CN109562088A - 用于治疗和预防自身免疫病的代谢物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗或预防自身免疫病或者延迟其进展或发作的方法，其提供包含两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合的膳食代谢物。本发明还提供了用于治疗、预防自身免疫病或者延迟其进展或发作的组合物。

Description

用于治疗和预防自身免疫病的代谢物

相关申请

本申请要求澳大利亚临时申请AU 2016903143的优先权，其全部内容在此整体并入。

技术领域

本发明涉及用于治疗和预防自身免疫病的代谢物化合物的组合和递送。

背景技术

在说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或表明该现有技术构成任何管辖区中公知常识的一部分，或者可合理地预期本领域技术人员理解该现有技术，认为其是相关的，和/或将其与其他现有技术组合。

自身免疫病是这样的病理状态，其产生于针对身体中器官和组织的异常免疫应答。

自身免疫病的负担是显著的，其中相当一部分的少数西方人群(2％至5％)患有这组疾病。女性也更易患自身免疫病，特别是在生育年龄，以致估计在美国在高至65岁的所有年龄组群中，自身免疫病是女性死亡的主要原因。

自身免疫病不能治愈，并且目前的治疗通常旨在控制与疾病相关的疼痛(例如，使用类固醇或非甾体抗炎剂)或旨在使用免疫抑制剂来降低炎性应答。免疫抑制药物可极其昂贵，降低了许多患者获得治疗的机会。在导致功能性细胞破坏的自身免疫病(例如，1型糖尿病，其中胰腺β细胞被破坏)的情况下，存在甚至更有限的治疗选择，其中外源性胰岛素治疗仍然是主要的治疗方法。

需要用于治疗和预防自身免疫病的改进的方法和组合物。

发明内容

本发明涉及在个体中预防自身免疫病或延迟其发作的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而预防自身免疫病或延迟其发作。

在本发明的任一实施方案中，所述个体可被确定为处于发生自身免疫病的风险之中。例如，所述个体可具有与发生自身免疫病的风险相关的自身抗体或炎性标志物。

本发明还提供了在个体中延迟自身免疫病的进展或治疗自身免疫病的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而治疗自身免疫病或延迟其进展或者治疗自身免疫病。

本发明还提供了在处于自身免疫病风险之中或患有自身免疫病的个体中减轻或治疗炎症的方法，其包括在个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而在个体中减轻或治疗炎症。

减轻或治疗炎症可包括降低个体中一种或更多种促炎细胞因子的比例。此外，减轻或治疗炎症可包括提高个体中一种或更多种抗炎细胞因子的比例。

本发明提供了在处于自身免疫病风险之中或患有自身免疫病的个体中预防、降低或治疗自身免疫(autoimmunity)的方法，其包括在个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而在个体中预防、降低或治疗自身免疫。

预防、降低或治疗自身免疫可包括降低个体中一种或更多种自身抗体的丰度或存在。自身抗体可与自身免疫病的风险相关。

在本发明的任一实施方案中，自身免疫病选自：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻(caeliac disease)、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化或原发性胆汁性肝硬化。

优选地，自身免疫病是1型糖尿病。

在本发明的任一实施方案中，自身抗体与1型糖尿病的风险相关，包括但不限于胰岛自身抗体、胰岛素自身抗体，以及针对谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)和胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein，IGPR)的自身抗体。

在本发明的任一实施方案中，两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合包括丁酸和乙酸、其酯或盐的组合。

本发明提供了在个体中治疗I型糖尿病或延迟其进展的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的丁酸和乙酸、其酯或盐，从而治疗I型糖尿病或延迟其进展。

本发明提供了在个体中预防I型糖尿病或延迟其发作的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的丁酸和乙酸、其酯或盐，从而预防I型糖尿病或延迟其发作。

本发明还提供了在个体中治疗I型糖尿病或延迟其进展的方法，该方法包括在个体的大肠中提供治疗有效量的丁酸和乙酸、其酯或盐，从而治疗或预防I型糖尿病。

本发明还提供了在个体中预防I型糖尿病或延迟其发作的方法，该方法包括在个体的大肠中提供治疗有效量的丁酸和乙酸、其酯或盐，从而预防I型糖尿病或延迟其发作。

在本发明的任一实施方案中，短链脂肪酸的组合选自丁酸和乙酸和丙酸。该组合可以是丁酸和丙酸，丁酸和乙酸，乙酸和丁酸，或者乙酸、丁酸和丙酸。

在本发明的任一实施方案中，选自乙酸、丁酸和丙酸的短链脂肪酸的组合还可包括选自异丁酸、叔丁基羧酸、戊酸、己酸等的另外的短链脂肪酸。此外，该另外的短链脂肪酸可被一至三个取代基(例如卤素(氟、氯、溴、碘)、氰基、羟基、甲氧基、酮基等)取代。可用的经取代短链脂肪酸的一些实例包括羟基乙酸、酮基丙酸和4，4-三氟丁酸。

