KR20090097582A - 유전자 치료제 전달을 위한 키토산 나노입자 및 그제조방법 - Google Patents

유전자 치료제 전달을 위한 키토산 나노입자 및 그제조방법 Download PDF

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이상경
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Abstract

본 발명은 키토산 사슬이 알지네이트 유도체와 가교결합하여 이루어진 유전자 치료제 전달용 나노입자 및 그 제조방법을 제공한다. 본 발명의 나노입자는 생적합성이고 비독성이면서도 입자에 적재된 치료 유전자의 혈청 안정성과 유전자 치료 효율이 우수하여 유전자 치료제의 전달 매체로 우수한 특성을 지닌다. 게다가, 본 발명의 나노입자는 면역세포 내로 비바이러스성 전달 담체로서 유용성을 가진다
키토산, 나노입자, 알지네이트 유도체

Description

유전자 치료제 전달을 위한 키토산 나노입자 및 그 제조방법{NANOPARTICLES FOR THERAPEUTIC GENE DELIVERY AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 유전자 치료제 전달용 나노입자에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 키토산 사슬이 알지네이트 유도체와 가교결합하여 이루어진 유전자 치료제 전달용 나노입자에 관한 것이다.
일반적으로 유전자치료(Gene therapy)란 DNA 재조합 방법 등의 유전자조작을 이용하여 정상유전자 및 치료유전자를 병소, 즉 환자의 세포 내로 이입(transfection)시켜 결손유전자를 교정하거나 세포에 새로운 기능을 추가하여 인체 세포의 유전적 변형을 통해 암, 감염성 질환, 자가면역질환 등과 같은 유전자 결함을 치료하거나 예방하는 방법을 말하며, 질병 치료를 목적으로 인체에 투여하기 위하여 제조된 유전물질 또는 유전물질을 이입한 세포로 구성된 의약품을 유전자치료제라고 한다.
유전자치료의 기본 기법은 유전자 이입(gene transfection)에 있다. 이 기법은 분자생물학에서 클론닝(cloning)된 유전자의 기능을 검증하기 위해 발전하여 왔으나 유전자치료의 도입으로 최근 더욱 큰 발전을 이루게 되었다. 유전자 이입에서 고려되어야 할 필수적인 요건은 ① 유전자(gene), ② 운반체(벡터, vector), ③ 표적(target)의 선정 및 조작이다. 상기 요건 중 유전자 부분은 단순히 정상 유전자나 억제 유전자 등 외에도 표적 유전자의 발현을 저해하기 위하여 안티센스 RNA나 siRNA 등 다양한 용도의 유전자가 사용될 수 있다.
RNA 간섭(RNA interference: RNAi)은 21-23 뉴클레오티드로 구성되는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA)가 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex: RISC)의 도움으로 표적 mRNA를 분해하고 그 mRNA에 의하여 암호화되는 단백질의 합성이 저해되는 강력한 기작이다(R.G. Vile 등, Gene Therapy 7 (2000) 2-8). 이 접근법은 유전적 이상, 암, 및 감염성 질병을 포함하는 다양한 질병의 치료에 있어 굉장한 치료학적 잠재성을 갖는다. 그러나, siRNA의 전달은 뉴클레아제에 의하여 너무 빨리 분해된다든지, 세포 내 흡수율이 낮다든지 및 혈중 안정성이 제한되어 있다든지 하는 몇몇 문제점이 제기되었다. 이들 단점을 극복하기 위하여, 세포 내 흡수율과 뉴클레아제에 대한 안정성을 강화시키기 위하여 siRNA를 양이온성 폴리머나 리포좀과 복합체를 형성시켰다(K. Okuda 등, Vaccine 19 (2001) 3681-3691).
