳酸菌发酵蛋白粉中，其分子量在3000Da的小分子蛋白占25％左右。
实验组1：饲喂基础日粮，同时灌胃本发明实施例2制备的蛋白粉。
实验组2：饲喂基础日粮，同时灌胃本发明实施例3制备的蛋白粉。
选择体重20-25g的昆明小白鼠45只。将45只小白鼠，随机分为3组，即实验组1、对照组1和对照组2，每组3个重复，每个重复5只，试验采用乙醇致胃粘膜损伤模型。各组动物连续给药10天后，禁食不进水24小时，第10天给予无水乙醇0.1ml/10g，1小时后，脱臼处死，解剖取胃放入10％的福尔马林中浸泡10分钟，然后沿胃大弯剖开，按照Guth法测定胃粘膜损伤指数，计算胃黏膜损伤抑制率，计算公式：胃黏膜损伤抑制率＝(模型组损伤指数-给药组损伤指数)/模型组损伤指数×100％。
表9样品对小鼠乙醇致胃粘膜损伤的影响
Figure BDA0001850972260000181
Figure BDA0001850972260000191
试验结果如表9，试验结果表明，实验组1、2对酒精引起的胃黏膜损伤均具有显著的保护作用。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例10的性能测定中具有相近的技术效果。
实施例11蛋白粉的防腐性能测定
将本发明实施例制备的蛋白粉与实验组蛋白粉同样放在低温条件下(4-10℃)存储24个月后，取1g蛋白粉，用无菌水稀释，进行微生物指标的检测：
对照组1：市售蛋白粉，含有山梨酸钾防腐剂(添加量0.5g/kg)；
对照组2：按照实施例2的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是蛋白粉中不添加乳酸菌发酵蛋白粉；
对照组3：按照实施例2的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是添加的乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法有以下不同：发酵步骤(2)发酵罐培养中，不流加混合籽蛋白溶液，而是在乳酸菌发酵蛋白粉成品中添加等量的混合籽蛋白溶液，混合，喷雾干燥。
对照组4：按照实施例3的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是添加的乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法有以下不同：发酵步骤(2)发酵罐培养中，不流加混合籽蛋白溶液，而是在乳酸菌发酵蛋白粉成品中添加等量(实施例3流加混合籽蛋白溶液的添加量)的混合籽蛋白溶液，混合，喷雾干燥。
实验组1：实施例2制备的蛋白粉；
实验组2：实施例3制备的蛋白粉；
表10微生物指标的检测
组别 大肠杆菌(cfu/mL) 金黄色葡萄球菌(cfu/mL) 枯草芽孢杆菌(cfu/mL)
对照组1 0 10±1 0
对照组2 1232±10 1454.18±12 123±2
对照组3 48±10 102±4 36±1
对照组4 46±11 103±5 35±2
实验组1 0 22±2 0
实验组2 0 25±4 0
由表10可以看出，本发明的乳酸菌发酵蛋白粉中，具有较好的抑菌效果，同时乳酸菌、酵母菌结合紫苏籽粉的发酵显著提高了产品的抑菌效率。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例11的性能测定中具有相近的技术效果。
实施例12蛋白粉的抗氧化性能测定
自由基是新陈代谢的副产物，在体内稳态平衡失调的情况下，过多的自由基和活性氧的产生、反应会导致许多疾病的发生、发展及有机体的衰老过程。因此，探讨蛋白粉对自由基的清除作用具有重要意义。DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，在517nm附近有强吸收(呈深紫色)。而当有自由基清除剂存在时，DPPH的孤对电子被配对，其517nm吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。
将样品分为6组，并用水分别配置成10mg/mL的溶液进行测定。
对照组1：市售蛋白粉；
对照组2为按照实施例2的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是蛋白粉中不添加乳酸菌发酵蛋白粉；
对照组3为按照实施例2的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是添加的乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法有以下不同：发酵过程中，大豆混合培养基组成为：大豆分离蛋白10g/L，葡萄糖30g/L，pH6.5-6.8，115℃灭菌15min；并且在制备得到的乳酸菌发酵蛋白粉成品中添加2％的番茄籽粉(番茄籽的制备方法同实施例2)；