本文中使用的术语乙酸根(acetate)、丁酸根(butyrate)、丙酸根(propionate)等是指游离酸的盐形式，或者根据生理环境，是指游离酸本身。在上下文中，其还可以指游离酸的酯。

在本发明的任一实施方案中，在个体的大肠中提供短链脂肪酸的组合。在本发明的任一实施方案中，在个体的结肠中提供短链脂肪酸的组合。在任一实施方案中，在个体中全身(即，在外周血循环中)提供短链脂肪酸的组合。

在本发明的任一实施方案中，通过向个体经口施用包含短链脂肪酸的膳食剂(dietary agent)或药物组合物来在所述个体中提供所述短链脂肪酸的组合。所述膳食剂可包含与至少一种短链脂肪酸共价键合的载体分子，其中该共价键对在个体的小肠中降解具有抗性但可在结肠中水解以在个体的结肠中提供游离脂肪酸。优选地，所述载体是淀粉。

在本发明的任一实施方案中，短链脂肪酸组合的施用导致个体血液中短链脂肪酸的循环水平提高。在本发明的任一实施方案中，血液中提高的循环短链脂肪酸水平是持续的(即，不是短暂的)。

在本发明的任一实施方案中，短链脂肪酸组合的施用导致个体中短链脂肪酸的循环水平提高大于或等于0.5倍、1倍、2倍、3倍或4倍。

本发明还提供了用于治疗或预防自身免疫病的药物组合物，其中所述组合物包含丁酸、乙酸和丙酸(包括其酯或盐)中两种或更多种的组合，以及可药用赋形剂，其中丁酸、乙酸和丙酸、其酯或盐中的这两种或更多种是组合物中的活性成分。

药物组合物可适于将短链脂肪酸释放到个体的大肠中。

药物组合物可适于将短链脂肪酸释放到个体的结肠中。

药物组合物可以是包含肠溶衣的经口剂型的形式，所述肠溶衣对在胃和小肠中降解具有抗性。肠溶衣优选地是经口剂型上的抗消化层，其被设计成将短链脂肪酸释放到大肠(优选结肠)的腔中。

药物组合物可以是经口剂型、栓剂或可注射剂型的形式。

本发明还包括丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种在制备用于治疗或预防自身免疫病或者延迟其发作的药物中的用途。

本发明提供了用于将选自乙酸、丁酸和丙酸的两种或更多种短链脂肪酸递送到个体的大肠中的膳食剂，所述膳食剂包含通过可在个体的结肠中水解以给出游离脂肪酸的键与所述短链脂肪酸共价键合的载体。

载体优选地是选自淀粉、树胶(gum)、寡糖或果胶的碳水化合物。更优选地，载体是淀粉。

在载体是淀粉的情况下，优选地所述淀粉与至少一个丁酸和至少一个乙酸分子共价键合。

本发明提供了用于治疗或预防自身免疫病的组合膳食，其中所述膳食包含第一膳食剂和第二膳食剂的组合，所述第一膳食剂包含与丁酸部分共价键合的载体分子，所述第二膳食剂包含与乙酸部分共价键合的载体分子，其中在每种膳食剂中，所述部分通过可在个体的结肠中水解以提供游离丁酸和游离乙酸的键与载体键合。

本发明还提供了上述膳食剂用于治疗自身免疫病或用于延迟自身免疫病进展的用途，所述自身免疫病选自1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、原发性胆汁性肝硬化和多发性硬化。膳食剂还可用于预防自身免疫病或延迟其发作，所述自身免疫病选自1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、原发性胆汁性肝硬化和多发性硬化。

本发明还提供了用于在个体中治疗1型糖尿病或延迟其进展的膳食，其中所述膳食包含第一膳食剂和第二膳食剂的组合，所述第一膳食剂包含与丁酸部分共价键合的载体分子，所述第二膳食剂包含与乙酸部分共价键合的载体分子，其中在每种膳食剂中，所述部分通过可在个体的结肠中水解以给出游离丁酸和游离乙酸的键与载体键合。