두 가지 전형적인 벡터, 즉 바이러스성 및 비바이러스성 벡터가 유전자 담체로 사용되어 왔다. 바이러스성 벡터는 대부분의 세포에서 더 높은 트렌스펙션 효율을 나타내었지만 몇몇 임상 시험에서 안전성 문제가 제기되었다(L. Gan 등, J. Neurosci. Methods 121 (2002) 151-157). 비바이러스성 벡터는 합성과 수식의 용이성, 낮은 면역반응성 및 제어 가능한 크기 때문에 최근에 큰 관심을 모으고 있 다(S.A. Agnihotri 등, J. Control. Release 100 (2004) 5-28). 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리(L-리신)(PLL)을 포함하는 양이온성 리포좀 및 폴리머를 사용하는 비바이러스성 전달 시스템을 플라스미드 DNA 또는 siRNA를 응축하기 위하여 사용하여 나노입자를 형성하였다(S.M. Hammond 등, Nature 404 (2000) 293-296; 및 A. Fire 등, Trends Genet. 15 (1999) 358-363). PEI 및 DNA로 제조되는 폴리머-유전자 결합체는 높은 트랜스펙션 효율을 나타내었지만, 생체내에서 유의한 독성을 나타내어 임상적 접근방법에 한계가 있었다(S.M. Elbashir 등, Nature 411 (2001) 494-498).
키토산은 글루코사민과 N-아세틸글루코사민 잔기로 이루어지는 천연적으로 존재하는 다당류이고, 갑각류 껍질로부터 일반적으로 얻어지는 키틴의 부분적 탈아세틸화에 의하여 유도될 수 있다(N.S. Lee 등, Nature Biotechnol. 20 (2002) 500-505). 키토산은 생적합성이고, 비독성이고, 면역 유발성이 낮으며 효소에 의하여 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있다(M.N. Kumar 등, Chem. Rev. 104 (2004) 6017-6084; K.M. Varum 등, Carbohydr. Res. 299 (1997) 99-101; 및 S.B. Rao 등, J. Biomed. Mater. Res. 34 (1997) 21-28). 키토산은 양이온성 다당류이고 다수의 약물전달 용도로, 특히 양전하를 띠는 아민이 음전하를 띠는 핵산과 정전기적 상호작용을 하도록 하여 안정한 복합체를 형성하기 때문에 유전자 전달 시스템에서 널리 사용되어 왔다(M.J. Alonso 등, J. Pharm. Pharmacol. 55 (2003) 1451-1463; K.Y. Lee 등, Marcomol. Res. 15 (2007) 195-201; 및 H.Q. Mao 등, J. Control. Release 70 (2001) 399-421). DNA를 전달하는 용도의 키토산-기제 담체의 개발에 관한 다수 의 연구가 있었다. 키토산 및 DNA의 복합 코아세르베이션을 형성시키고 세포 내로 플라스미드 DNA를 전달하기 위하여 사용하였다(K.W. Leong 등, J. Control. Release 53 (1998) 183-193). 키토산/DNA 나노입자의 트랜스펙션 효율을 중간엽 줄기 세포 (mesenchymal stem cells)를 포함하는 상이한 세포 유형에서 평가하였다[16]. 키토산 입자를 갈락토스기를 함유하는 락토바이온산으로 수식하여 간세포(hepatocyte) 특이성을 증강시켰다(T.H. Kim 등, Biomaterials 25 (2004) 3783-3792). 엽산이 커플링된 키토산 나노입자는 종양세포로의 표적화 및 세포 내 도입 효율을 개선시켜 트랜스펙션률을 개선시키는 것이 밝혀졌다(S. Mansouri 등, Biomaterials 27 (2006) 2060-2065). 다수의 연구에서 시험관 내 및 생체 내에서 키토산의 존재 하에서 리포터 유전자의 발현이 효과적으로 일어나는 것을 밝혔다(K. Regnstrom 등, Pharm. Res. 23 (2006) 475-482; K. Roy 등, Nature Med. 5 (1999) 387-391; 및 M.K. Lee 등, Biomaterials 26 (2005) 2147-2156).
최근에는 키토산이 siRNA 전달에서 사용될 잠재성을 발견하였다. 키토산/siRNA 나노입자의 형성은 키토산의 분자량과 탈아세틸화 정도에 의존하였다(X. Liu 등, Biomaterials 28 (2007) 1280-1288). 사용하기 쉬운 동결건조 siRNA 트랜스펙션 약제를 조제하기 위하여 사용하는데, 이는 키토산은 siRNA의 트랜스펙션 효율 손실 없이 2 개월 동안 siRNA를 저장하는데 사용한다(M.O. Andersen 등, Biomaterials 29 (2008) 506-512). siRNA가 포획된 키토산-소듐 트리폴리포스페이트 나노입자는 siRNA 적재 효율이 개선되고 트랜스펙션 효율 또한 상당하게 개선되었다(H. Katas 등, J. Control. Release 115 (2006) 216-225).
