CN109562193A - 用于癌病变选择性标志的水凝胶基纳米乳液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个实施方案涉及一种纳米乳液及其制备方法，所述纳米乳液包括：油相成分、表面活性剂和水相成分，其中，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类和透明质酸。

Description

用于癌病变选择性标志的水凝胶基纳米乳液及其制备方法
技术领域
本公开涉及一种用于癌病变选择性标志的水凝胶基纳米乳液及其制备方法。
背景技术
通过一般造影剂对发育不良(dysplasia)和早期癌症的诊断是由于病变边界面的模糊形态，而进行可疑部位的随机活组织检查，因此，很难正确诊断病变部的癌症。因此，开发了手术辅助技术以实时准确地检测病变并有效地在手术期间显示切除部位。
因此，为了在通过外科切除手术或医疗设备的诊断过程中更能够更容易和更准确地诊断癌症，已有选择性地吸附到癌病变后染色的技术需求。根据所述技术需求，已经对用于开发人体癌病变选择性或癌细胞靶向定向型的染色剂的纳米粒子或组合物进行了研究。
[引用列表]
(专利文献1)韩国公开专利公报第10-2009-0097582号
发明内容
技术问题
本公开的一方面提供了一种有效地将人体的癌症选择性标志和癌细胞靶向定向型的染色剂传达到癌病变部的纳米乳液及其制备方法，以在癌症治疗中，医生在通过外科切除手术或医疗设备的诊断过程中能够准确诊断和治疗。
问题的解决方案
根据本公开的一个方面，提供一种纳米乳液，其包括：油相成分、表面活性剂及水相成分，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类及透明质酸。
另外，所述纳米乳液包括由所述水溶性活性成分、多糖类和透明质酸组成的互穿聚合物网络(Interpenetrating polymer network)结构。
在本公开的一个实施例，所述纳米乳液的粒子平均大小是200nm或以下。
在本公开的另一个实施例中，所述纳米乳液是油包水型乳液。
此外，基于所述纳米乳液的总重量，所述纳米乳液包括70重量百分比至80重量百分比的所述油相成分、10重量百分比至20重量百分比的所述水相成分，以及5重量百分比至15重量百分比的所述表面活性剂。
所述表面活性剂包括单一表面活性剂或助表面活性剂中的至少一种。
在本公开的一个实施例中，包括在所述纳米乳液的纳米粒子平均大小的分布度是0.2至0.7，所述ZETA电位的值是-20mV至-50mV。
在本公开的一个实施例，所述多糖类是藻酸盐。
在本公开的一个实施例，所述水溶性活性成分可以是水溶性色素或水溶性药物。
具体而言，所述水溶性色素可选自靛蓝胭脂红(Indigocarmine)、亚甲蓝(Methylene blue)、鲁哥氏溶液(Lugol溶液)、甲苯胺蓝(Toluidine blue)、刚果红(Congored)、苯酚红(Phenol red)、吲哚菁绿(Indocyanin green)、荧光素钠(FluoreceinSodium)及印度墨水(India ink)中的其中一种，所述水溶性色素的浓度为1mM至10mM。
本公开的所述纳米乳液的亲水亲油平衡值为6至9情况有利于调节纳米乳液的尺寸。
本公开还提供所述纳米乳液的制备方法，其包括：准备油相成分的步骤；准备表面活性剂的步骤；准备水相成分的步骤；以及搅拌混合所述油相成分、所述表面活性剂以及所述水相成分的步骤，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类以及透明质酸。
本公开的准备所述水相成分的步骤包括：准备包括所述多糖类及透明质酸的第一水相成分的步骤，以及准备包括所述水溶性活性成分的第二水相成分的步骤，所述第一水相成分和第二水相成分的重量比为1∶0.5至1∶2。
有益效果
在使用根据本公开一方面的纳米乳液的情况下，可以对通过造影剂的早期癌症的诊断的活性化有很大贡献。
另外，通过有效地将人体的癌症选择性标志传达到癌病变部，不仅可以发现早期癌症，而且可以最大化医生对癌病变部位诊断的准确度及在外科手术期间时通过有效的切除的癌症治疗效果。
此外，通过调节纳米乳液的活性成分，不仅可诊断癌症，更可以预期到对癌症的治疗和对症状的缓解。
根据本公开另一方面的纳米乳液具有通过临床前及临床试验阶段，并以相对简单的制备方法大量生产能够商用化的制剂的优点。
最后，通过根据本公开一方面的纳米乳液的制备方法所形成的纳米乳液可以提供具有均质性及优异的热力学稳定性的纳米粒子。