本发明还提供了用于在个体中预防1型糖尿病或延迟其发作的膳食，其中所述膳食包含第一膳食剂和第二膳食剂的组合，所述第一膳食剂包含与丁酸部分共价键合的载体分子，所述第二膳食剂包含与乙酸部分共价键合的载体分子，其中在每种膳食剂中，所述部分通过可在个体的结肠中水解以提供游离丁酸和游离乙酸的键与载体键合。

本发明还提供了丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种在制备用于治疗或预防自身免疫病的药物中的用途。所述自身免疫病选自1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化和原发性胆汁性肝硬化。优选地，所述自身免疫病是1型糖尿病。

本发明还提供了用于在个体中治疗自身免疫病或延迟其进展的方法，其中所述自身免疫病优选地是1型糖尿病，所述方法包括：

-向个体施用含有治疗有效量的结肠组合物的剂型，所述组合物由以下组成：

-由至少两种短链脂肪酸或者其可药用盐或酯的组合组成的核心，其中所述短链脂肪酸选自乙酸、丁酸和丙酸；以及

-至少一个覆盖所述核心的抗消化层，

-所述抗消化层在结肠中崩解；以及

-使所述核心在结肠的腔内释放。

本发明还提供了用于在个体中预防自身免疫病或延迟其发作的方法，其中所述自身免疫病优选地是1型糖尿病，所述方法包括：

-向个体施用含有治疗有效量的结肠组合物的剂型，所述组合物由以下组成：

-由至少两种短链脂肪酸或者其可药用盐或酯的组合组成的核心，其中所述短链脂肪酸选自乙酸、丁酸和丙酸；以及

-至少一个覆盖所述核心的抗消化层，

-所述抗消化层在结肠中崩解；以及

-使所述核心在结肠的腔内释放。

本发明还提供了结肠组合物，其由以下组成：

-由选自丁酸、乙酸和丙酸的至少两种短链脂肪酸或者其可药用盐或酯的组合组成的核心，以及

-至少一个覆盖所述核心的抗消化层，所述抗消化层在结肠中崩解。

所述剂型可以是片剂或胶囊剂的形式。优选地，所述核心包含丁酸和乙酸二者，或者其可药用盐或酯。所述剂型用于治疗自身免疫病，或者用于延迟或预防自身免疫病发作，所述自身免疫病选自1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化和原发性胆汁性肝硬化。优选地，所述自身免疫病是1型糖尿病。优选地，所述自身免疫病是1型糖尿病。

如本文所用，除上下文另有要求的情况之外，术语“包含/包括”及该术语的变化形式并不旨在排除另外的添加项、组分、整数或步骤。

通过以下通过实例的方式并且参照附图给出的描述，本发明的另一些方面以及前面段落中描述的方面的另一些实施方案将变得明显。

附图说明

图1.SCFA浓度与NOD小鼠中T1D的发病率相关。7周龄无特定病原体(specificpathogen-free，SPF)NOD与SPF NOD.MyD88-/-小鼠的(a)外周血(腔静脉)和(b)肝门静脉血中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度。曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)。数据表示平均值±SD，n≥5。所示数据来自三个独立实验。(c)无菌(germ-free，GF)与SPF雌性NOD小鼠中的T1D发病率。***P＜0.001，Mantel-Cox对数秩检验。所示数据来自两个独立实验。(d)雌性(F)和雄性(M)5至8和10至15周龄NOD小鼠的外周血(腔静脉)中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度。数据表示平均值±SD，n≥5。所示数据来自三个独立实验。(e)从5周龄开始，经饮用水中200mM乙酸钠(根据需要调节pH)处理25周或未经处理的SPF雌性NOD小鼠的T1D发病率。*P＜0.0046。(f)经饮用水中乙酸根处理或未经处理的10周龄NOD小鼠的胰岛炎评分。如方法中所述对浸润程度进行评分。NS＝无显著性。示出了两个中的一个代表性实验。