약물 전달용 마이크로입자나 나노입자를 제조하기 위하여 알지네이트가 종종 사용되기는 하지만 키토산과의 상호작용이 종종 매우 강하여 복합체 형성이 즉각적으로 일어나는 단점이 있기 때문에, 안정한 키토산 나노입자를 형성할 수 있으면서도 독성 없는 가교결합 파트너에 대한 필요가 있었다.
따라서, 본 발명에서는 키토산을 포함하는 나노입자 형성시 알지네이트를 사용하는 경우의 균일하지 않은 입자의 형성의 문제점을 해결하는 나노입자를 제공하고자 한다.
본 발명자는 생적합성이고 비독성인 것으로 알려진 키토산 및 알지네이트(alginate) 유도체를 사용하여 유전자 치료제 전달 시스템을 개발하여 본 발명을 완성하였다. 알지네이트는 생적합성, 생분해성 및 비독성인 성질 때문에 약물전달 및 조직 엔지니어링(engineering) 다수의 용도에서 자주 사용되었다(K.Y. Lee 등, Chem. Rev. 101 (2001) 1869-1879). 알지네이트는 만누론산(mannuronic acid: M) 및 글루론산(guluronic acid: G)으로 블럭 순서 방식으로 구성된 천연 발생 다당류이다(도 1b). 그러나, 키토산과 알지네이트 사이의 직접복합체 형성은 너무 순간적으로 일어나며 제어되지 않는 방식으로 침전이 형성되는 문제점이 있다.
본 발명자들은 폴리글루론산 등 분자량이 작은 알지네이트 유도체들은 양이온과 이온성 상호작용에 기여도가 높기 때문에 키토산과의 상호작용을 제어하여 안 정한 나노입자를 형성하는데 유용할 수 있다는 가설을 제기하고, G 잔기들의 한 블럭인 폴리글루론산 (PG)을 알지네이트로부터 분리하여 키토산 사슬을 가교결합하기 위하여 사용하여 유전자가 포획된 안정된 나노입자를 형성하였다. 유전자 치료제의 한 형태인 siRNA 전달을 위한 코아세르베이션 방법에 의하여 키토산과 PG로부터 나노입자를 제조하여 그것의 크기, 제타 포텐셜, 형태 및 입자 안정성과 같은 다양한 물리화학적 특성을 관찰였다. 다양한 세포에서의 나노입자의 독성과 세포 내 흡수 및 유전자 사일런싱 효율을 평가하였다. 또한, 면역 세포 내로 siRNA를 전달하는 용도에서 나노입자의 사용 잠재성 또한 시험하였다.
따라서, 본 발명의 한 양태에서는 키토산 사슬이 알지네이트 유도체와 가교결합하여 이루어진 유전자 치료제 전달용 나노입자를 제공한다. 본 발명의 나노입자에서 사용되는 알지네이트 유도체는 알지네이트보다 유의하게 분자량이 작은 임의의 유도체이다. 본 발명의 한 양태에서 알지네이트 유도체는 분자량 1,000 내지 50,000이다. 분자량 1,000 미만은 고분자의 범위 이하이고, 50,000 이상은 신장을 통하여 신체 밖으로 배출될 수 없다. 알지네이트는 생분해가 되지 않기 때문에 인체에 사용되는 약물 전달 시스템의 재료로서 신체 배출 가능한 크기의 알지네이트 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 양태에서 알지네이트 유도체는 폴리글루론산이다.
본 발명의 한 양태에서 나노입자는 키토산 사슬이 저분자량의 알지네이트 유도체와 가교결합하여 코아세르베이트를 형성하여 형성된다. 복합 코아세르베이트의 형성은 당업계에서 잘 알려져 있는 어떤 방법을 사용하여도 무방하다.
본 발명의 다른 양태에서는 키토산 사슬이 알지네이트 유도체와 가교결합하여 이루어진 유전자 치료제 전달용 나노입자를 제공하는데, 나노입자에는 유전자가 포획된 형태이다. 본 발명의 나노입자로 전달할 수 있는 유전자 치료제는 제한되지 않는다. 키토산-기제의 나노입자에 포획되어 전달이 가능한한 어떤 형태의 유전자도 본 발명의 나노입자에 사용될 수 있다. 질병과 관련된 표적 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 어떤 RNA 형태의 유전자도 본 발명의 나노입자의 전달 대상이 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 한 양태에서 포획된 유전자는 siRNA인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자이다.