附图说明
图1是显示由水溶性活性成分、多糖类及透明质酸组成的互穿聚合物网络(Interpenetrating polymer network)结构及纳米粒子的癌症靶向定向性的图。
图2是显示癌细胞和纳米乳液的相互作用的图。
图3是显示在制备粒子之前用光学显微镜观察的图像和制备粒子之后用扫描电子显微镜观察的图像的图。
图4是显示根据亚甲蓝浓度的吸光度和各浓度的吸光度值的线性关系的图。
图5是显示亚甲蓝和纳米乳液的(A)吸光度及(B)分光荧光计的荧光光谱的图。
图6是显示用于制备表面活性剂的计算式及用于制备纳米乳液的含量比的图。
图7是比较根据亲水亲油平衡(hydrophilic-lipophilic balance)值的纳米乳液的大小的图。
图8是显示在纳米乳液的制备过程和以离心分离机分离后并过滤前的纳米乳液的层状分离的图。
图9是显示用共聚焦显微镜测量的纳米乳液的形态的图。
图10是显示亚甲蓝的负载效率的图。
图11是显示细胞活力测试(cell viability)的图。
图12是显示细胞和纳米乳液随时间的反应的图。
图13是显示纳米乳液传达癌症选择性标志染色剂的过程的图。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本公开。
除非另有定义，否则本公开中使用的所有技术术语均以本公开相关领域的普通技术人员通常理解的含义来使用。此外，在本公开中描述了优选的方法或样品，但是类似或等同的方法和样品也包括在本公开的范围内。尽管未明确说明本文所述的数值，但也被认为包括“约”的含义。在本公开中，当被称为“包括”组件时，除非另有说明，不排除存在其他组件，也可能还包括其他组件。本文提及的所有出版物的内容通过引用全部引入本文。
根据本公开的一个方面，提供一种纳米乳液，其包括：油相成分、表面活性剂及水相成分，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类及透明质酸。
在本公开中，术语″油相成分″是指可溶于油的脂溶性物质。在本公开中，所述油相成分可以是大豆油(soybean oil)。
在本公开中，术语″水相成分″是指可溶于水的水溶性物质。在本公开中，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类及透明质酸。
在本公开中，术语″乳液(Emulsion)″是指不相互溶解的水相成分和油相成分分散的状态，并存在水包油型(oil-in-water，O/W型)以及与其相反的油包水型(water-in-oil，W/O型)。在本公开的纳米乳液是指包括由水溶性活性成分、多糖类及透明质酸组成的纳米粒子的乳液。
在本公开中，透明质酸通过与在癌细超表达的CD44受体相互作用，在纳米乳液的活性成分到达癌细胞病变后流入细胞。在这种情况下，在癌症切除手术局部施用如亚甲蓝的水溶性活性成分以使其选择性地吸附到癌病变，因此能够在手术时进行引导以进行精确的切除。图2是显示癌细胞和纳米乳液的相互作用的图。
在本公开的一个实施例，所述多糖类是阴离子多糖或阳离子多糖。
具体而言，在本公开中，所述多糖类可以指合成化合物除外的存在于自然界中的所有多糖类，例如可包括纤维素(cellulose)、胶质(pectin)、壳多糖(chitin)及β-葡聚糖(beta-glucan)，但其不限于此。
在本公开的一个实施例，当所述多糖类是阴离子多糖类时，可以制备包括阳离子水性造影剂或阳离子物质的纳米乳液。在本公开的另一个实施例，当所述多糖类是阳离子多糖类时，可以制备包括阴离子水性造影剂或阴离子物质的纳米乳液。
在本公开的一个实施例，所述多糖类是藻酸盐。在本公开中，藻酸盐是由甘露糖醛酸(mannuronic acid：M)和古罗糖醛酸(guluronic acid：G)作为块料组成的链型共聚物，其通常可以从海藻中提取。
在本公开的一个实施例，所述水溶性活性成分可以是水溶性色素或水溶性药物。
具体而言，所述水溶性色素可选自靛蓝胭脂红(Indigocarmine)、亚甲蓝(Methylene blue)、鲁哥氏溶液(Lugol溶液)、甲苯胺蓝(Toluidine blue)、刚果红(Congored)、苯酚红(Phenol red)、吲哚菁绿(Indocyanin green)、荧光素钠(FluoreceinSodium)及印度墨水(India ink)中的其中一种，但本公开的实施例不限于此，并可以使用在本领域中用于色素内镜的色素。