图2.递送SCFA的膳食针对糖尿病提供保护。(a)在HAMS、HAMSA或HAMSB膳食5周之后在15周龄时来自合并的雄性和雌性NOD小鼠的粪便、盲肠内容物、肝门静脉血和外周(腔静脉)血中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度。所示数据来自三个独立实验。数据表示平均值±SD；每个符号表示生物学重复。(b)从5周龄开始，饲喂NP、HAMS、HAMSA、HAMSB和HAMSP膳食5周时间的雌性NOD小鼠中的T1D发病率。***P＝0.0022(HAMSA相对于NP)，*P＝0.0476(HAMSA相对于HAMS)，*P＝0.042(HAMSB相对于NP)和NS(HMASP相对于NP)Mantel-Cox对数秩检验。(c)针对胰岛炎评分的胰岛的代表性图像。右手侧-来自以下雌性NOD小鼠的胰岛炎评分：5周龄、15周龄和25周龄糖尿病-饲喂NP；15周龄-饲喂HAMS、15周龄-饲喂HAMSA和30周龄-饲喂HAMSA后；15周龄-饲喂HAMSB和30周龄-饲喂HAMSB后。如方法中所述对浸润程度进行评分。(d)饲喂HAMSA/HAMSB组合膳食(combo diet)的雌性NOD小鼠中的T1D发病率。**P＝0.0018(15％+15％，或7.5％+7.5％)Mantel-Cox对数秩检验。示出了两个或三个中的一个代表性实验。NS＝无显著性。

图3.乙酸根抑制自身免疫性T细胞频率。来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的脾自身反应性(a)IGRP四聚体+CD8+和(b)BDC2.5四聚体+CD4+ T细胞的频率。TUM和hu CLIP分别用作四聚体对照，n＝5至6只小鼠。所示数据来自三个独立实验。(c)饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的NOD.8.3小鼠中的糖尿病发病率。***P＜0.0001(HAMSA相对于NP)。所示数据来自两个独立实验。(d)显示来自(c)的NOD8.3小鼠中IGRP四聚体+CD8+ T细胞的频率的代表性图。数据表示平均值±SD，n≥5。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。所示数据来自两个独立实验。

图4.乙酸根膳食影响B细胞功能和基因转录。(a)显示来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的脾和派尔集合淋巴结(Peyer’s Patch，PP)中IgM+B220+B细胞的频率和数目的累积数据。(b)来自(a)的脾IgM+B220+ B细胞中基于每个细胞的MHCI和CD86蛋白表达的代表性流式细胞术分析。大鼠IgG2ak用作同种型对照(黑线)，n＝5至6。示出了三个中的一个代表性实验。(c)显示经分选的脾CD21高CD23低(MZB)和CD21中CD23高(FOB)细胞(从总IgM+B220+ B细胞设门)上CD86和1112的表达的实时PCR，n＝3。数据表示三个实验之一，平均值±SEM。(d)显示来自(a)的IgM+B220+ B细胞上来自RNA-seq的差异表达的MDS图，n＝4。(e)针对HAMSB相对于NP对比(y轴)，来自HAMSA相对于NP对比(x轴)的脾总IgM+B220+ B细胞之间的基因表达谱。红色圆圈表示HAMSA和HAMSB膳食之间的差异表达测试的log2倍数变化表达基因，FDR＜0.05。(f)显示经分选的脾CD21高CD23低(MZB)和CD21中CD23高(FOB)细胞(从总IgM+B220+ B细胞设门)上HDAC3的表达的实时PCR，P＝0.0097(HAMSA相对于HAMSB)n＝3。数据表示三个实验之一，平均值±SEM。(g)来自饲喂NP、HAMS、HAMSA和HAMSB的NOD小鼠的PLN中经CFSE标记的NOD.8.3 CD8+ T细胞的增殖。显示PLN中CFSE-IGRP+CD8+ T细胞的频率的累积数据。P＝0.0082(HAMSA相对于HAMS)。数据表示平均值±SD，n＝5至6只小鼠。****P＜0.0001，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。示出了三个中的一个代表性实验。