본 발명의 또 다른 양태에서 (i) 알지네이트 유도체 용액 중에 키토산 용액을 가하여 코아세르베이션시키는 단계를 포함하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 코아세르베이션 방법은 당업계에서 나노입자 제조에 사용되는 일반적인 어떤 방법을 사용하여도 무방하다. 바람직하게는, 본 발명의 제조방법에서 알지네이트 유도체는 폴리글루론산이다.
본 발명의 다른 양태에서는 알지네이트 유도체 용액에 치료 유전자를 가하는 단계 및 치료 유전자가 첨가된 알지네이트 유도체 용액 중에 키토산 용액을 가하여 코아세르베이션시키는 단계를 포함하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법에서 사용되는 치료 유전자는 종래에 알려진 어떤 형태의 유전자도 사용될 수 있다. 질병과 관련된 표적 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 어떤 RNA 형태의 유전자도 본 발명의 나노입자의 전달 대상이 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 한 양태에서 포획된 유전자는 siRNA이다.
본 발명의 나노입자는 생적합성이고 비독성이면서도 입자에 적재된 치료 유전자의 혈청 안정성과 유전자 치료 효율이 우수하여 유전자 치료제의 전달 매체로 우수한 특성을 지닌다. 게다가, 본 발명의 나노입자는 면역세포 내로 비바이러스성 전달 담체로서 유용성을 가진다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
< 실시예 >
본 실시예에서 사용된 시약과 재료는 다음과 같다.
키토산 글루타메이트 (MW = 470 kDa 및 DD = 86%)와 알지네이트 (MW = 200 kDa)를 FMC Biopolymer (Norway)로부터 구입하였다. 아세트산 나트륨을 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, pSV 루시퍼라제를 표적으로 하는 합성 siRNA (센스: 5'-GGACAUUACUAGUGACUCATT-3', 안티센스: 5'-UGAGUCACUAGUAAUGUCCTT-3'), 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC)-융합 CD4 siRNA 및 DEPC-처리된 물을 삼천리 제약 (Samchulli pharmaceutical (Korea))으로부터 구입하였다. pSV 루시퍼라제는 Promega (USA)로부터 구입하였다. Endofree
Figure 112008017902180-PAT00001
plasmid Maxi 키트를 Qiagen (Valencia, CA, USA)로부터 구입하였다. Dulbecco의 변형된 Eagle의 배지 (DMEM), RPMI Medium 1640, 인산 완충 식염수 (PBS), 페니실린-스트렙토마이신, 트립신-EDTA, 및 우태아 혈청(FBS)을 Gibco BRL (Rockville, MD, USA)로부터 구입하였다. LipofectamineTM 2000 시약을 Invitrogen (California, CA, USA)으로부터 구입하였다. CellTiter 96R Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit를 Promega (USA)로부터 구입하여 MTS [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메틸옥시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨] 검정에서 사용하였다. 물은 Milli-Q System (Waters, Millipore, USA)을 사용하여 증류하고 탈이온화하였다. 다른 시약 또한 시중구입 하였고 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
제조예 1:키토산/ PG 나노입자의 제조
<1-1> 폴리글루로네이트의 분리
산 가수분해에 의하여 폴리글루로네이트(PG)를 알긴산 나트륨으로부터 분리하여 pH 2.85에서 수집하였다(K.H. Bouhadir 등, Polymer 40 (1999) 3575-3584). 침전물을 증류수에서 용해하여 활성 탄소로 처리하여 더 정제하였다. 용액을 완전히 교반하고 여과하여 활성탄소를 제거하고 에탄올로 침전 형성시킨 후 감압동결건조하였다(MW = 6kDa).