另外，在本公开中，水溶性药物可以使用在本领域中使用的任何所需药物，但其不限于此。
在本公开的一个实施例，所述纳米乳液包括由水溶性活性成分、多糖类及透明质酸组成的互穿聚合物网络(Interpenetrating polymer network)结构的纳米粒子。
在本公开中，互穿聚合物网络结构是指两个或更多个组分不通过共价键连接，并且组分形成彼此互锁并缠在一起(entangled)的网络。在根据本公开的互穿聚合物网络结构的情况下，水溶性活性成分可以物理包封，以增加机械强度和提高热力学稳定性。
图1是显示由水溶性活性成分、多糖类及透明质酸组成的互穿聚合物网络(Interpenetrating polymer network)结构及纳米乳液的癌症靶向定向性的图。
图2是显示癌细胞和纳米乳液的相互作用的图，具体而言，两种物质之间的结合是由于透明质酸中存在的链结构与癌细胞中超表达的CD44受体的特异性相互作用。
图3是显示(A)在制备粒子之前用光学显微镜观察的图像、施加粒子旋涡(vortexing)时的微观粒子的(B)光学显微镜图像，和通过超声波分散制备的纳米粒子的描电子显微镜观察图像。
图4是显示根据亚甲蓝浓度的吸光度的图(右侧)和各浓度的吸光度值的线性关系的图(左侧)。具体而言，图4是测量每种亚甲蓝浓度的吸光度(absorbance)值后，通过比较纳米粒子的吸光度值与标准浓度(standard concentration)，可以预测到纳米乳液的浓度和亚甲蓝的负载效率(loading efficiency)。
图10是显示亚甲蓝的负载效率的图。以所述的结果可以预测到包括在纳米乳液的纳米粒子的内部所包括的亚甲蓝的含量(loading efficiency)。
图5是显示亚甲蓝和纳米乳液的吸光度及分光荧光计的荧光光谱的图。具体而言，图5的左侧可以以吸光度的结果确认亚甲蓝具有668nm的荧光波长，而右侧图表的结果是在包括纳米粒子的纳米乳液的情况下，可以以在接近668nm出现峰值波长的结果确认纳米粒子的内部包括亚甲蓝。峰值波长在制备的纳米乳液中向左移动(Blue-shift)的情况是由于内部存在的静电复合物(Electrostatic complex)的差异。另外，以荧光光谱的峰值波长的结果可以确认亚甲蓝的存在。
图9是显示用共聚焦显微镜测量的纳米乳液的形态的图。以所述图9的结果可以确认包括亚甲蓝粒子的纳米乳液。
在本公开的一个实施例，所述纳米乳液的粒子平均大小是200nm或以下。
包括在本公开的纳米乳液的纳米粒子平均大小的分布度是0.2至0.7。在具有所述粒子大小的分布度的情况下，可以提供包括具有均质性的纳米粒子的纳米乳液。就纳米粒子的均质性而言，纳米粒子的平均粒子大小的分布度为0.2至0.4的情况为更优选。
在本公开的一个实施例，所述纳米乳液的ZETA电位的值是-20mV至-50mV。本公开的所述纳米乳液的ZETA电位的值通过使藻酸盐和透明质酸在水溶液状态下具有负电荷值而获得的值，当具有范围的所述ZETA电位时，可以防止如Ostwald熟化(Ostwald ripening)的现象，以提供包括纳米粒子的纳米乳液。就纳米粒子的稳定性而言，纳米乳液的ZETA电位的值更优选为-20mV至-40mV。
在本公开的另一个实施例中，所述纳米乳液是油包水型乳液。
此外，基于所述纳米乳液的总重量，所述纳米乳液包括70重量百分比至80重量百分比的所述油相成分、10重量百分比至20重量百分比的所述水相成分，以及5重量百分比至15重量百分比的所述表面活性剂。所述表面活性剂包括单一表面活性剂或助表面活性剂中的至少一种。
可以在所述含量范围内控制所需范围的纳米乳液的大小，并且粒子的稳定性可为优异。
在本公开的另一个实施例，将两种或更多种表面活性剂混合以制备纳米尺寸的粒子使用了助表面活性剂(co-surfactant)。图6显示了制备实施例以及根据表面活性剂具有固有的亲水亲油平衡值而获得助表面活性剂的亲水亲油平衡值的计算式。在本公开的一个实施例，使用了吐温80(Tween 80，HLB值：15)和司盘80(Span 80，HLB值：4.3)，并且将两种类型的表面活性剂以一定的重量比混合后，调节了所需的助表面活性剂的亲水亲油平衡值。
在本公开的另一个实施例，基于所述纳米乳液的总重量，所述水相成分的重量百分比大于所述表面活性剂的重量百分比。在这种情况下，可以提供纳米尺寸粒子，并且粒子的稳定性是优异。
另外，在制备本公开的所述纳米乳液中使用的助表面活性剂的亲水亲油平衡值为6至9的情况有利于调节纳米乳液的尺寸。就调节纳米乳液的尺寸而言，本公开的所述纳米乳液的亲水亲油平衡值更优选为6至9。