图5.丁酸根增强有助于针对糖尿病提供保护的Treg生物学。(a)显示来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的脾CD4+FoxP3+ T细胞的频率和数目的累积数据，n≥5。示出了三个中的一个代表性实验。(b)转移有来自饲喂NP、HAMS、HAMSA和HAMSB的雌性NOD小鼠的总脾T细胞的NOD/SCID小鼠中的T1D发病率。Mantel-Cox对数秩检验****P＜0.0001(HAMS相对于NP-，HAMSA-相对于HAMS-，以及HAMSB-相对于HAMS-)。所示数据来自两个独立实验。(c)显示转移到饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的NOD/SCID雌性中之后3周PLN CD4+FoxP3+ T细胞的频率和数目的代表性图和累积数据。(d)产生IL10的CD4+Foxp3+HELIOS+ T细胞的频率。数据表示平均值±SD；每个符号表示单独的小鼠。****P＜0.0001，**P＜0.01，*P＜0.05，n＝3。所示数据来自两个独立实验。(e)对来自饲喂HAMS、HAMSA和HAMSB的雌性NOD小鼠的脾CD4+CD25- T细胞进行评估的Foxp3启动子处组蛋白的乙酰化(H3K9乙酰化和H4五乙酰化)，n＝5。P＝0.0027(H3K9，HAMS相对于HAMSB)并且****P＜0.0001(H4，HAMS相对于HAMSB)。IgG同种型对照用于评估非特异性结合。任意单位(AU)表示相对于H3结合的乙酰化富集。(f)来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的雌性NOD小鼠的PLN的表达CD45RB低CD25+的CD4+ T细胞中Foxp3、Gata3、Gitr和Sell(CD62L)的单细胞表达。从合并的小鼠获得单细胞，n＝6。所示数据来自三个独立实验。(g)显示饲喂HAMS(红色维恩图(venn diagram))和HAMSB(绿色维恩图)的小鼠中Gata3、Gitr和Sell(CD62L)的共表达的CD4+CD45RB低CD25+Foxp3高PLN T细胞(来自B)的维恩图。在维恩图内的数字表示表达Gata3、Gitr和Sell(CD62L)的Foxp3高细胞(实心圆圈)的数目，n＝30个单独分选的细胞。

图6.乙酸根部分地通过GPR43发挥作用以限制T1D严重程度。(a)饲喂NP、HAMS或HAMSA膳食的雌性NOD.Gpr43+/+和NOD.Gpr43-/-同窝小鼠(littermate)中的T1D发病率。**P＝0.0023(NOD.Gpr43+/+小鼠，NP相对于HAMSA)；*P＝0.0392(NOD.Gpr43+/+小鼠，NP_相对于HAMS)并且*P＝0.0179(NOD.Gpr43-/-小鼠，NP相对于HAMSA)。所示数据来自两个独立实验。(b)来自饲喂NP或HAMSA膳食的15周龄NOD.Gpr43+/+和NOD.Gpr43-/-小鼠的胰岛炎评分。如方法中所述对浸润程度进行评分。显示(c)脾和PLN CD4+FoxP3+ T细胞以及(d)IgM+B220+ B细胞的绝对数目的累积数据，n≥5。所示数据来自三个独立实验。(e)来自饲喂NP或HAMSA膳食的15周龄雌性NOD.Gpr43+/+和NOD.Gpr43-/-小鼠的PLN自身反应性IGRP四聚体+CD8+和IAg7/BDC2.5四聚体+CD4+ T细胞的频率。数据表示平均值±SD，n≥4。所示数据来自三个独立实验。

图7.乙酸根和丁酸根膳食改善在T1D发病机理中具有重要意义的参数，包括LPS、IL-21和TNFα。(a)饲喂NP的5周龄雌性C57BL/6、Balb/c小鼠以及饲喂NP的年龄匹配雌性(F)和雄性(M)NOD小鼠的结肠中Ocln、Tjp1、Muc2和Cdh1 mRNA的倍数变化表达。在对照C57BL/6和Balb/c小鼠中没有显示性别差异，对于每种膳食，n≥4个生物学重复。(b)饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB的15周龄雌性NOD小鼠的结肠中Ocln的表达的倍数变化。数据表示平均值±SEM，对于每种膳食，n≥7个生物学重复。所示数据来自三个独立实验。(c)饲喂NP的雌性年龄匹配C57BL/6和饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的雌性NOD小鼠的外周血(腔静脉)中LPS的浓度。数据表示平均值±SD，对于每种膳食，n≥3个生物学重复。所示数据来自三个独立实验。与饲喂NP的年龄匹配NOD.MyD88^-/-小鼠相比，来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB的15周龄雌性NOD小鼠的血清中(d)TNF-α、IL-21、(e)IL-22和TGF-β的浓度，对于每种膳食，n≥4个生物学重复。数据表示平均值±SD；每个符号表示单独的小鼠。****P＜0.0001，**P＜0.01，*P＜0.05。数据来自三个独立实验。