<1-2> 키토산/PG 나노입자의 제조
키토산 글루타레이트를 아세트산 나트륨 완충액(0.1 M 아세트산 나트륨, pH 5.5) 중에 용해시켜 70 내지 280 ㎍/ml 범위에서 서로 다른 농도의 용액을 제조하였다. 폴리글루로네이트(PG)를 술폰산 나트륨 완충액 (0.05M) 중에 용해하였다. 용액을 0.22 μm 주사기 필터(Millipore, USA)를 통과하여 여과시켜 서서히 55℃까지 승온시켰다. 동일 부피의 PG 용액에 키토산 용액을 가하여 니노입자를 제조하였고, 사용하거나 더 분석하기 전에 나노입자를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
알지네이트 또는 폴리글루로네이트의 존재 하에서 코아세르베이션 방법에 의하여 키토산 나노입자를 제조하였다. 두 입자의 평균 지름은 5 내지 20 범위 내에서 중량비를 증가시킴에 따라 증가하였다(도 1a). 그러나, PG와 함께 형성된 키토산 나노입자의 크기는 알지네이트와 함께 형성된 것보다 작았고, 이는 아마도 PG의 분자량(MW=6kDa)이 온전한 알지네이트의 분자량(MW=200kDa)보다 상대적으로 더 작기 때문일 것이다. 이 결과는 양이온과 이온성 상호작용에 주로 기여하는 G-블럭 잔기의 밀도가 높기 때문에 PG가 키토산과 복합체를 형성하기에 유용하다는 것을 나타낸다(K.Y. Lee, 상기). 키토산 나노입자의 표면 전하는 사용된 중량비 범위 내에서 약 +10mV이었다(도 1b). 나노입자의 입자 크기와 고도로 양성 하전된 표면은 효율적 유전자 송달에 효과적이고(R.M. Schiffelers 등, Pharm. Res. 21 (2004) 1-7. 및 W. Zauner 등, J. Control. Release 71 (2001) 39-51), 키토산/PG 나노입자는 유전자 전달 담체로 유망한 것으로 판명되었다.
제조예 2: 키토산/( PG + siRNA ) 나노입자의 제조
<2-1> 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 제조
siRNA-적재된 나노입자의 제조를 위하여 DEPC-처리한 물 중의 siRNA(14㎍/ml)를 우선 PG 용액에 가한 후에 키토산 용액을 첨가하였다. 키토산 대 PG의 중량비를 20에 고정하였다. 그 후 사용하거나 더 분석하기 전에 입자를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다.
<2-2>겔 리타데이션 검정
4% 아가로스 겔을 사용한 겔 전기영동에 의하여 siRNA가 키토산에 결합하는 것을 시험하였다. 키토산 대 siRNA 중량비로 정의되는 상이한 중량비의 샘플을 겔에 로딩하여 55V에서 100분 동안 TBE(4.45 mM Tris-베이스, 1 mM 소듐 EDTA, 4.45 mM 붕산, pH 8.3)에서 전기영동을 수행하였다. 에티듐브로마이드를 사용하여 365nm에서 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator)를 사용하여 siRNA 밴드를 가시화하였다.
siRNA과 키토산의 복합체 형성을 겔 전기영동에 의하여 확인하였다. 키토산/siRNA 및 키토산/(PG+siRNA) 나노입자를 여러 중량비로 제조하였다(도 2). siRNA의 겔 상 움직임은 중량비 10에서 대조군 siRNA에 비하여 유의하게 지연되었다. 중량비가 50을 넘으면 siRNA 밴드가 사라졌는데, 이는 키토산과 siRNA 사이에 완전한 복합체가 형성되었음을 나타낸다. DNA는 매우 작은 중량비 (키토산/DNA 비=4 내지 6)에서 응축되는 것이 가능한 것으로 보고되었다(K.L. Douglas 등, J. Control. Release 115 (2006) 354-361; K.Y. Lee 등, J. Control. Release 51 (1998) 213-220; 및 M. Huang 등, J. Control. Release 106 (2005) 391-406). 이는 siRNA가 DNA와는 다른 방식으로 키토산에 결합한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 수 개의 siRNA가 키토산과 복합체를 형성할 수도 있고, siRNA가 길이가 짧고 (21mer) 선형성을 띠기 때문에 컴팩트한 복합체 형성을 위하여 훨씬 많은 양의 키토산이 필요할 수도 있다(H. Katas 등, J. Control. Release 115 (2006) 216-225).