在本公开中，所述亲水亲油平衡是显示亲水性和亲油性程度的量度，表面活性剂(surfactant)具有0至20之间的固有的HLB(hydrophilic lipophilic balance)值，越接近0为亲油性，越接近20为亲水性。
图7是比较根据亲水亲油平衡值的纳米乳液的制备比率的图。具体而言，在图6中使用的纳米乳液的情况下，通过使油相成分：助表面活性剂：水相成分的重量比为7∶1∶2而制备的纳米乳液。
本公开还提供所述纳米乳液的制备方法，其包括：准备油相成分的步骤；准备表面活性剂的步骤；准备水相成分的步骤；以及搅拌混合所述油相成分、所述表面活性剂以及所述水相成分的步骤，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类以及透明质酸。所述表面活性剂包括单一表面活性剂或助表面活性剂中的至少一种。
在本公开的另一个实施例中，所述准备水相成分的步骤包括：准备包括所述多糖类及透明质酸的第一水相成分的步骤，以及准备包括所述水溶性活性成分的第二水相成分的步骤。
在本公开的一个实施例中，搅拌混合所述油相成分、所述表面活性剂以及所述水相成分的步骤使用超声波处理搅拌并混合。
图7显示了在制备纳米乳液时，确认了根据表面活性剂的亲水亲油平衡值而制备的粒子尺寸和热力学稳定性的结果。
在所述结果，当用于制备纳米乳液的表面活性剂的亲水亲油平衡值为6至7时，当可以看出粒子的尺寸在经过一周后没有增加时，可以确认能够保持粒子的热力学稳定性。当表面活性剂的亲水亲油平衡值为8至9时，确认了粒子的尺寸为最小，但是并不能够保持粒子的尺寸稳定性，并且当亲水亲油平衡值为4至5及为10至11时，确认了所制备的粒子的尺寸相对较大，而且粒子的稳定性不能确保。
图8是显示在纳米乳液的制备过程和以离心分离机分离后并过滤前的纳米乳液的层状分离的图。具体而言，将包括表面活性剂的油相成分与包括第一水相成分和第二水相成分的水相成分混合，并使用尖端(tip)形状的超声波破碎仪(sonicator)制备了纳米粒子。在超声处理之后，由于水相成分包括纳米粒子，因此可以通过离心机分离后过滤以获得纳米乳液。
图11是显示细胞活力测试(cell viability)的图。以图11的结果可以确认本公开的纳米乳液没有细胞毒性。
图12是显示细胞和纳米乳液随时间的反应的图。以图12的结果可以确认随时间可有效传达人体的癌症标志染色剂。
在所述制备纳米乳液的方法中，油相成分、表面活性剂及水相成分与上述相同。
[实施例]
在下文中，将详细描述实施例以具体描述本公开。然而，本公开可以以各种不同的形式变化，本公开的范围不限于下面描述的实施例。提供本公开的实施例以向本领域技术人员更充分描述本公开。
制备例1.纳米乳液1的制备
准备了透明质酸(Hyaluronic acid，研究级购自Lifecore，分子量＝41kDa至65kDa)和纯化的大豆油(soybean oil，Sigma)。准备了在生物染色委员会(biologicalstaining commission，BSC)中经显微镜保证的亚甲蓝水溶液(Sigma)。准备了适于细胞培养的表面活性剂司盘80(HLB值：4.3，Sigma)和吐温80(HLB值：15，Sigma)。如下表所示，通过调节司盘80和吐温80的重量比制备了具有亲水亲油平衡的表面活性剂。
分别准备了包括准备的表面活性剂的油相成分(大豆油)、第一水相成分(0.5％海藻酸钠(Sodium alginate)和0.5％透明质酸钠(Sodium hyaluronate)(w/w))和第二水相成分(造影剂：10mM亚甲蓝水溶液(methylene blue solution)或10mM靛蓝胭脂红水溶液(indigo carmine solution))。
对包括油相成分：表面活性剂：第一水相成分：第二水相成分为70∶10∶10∶10的重量比的混合溶液以超声波处理(Sonic，VC-505型，振幅：20％)搅拌混合10分钟以制备纳米乳液。
以超声波处理将蓝色混合物变成透明或半透明为止后的油相成分的结果在纳米乳液与油相成分分离的同时，在去离子水(DI water)内再分散。包括纳米粒子的水相成分以醋酸纤维素注射器过滤器(cellulose acetate syringe filter((model DISMIC-13购自Advantec))过滤。
制备例2.纳米乳液2的制备
除了将在所述制备例1中的油相成分：表面活性剂：水相成分的重量比由7∶1∶2调节至8∶1∶1之外，以与制备例1中相同的方法制备纳米乳液。
实验例1.