对照组4为按照实施例2的方法制备的蛋白粉，唯一不同的是添加的乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法有以下不同：发酵过程中，大豆混合培养基组成为：大豆分离蛋白10g/L，葡萄糖30g/L，pH6.5-6.8，115℃灭菌15min，并且在制备得到的乳酸菌发酵蛋白粉成品中添加2％的番茄籽油；
番茄籽油的制备方法为：番茄籽油的提取分别取干燥粉碎后的番茄籽，以正己烷(≥98.5％)作溶剂，用索氏提取器提取5h，经真空冷冻干燥挥干残留溶剂，得番茄籽油。番茄籽油的精炼方法详见文献(8]董海洲，张绪霞，刘传富，等.番茄籽油的提取研究[J]中国粮油学报，2007，22(6)：113-117.)。
实验组1：实施例2制备的蛋白粉；
实验组2：实施例3制备的蛋白粉；
Figure BDA0001850972260000201
Figure BDA0001850972260000211
由此可以看出本发明制备的蛋白粉中，即使在不添加乳酸菌发酵蛋白粉时，其抗氧化活性也显著高于普通的市售蛋白粉；此外，乳酸菌发酵蛋白粉中，番茄籽粉与乳酸菌、酵母菌有效发酵配合，使得蛋白粉的抗氧化活性有了显著的提高，其效果优于单独添加番茄籽粉以及番茄籽油的技术效果。
需要说明的是，本发明实施例4-5同样具有与实施例2在上述实施例12的性能测定中具有相近的技术效果。

Claims (7)

1.一种保健型蛋白粉，其特征在于，由以下重量份数的成分组成：大豆蛋白粉20-30份，花生粉5-20份，糖粉0-15份，维生素0.5-2份，微量元素0. 1-0.5份，植物发酵蛋白粉5-10份，真菌粉5-20份，乳酸菌发酵蛋白粉10-20份，其中，
所述乳酸菌发酵蛋白粉的制备方法如下：
（1）种子液培养：将酵母菌、德氏乳杆菌分别按照接种量0.5-1%混合接种到大豆混合培养基中，于30℃-37℃下，50-100rpm恒温震荡培养8-12h，得种子发酵液；
（2）发酵罐培养：将所述种子发酵液按照接种量3%-5%，接种至大豆混合培养基的发酵罐中，50-100rpm，30-37℃条件下恒温震荡培养3-5h后，补加混合籽蛋白溶液，使得混合发酵体系中的混合籽蛋白溶液终浓度为10%-25%；同时流加质量浓度为 0.01-0.08%的复合微量元素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养0.5-2h后，开始流加质量浓度为0.01-0.06%的复合维生素，控制流量10-15mL/h，继续震荡培养，发酵罐总发酵时间为12-20h，最终得到乳酸菌发酵液；
（3）乳酸菌发酵蛋白粉的提取：将所述乳酸菌发酵液在5000-8000r/min的转速下离心5-10min，留上清液；将上清液经透析除盐、浓缩得到乳酸菌胞外蛋白的粗提液；将所述乳酸菌胞外蛋白的粗提液经喷雾干燥得到乳酸菌发酵蛋白粉；
所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤（1）种子液培养中，所述大豆混合培养基组成为：大豆分离蛋白10-20g/L，葡萄糖20-30 g/L，番茄籽粉15-30g/L，pH6.5-6.8；
所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤（2）发酵罐培养中，所述复合微量元素为柠檬酸铵、乙酸钠、FeSO4、MnSO4或CaCO3 中的两种或两种以上；
所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤（2）发酵罐培养中，所述复合维生素为维生素A、维生素B1、维生素B2、烟酰胺中一种或两种以上的组合；
所述乳酸菌发酵蛋白粉制备步骤（2）发酵罐培养中，所述混合籽蛋白溶液主要由紫苏籽、西瓜籽以及碳酸氢钠溶液组成；
所述植物发酵蛋白粉的制备方法如下：
（1）将燕麦、苹果、番石榴、脐橙和木瓜按照重量比2-6:1-3:1-3:1-3:1-3的比例组织粉碎、离心过滤、高压匀浆后，得到果汁匀浆；
（2）按照接种量1-3%（v/v）将乳酸菌种子液接入果汁匀浆中，30-37℃，静置培养4-6h，之后按接种量1-3%（v/v）将酵母菌接入发酵液中，100-150rpm，震荡培养2-4h，得到发酵混合液；
（3）将所述发酵混合液经5000-8000rpm，5-15min离心后，将上清液经浓缩后，冷冻干燥制粉，得到植物发酵蛋白粉。