실시예 1: 키토산( PG + siRNA ) 나노입자의 크기와 표면 전하
<1-1> 입자크기 및 표면 전하 측정
나노입자의 평균 지름 및 표면 전하를 Nano ZS Zetasizer (Malvern Instruments, UK)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 세 가지 상이한 샘플을 준비하여 측정하고 평균을 내었다(n=3).
<1-2> 입자의 형태
나노입자의 형태를 AFM을 사용하여 관찰하였다. 나노입자의 수용액을 깨끗한 운모 표면상에 놓고 증류수로 세척한 후 질소로 세척하였다. 1.2×1.2μm의 스캔된 영역에서 Nano-R2TM AFM (Pacific Nanotechnology, USA)를 사용하여 전자현미경 이미지를 얻었다.
키토산은 siRNA와 직접 복합체를 형성하는데 유용하기는 하지만(도 2), 복합체의 크기나 측정할 수 없었다. 그 이유는 복합체 형성을 제어할 수 없어서 안정성 및 균일성이 결여되어 있기 때문이었다. 그러나, PG가 키토산 사슬에 대하여 경쟁적 결합을 하기 때문에 안정한 키토산/(PG+siRNA) 나노입자가 형성되었다. 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 평균 지름은 중량비에 따라 110nm 내지 430 nm 범위에 있었다(도 3a). 나노입자의 지름은 중량비의 증가에 비례하여 증가하였다. 나노입 자의 표면 전하는 +10 mV 내지 +15 mV 범위에 있었다. 1.2×1.2μm의 스캔된 영역에서 AFM에 의하여 siRNA가 적재된 키토산 나노입자의 이미지를 얻었다(도 3b). 50 이하의 중량비에서 형성된 나노입자를 세포 흡수 및 유전자 사일런싱 시험에서 사용하였다.
실시예 2: 나노입자의 적재 효율 및 안정성
<2-1> 나노입자의 siRNA 적재 효율
입자 형성 후 상청액 중의 siRNA를 원심분리(20,000×g, 20분) 후 회수하여 농도를 260nm에서 UV 분광계측기로 측정하였다. siRNA/PG 나노입자의 siRNA의 적재 효율은 최초에 첨가된 siRNA 총량에 대한 결합 siRNA의 백분율에 기초하여 계산하였다. siRNA 없는 키토산/PG 나노입자로부터 회수된 상청액을 블랭크 대조군으로 사용하였다.
나노입자를 원심분리(2,000×g, 20분)에 의하여 가라앉히고, 상청액 중의 자유(결합하지 않은) siRNA의 양을 UV 분광광도계에 의하여 측정하여 최초에 첨가한 전체 siRNA 양과 비교하였다. 본 실시예에서 사용된 중량 범위 내에서 적재 효율은 60%가 넘었고 키토산 농도를 높이면 약간 증가하였다(도 4).
<2-2> 나노입자의 혈청 안정성
네이키드 siRNA 및 siRNA로 적재된 키토산 나노입자를 20% 우태아 혈청을 함유하는 배지에서 37℃에서 배양하였다. 각 사전 결정된 시점 (3, 7, 16 및 24 시간)에서 나노입자를 배지로부터 수집하여 겔 전기영동 수행 전까지 -20℃에 저장하였다. 나노입자로부터 siRNA를 떼어내기 위하여 겔 전기영동 전에 페놀/클로로포름 추출 방법을 사용하였다. 그 후 4% 아가로스 겔을 사용한 겔 전기영동에 의하여 siRNA의 보전성을 분석하였다.
나노입자는 최초에는 산성 조건에서 제조되었으므로 생리학적 조건에서 나노입자의 안정성을 시험하였다. 산성 조건에서 제조된 나노입자 현탁액의 pH를 용액에 PBS를 가하여 중화시켰다. 키토산 나노입자의 크기를 24 시간 동안 모니터하였는데 중성화된 완충액에서도 시간 경과에 따라 거의 일정한 것으로 나타났다(도 5). 다음으로, 나노입자에 적재된 siRNA의 혈청 안정성을 20% 혈청-함유 배지에서 24 시간 동안 시험하였다. 네이키드 siRNA는 30분 경과 후 신속하게 분해되는 것이 관찰되었다(도 6a). 반면, 나노입자에 의하여 보호되는 siRNA의 분해는 24시간 동안 서서히 진행되었다(도 6b). 혈청 존재 하에서의 siRNA의 안정성의 증강은 시험관 내 및 생체 내 사용에서의 트랜스펙션 효율의 개선에 결정적일 수 있다.