使用动态光散射分析仪(Dynamic light scattering)测量所述制备例1和2中制备的纳米乳液的粒子的大小、粒子大小的分布度PDI和ZETA电位。
[表1]
以所述表1的结果确认了通过调节纳米乳液的亲水亲油平衡值可以控制纳米乳液的大小。
制备例3.纳米乳液3的制备
除了在制备例1中使用具有更大平均分子量(MW＝91-175kDa)的透明质酸外，以与所述制备例1中相同的方法使用油相成分：表面活性剂：水相成分的重量比为7∶1∶2以制备纳米乳液。测量根据相应第一水相成分的海藻酸钠和透明质酸钠的浓度的粒子尺寸变化和ZETA电位的变化以及根据亚甲蓝浓度的粒子尺寸变化和ZETA电位的变化的结果示于下表2和3中。
[表2]
[表3]
如所述表1的结果，以所述表2和表3的结果可以确认粒子的尺寸根据纳米乳液的亲水亲油平衡值而变化。还确认了粒子的尺寸和稳定性根据第一水相成分及第二水相成分(海藻酸钠、透明质酸钠和亚甲蓝)的浓度而变化。
上文已经参考优选实施例描述了本公开。本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。因此，所述实施例应该以说明性并非限制性的意义来考虑。本发明的范围不限于上述说明，而由权利要求的范围限定，并且在其等同范围内的所有差异应被解释为包括在本发明中。

Claims (15)

1.一种纳米乳液，其包括：油相成分、表面活性剂和水相成分，其中，所述水相成分包括水溶性活性成分、多糖类和透明质酸。
2.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述纳米乳液包括由所述水溶性活性成分、所述多糖类和所述透明质酸组成的互穿聚合物网络结构。
3.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述纳米乳液的粒子平均大小为200nm或以下。
4.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述纳米乳液是油包水型乳液。
5.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，基于所述纳米乳液的总重量，所述纳米乳液包括70重量百分比至80重量百分比的所述油相成分、10重量百分比至20重量百分比的所述水相成分，以及5重量百分比至15重量百分比的所述表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述表面活性剂包括单一表面活性剂或助表面活性剂中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，包括在所述纳米乳液中的纳米粒子平均大小的分布度是0.2至0.7，ZETA电位的值是-20mV至-50mV。
8.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述多糖类是藻酸盐。
9.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述水溶性活性成分是水溶性色素或水溶性药物。
10.根据权利要求9所述的纳米乳液，其中，所述水溶性色素可选自由靛蓝胭脂红、亚甲蓝、鲁哥氏溶液、甲苯胺蓝、刚果红、苯酚红、吲哚菁绿、荧光素钠及印度墨水组成的组中的任意一种。
11.根据权利要求9所述的纳米乳液，其中，所述水溶性色素的浓度为1mM至10mM。
12.根据权利要求1所述的纳米乳液，其中，所述纳米乳液的亲水亲油平衡值是6至9。
13.一种根据权利要求1-11中任一项的纳米乳液的制备方法，所述方法包括：
准备所述油相成分；
准备所述表面活性剂；
准备所述水相成分；以及
混合并搅拌所述油相成分、所述表面活性剂以及所述水相成分；其中，所述水相成分包括所述水溶性活性成分、所述多糖类和所述透明质酸。
14.根据权利要求13所述的纳米乳液的制备方法，其中，所述准备所述水相成分包括：准备包括所述多糖类及所述透明质酸的第一水相成分；以及准备包括所述水溶性活性成分的第二水相成分。
15.根据权利要求14所述的纳米乳液的制备方法，其中，所述第一水相成分和所述第二水相成分的重量比为1∶0.5至1∶2。
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