2.一种如权利要求1所述的一种保健型蛋白粉，其特征在于，所述保健型蛋白粉中还包括复合BC干粒10-20份，其中，
所述复合BC干粒的制备方法如下：
（1）种子液培养: 从斜面培养基上挑取木醋杆菌两环，接入BC培养基中，28-30℃，120-180 rpm 恒温摇床培养 18-24 h，在无菌环境中利用单层脱脂纱布过滤，收集滤液即为种子液；
（2）发酵培养：将种子液按照接种量 1-3% 接种于BC培养基中，28-30℃静置培养25-30h后，将培养基置于冰浴中，进行超声处理，电功率200-350W，频率为15-20kHz，作用时间为60-100s，之后将培养基继续培养1-3h后，重复超声操作，继续静置培养1-10h，将发酵培养物以及培养基转置入电场发生装置中，开启电流，电场强度为 1-20v，28-30℃静置培养10-40h后，加大电场强度10-30V，静置培养1-5h后，关闭电流，并向电场发生装置中倒入酵母处理液，所述酵母处理液添加量为1-4ml/g纤维素湿膜，继续28-30℃静置培养5-10h，得到BC湿膜；
（3）切块干燥：将BC湿膜机械切块后，进行冷冻干燥，得到BC干粒；
所述BC培养基按照重量份数组成为：葡萄糖1-5份、山楂1-20份、苹果1-10份、菊花1-5份、蜂蜜1-10份、葡萄1-20份、石榴1-20份、水50-100份，pH 5.0-6.0；
所述酵母处理液的制备方法，具体步骤如下：
（a）发酵培养：从斜面上挑取两环酵母菌接种于5°-10°Bx麦芽汁培养基中，28-30 ℃，180-200rpm，振荡培养8-10h，得到酵母种子液；将酵母种子液按照接种量1-5%接种于5°-10°Bx麦芽汁培养基中，28-30 ℃，180-200rpm，振荡培养8-12h，得到酵母发酵液；
（b）菌体处理：将发酵液经离心5000-6000 rpm，5-15min，收集菌体，将菌体重悬浮于质量浓度为0.75-0.90%的NaCl溶液中，控制菌体浓度为（2-8）×（1010-1011）cfu/mL，将菌悬液进行高压脉冲处理，控制电场强度3-6kV/cm，脉冲宽度25-45μs，脉冲数1-4，间隔时间为1-5s ，得到酵母处理液。
3.如权利要求1所述的一种保健型蛋白粉，其特征在于，所述微量元素为硫酸锌、硫酸镁、甘氨酸铁及甘氨酸锌中的一种或多种；所述维生素为维生素A 、维生素B1 、维生素B2 、维生素B6、维生素C 、维生素D、维生素E 中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的一种保健型蛋白粉，其特征在于，所述真菌粉为茯苓粉、双孢菇粉、杏鲍菇粉、金针菇粉中的一种或多种混合。
5.如权利要求4所述的一种保健型蛋白粉，其特征在于，所述茯苓粉的制备方法如下：
（1）将冷冻甘油菌分别点接至茯苓固体发酵培养基平板中，将平板于15-20℃静置培养25-35h，之后调节温度10-15℃，静置培养20-30h，调节温度15-20℃静置培养20-35h，再降低温度10-15℃静置培养25-35h；
（2）选择菌丝铺满培养基的平板，将菌体挑入茯苓种子培养基中，15-20℃，140-160rpm摇瓶振荡培养1.5-2.5d；
（3）将种子液按照接种量5-15%接种于茯苓发酵培养基中，在15-20℃条件下，150-165rpm摇瓶振荡培养25-35h，之后向发酵培养基中接入0.1-2% ( V/V)的吐温80，低温10-15℃条件下150-165rpm摇瓶振荡培养25-30h，之后向发酵培养基中接入0.1-2% ( V/V)的吐温-80，同时将质量浓度为40-50%的葡萄糖水按照接入量5-10%( V/V)接入发酵液，调整20-25℃条件下140-160rpm摇瓶振荡培养20-35h，之后调整温度10-15℃条件下150-165rpm摇瓶振荡培养20-30h，得到发酵液混合物；
（4）将发酵液混合物200-500rpm离心，10-20min，收集菌体，将菌体经过冷冻干燥；将发酵液经纳滤除盐后，将滤液进行旋蒸浓缩，并冻干；将冻干菌体和冻干滤液进行粉碎。
6.权利要求2所述保健型蛋白粉的制备方法，其特征在于：将所述大豆蛋白粉、花生粉、糖粉、维生素、微量元素、植物发酵蛋白粉、真菌粉、乳酸菌发酵蛋白粉以及根据需求选择性添加所述复合BC干粒，按照上述比例进行干粉混合，并进行无菌罐装。
7.权利要求1-5任一所述保健型蛋白粉的用途，其特征在于：所述保健型蛋白粉用途的具体方法为：向所述保健型蛋白粉中加入55-75℃温开水，每日食用10-15g蛋白粉。
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