실시예 3: 나노입자의 세포독성
HEK 293 (인간 배아 신장 세포주), HeLa (인간 경부암종), 및 Jurkat 세포 (급성 T 세포 백혈병)를 사용하여 나노입자의 세포독성을 시험하였다. 세포를 96웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 1×104 세포 밀도로 플레이팅하였다. 37℃에서 나노입자를 24 시간 배양한 후, 20 ㎕의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메틸옥시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS)를 각 웰에 가한 후 2 시간 동안 인큐베이션하여 세포 배양 배지에서 가용성인 포르마잔 결정이 형성되도록 하였다. 포르마잔 생성물의 흡광도를 490nm에서 분광광도계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. siRNA와 복합체를 형성한 Lipofectamine 2000TM 및 폴리 L-리신(PLL)의 독성 또한 시험하였다.
비바이러스성 유전자 전달 담체로서 LipofectamineTM 2000, PEI 및 PLL이 광범위하게 사용되어 왔지만 세포독성이 유의하기 때문에 생체 내 사용이 제한되었다(C.D. Novina 등, Nature Med. 8 (2002) 681-686). 네이키드 siRNA와 상이한 중량비로 형성된 키토산 나노입자는 세포 생존률이 우수하였는데(도 7), 이는 키토산과 알지네이트가 독성이 낮기 때문일 것이다. 그러나, LipofectamineTM 2000 및 PLL는 세포 생존률이 유의하게 감소하였다.
실시예 4: 나노입자의 세포 흡수
세포를 12-웰 배양 플레이트에 각각 HeLa 세포는 DMEM 중에, Jurkat은 RPMI 중에 플레이팅하였고(1×105 세포/웰), 세포를 50pmol FITC-접합된 siRNA를 함유하는 나노입자로 처리하였다. 4 시간 후, 배지를 세포에 첨가하고 5% CO2 대기 중에서 20 시간 동안 37㎕℃에서 배양하였다. 그 후 세포를 2% 포름알데히드로 고정시키고 유동세포계측(Becton Dickenson FACS Caliber)에 의하여 분석하여 나노입자의 세포 흡수를 측정하였다.
키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 세포 흡수는 나노입자의 키토산 함량의 증가에 따라 증가하였다(표 1). 키토산 함량이 증가함에 따라 표면 양전하가 증가하고 적재 효율이 증가하여 세포 흡수가 개선된다.
Figure 112008017902180-PAT00002
실시예 5: 나노입자의 유전자 사일런싱
혈청의 존재 하에서 HEK 293 및 HeLa 세포를 사용하여 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 유전자 사일런싱 효과를 관찰하였다. 세포를 1.0×105 세포/웰 밀도로 12-웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 트랜스펙션 당인 배지를 제거하고 혈청이 함유하지 않은 신선한 배지로 교체하였다. 제조자의 지시에 따라 세포를 Lipofectamine 2000TM와 복합체를 형성하는 루시페라제를 암호화하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 4 시간 후 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후 혈청 없는 신선한 배지로 교체하였다. 그 다음, 50 pmol siRNA를 함유하는 50 ㎕의 키토산 나노입자를 세포에 가하고 5% CO2 대기 중에서 20 시간 동안 37㎕℃에서 배양하였다. 트랜스펙션 24시간 후, Orion II microplate luminometer (Berthold Detection Systems)를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 샘플의 총 단백질 함량을 BCA 단백질 검정 키트(Pierce, Rockford, ME, USA)를 사용하여 측정하여 루시페라제 활성의 정상화하기 위하여 사용하였다.
LipofectamineTM 2000는 HEK 293 세포에서 혈청 조건 하에서 mg 단백질 당 루시페라제 활성에 기초할 때 50% 유전자 사일런싱 효율을 나타냈고, 나노입자와 함께 전달되는 siRNA의 유전자 사일런싱 효율은 흥미롭게도 대조군인 PLL의 효율과 비슷한 수준이었다. HEK 293 인간 신장 세포에서, 유전자 사일런싱 효과는 중량비의 증가에 따라 증가하였는데(도 8a), 이는 아마도 높은 중량비에서 siRNA의 겔 상 움직임의 감소에서 나타난 바와 같이(도 2) 나노입자의 안정성이 증가하고 세포 흡수가 증가하였기(표 1) 때문일 것이다. 네이키드 siRNA에서는 미량의 사일런싱 효과가 관찰되었다(2% 미만의 유전자 녹다운). HeLa 세포에서는, 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 상대적 유전자 사일런싱 효과 또한 LipofectamineTM 2000의 효과와 비교하여 약 50%이른다(도 8b). 이들 입자는 PLL과 비교하여 55-70% 유전자 사일런싱 효과를 나타내었고, 이는 비바이러스성 siRNA 전달에서 잠재적으로 유용함을 나타낸다.
면역세포로의 효과적 siRNA 전달은 HIV-1 같은 바이러스성 감염-관련 질환에서 치료적 잠재성을 시사할 수 있다. siRNA를 함유하는 키토산 나노입자를 면역 세포주인 Jurket 세포에 전달하였고 LipofectamineTM 2000의 것과 비교하여 유의한 양의 유전자 녹다운이 관찰되었다(도 9). 키토산/(PG+siRNA) 나노입자는 면역 세포 내로 siRNA와 같은 유전자 치료제를 전달하는 용도의 비바이러스성 벡터로서 유용하다.
게다가, 키토산/(PG+siRNA) 나노입자는 면역세포 내로 비바이러스성 전달 담체로서 유용성을 보였다. 생적합성이고 독성이 낮은 천연 폴리머를 개발하기 위한 이 접근법은 치료 목적의 유전자 전달에 유용하다.
도 1a는 알지네이트 또는 폴리글루로네이트의 존재 하에서 코아세르베이션 방법에 의하여 제조된 키토산 나노입자의 크기이고, 도 1b는 알지네이트 또는 폴리글루로네이트의 존재 하에서 코아세르베이션 방법에 의하여 제조된 키토산 나노입자의 제타 포텐셜이다(n = 3).
도 2는 키토산/siRNA 및 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 겔 리타데이션 검정 결과이다. C 및 M는 네이키드 siRNA 및 DNA 마커를 각각 지칭한다. 1, 10, 50, 100, 및 200로 표시된 레인은 siRNA에 대한 키토산의 중량비이다.
도 3a는 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 크기와 제타 포텐셜을 중량비의 함수로 나타낸 것이고, 도 3b는 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 원자력 현미경 이미지이다. (전하 비=20)
도 4는 다양한 중량비에서 제조된 키토산/(PG+siRNA) 나노입자 중의 siRNA의 적재 효율이다.
도 5는 원래(5a) 및 중화된 완충액(5b)에서 24시간 동안 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 크기 변화이다.
도 6은 시간 경과에 따라 20% 혈청이 함유된 배지에서 배양된 네이키드 siRNA(a) 와 나노입자에 적재된 siRNA의 혈청 안정성을 나타낸다.
도 7은 HEK 293(7a), HeLa(7b), 및 Jurkat (7c) 세포에서 시험한 나노입자의 세포 독성을 나타낸다.
도 8은 HEK 293(8a) 및 HeLa(8b) 세포에서 LipofectamineTM 2000 및 폴리(L-리신)(PLL)을 사용한 것과 비교한 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 상대적 유전자 사일런싱 효율을 나타낸다.
도 9는 Jurkat 세포 상에서 키토산/(PG+siRNA) 나노입자의 유전자 사일런싱 효율을 나타낸다 (n=7)

Claims (8)

  1. 키토산 사슬이 분자량 1,000 내지 50,000Da의 알지네이트 유도체와 가교결합하여 이루어진 유전자 치료제 전달용 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 알지네이트 유도체는 폴리글루론산인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 나노입자에는 유전자가 포획된 형태인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자.
  4. 제 3 항에 있어서, 포획된 유전자는 siRNA인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자.
  5. (i) 1,000 내지 50,000Da의 알지네이트 유도체 용액 중에 키토산 용액을 가하여 코아세르베이션시키는 단계를 포함하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 알지네이트 유도체는 폴리글루론산인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 단계 (i) 이전에 알지네이트 유도체 용액에 치료 유전자를 가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서 치료 유전자는 siRNA인 것을 특징으로 하는 유전자 치료제 전달용 나노입자의 제조방법.
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