图8.膳食改变微生物生态学和代谢物产生，这有助于糖尿病保护。(a)用NP、HAMS、HAMSA或HAMSB成形微生物区系(microbiota)重新定植的雌性GF NOD小鼠中的T1D发病率。*P＝0.0204(HAMSA相对于NP)Mantel-Cox对数秩检验。(b)显示对于不同膳食在粪便转移(fecal transfer，FT)之后在来自SPF NOD小鼠和GF NOD小鼠的粪便中检测到的属(genera)的分布的条形图，每组n＝5至6。每个属由不同的颜色表示，并且与在每个样品中的相对丰度成比例。图例显示相对丰度高于1％的属。(c)显示在饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的NOD小鼠中SCFA乙酸根、丁酸根和丙酸根与细菌属之间关系的基于Pearson相关性的网络。描绘属的节点按照该属所属的门着色，而乙酸根、丁酸根和丙酸根用红色圆圈表示。每个属节点的大小与该属的相对丰度成比例；绿线连接正相关节点并且蓝线连接负相关节点。拟杆菌属(Bacteroides)与乙酸根和丁酸根二者均正相关，在高乙酸根和丁酸根环境中生长旺盛，并且可能抑制其他正相关(绿线)属的模块的生长。(d)显示来自(a)的30周龄GF重新定植NOD小鼠的乙酸根、丁酸根和丙酸根的血清和盲肠浓度的累积数据，n≥2。数据表示为来自两个独立实验的平均值。(e)来自用经膳食改进的微生物区系重新定植的30周龄GF NOD小鼠的PLN CD4+Foxp3+ Treg细胞的频率和数目。(f)饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠中粪便代谢物的浓度，n≥5。(f)饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的受保护15周龄雌性NOD小鼠中粪便代谢物的浓度，n≥2至5。数据表示为平均值±SEM。符号表示单独的小鼠。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。数据表示两个独立实验的组合。

图9.(a)无菌(GF)NOD.MyD88-/-小鼠与无特定病原体(SPF)NOD.MyD88-/-小鼠中的T1D发病率；****P＜0.0001，Mantel-Cox对数秩检验。(b)5周龄雌性SPF和GF NOD和NOD.MyD88-/-小鼠的粪便中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度，以及(c)年龄匹配的雌性和雄性NOD和C57BL/6小鼠的粪便中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度。对于所有图，数据均表示平均值±SD；每个符号表示单独的小鼠。(d)饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的体重。****P＜0.0001，**P＜0.01，*P＜0.05。所有数据均为三个独立实验的代表。

图10.(a，b)作为来自(图4a)的脾IgM+B220+ B细胞中基于每个细胞的MHCI、CD86和MHCII的表面蛋白质表达的平均荧光指数(mean fluorescence index，MFI)+/-DS的累积数据。(c)显示来自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB的15周龄雌性NOD小鼠的脾IgM+B220+ B细胞中C80/B7.1、C80/B7.2、B2M和PRDM1相对于β-肌动蛋白的表达倍数变化的实时PCR。(d)显示来自分离自饲喂NP的NOD小鼠，饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB的NOD小鼠的MLN的总CD8+ T细胞的转移CFSE-IGRP+CD8+ T细胞的频率的代表性FACS图和累积数据。数据表示平均值±SD，对于每种膳食，n≥6个生物学重复。数据是至少三个独立实验的代表。

图11.(a)显示来自分离自饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的结肠的总CD4+ T细胞的CD4+FoxP3+CD103+ T细胞的频率和数目的累积数据。(b)显示脾、PLN和MNL CD4+FoxP3+ T细胞的频率的FACS图。数据表示平均值±SD；每个符号表示单独的小鼠。**P＜0.01。所有数据均为三个独立实验的代表。

图12.(a)将C57.Gpr43-/-小鼠在NOD品系上回交13代(NOD.Gpr43-/-)。一旦充分回交，在超过70,000个SNP的全基因组中对NOD.Gpr43-/-小鼠进行基因分型。对来自肝的DNA进行纯化并使用Mega-MUGA阵列(Geneseek，NB)对其进行基因分型。将基因型与参考(C57BL/6)等位基因和由NOD基因组序列确定的NOD等位基因进行比较(Yalcin等，2011)。敲除是在FVB背景下产生的，因此将单倍型描述为来自NOD基因组(蓝色)或非NOD基因组(红色)；灰色表示其中C57BL/6和NOD具有相同基因型的非信息区。该图示出了每个小鼠染色体上单倍型的来源品系，其中每个染色体的物理尺寸示于X轴上。该分析示出除7号染色体上Gpr43基因座周围的区域之外，所有染色体均来源于NOD品系。因此，这些小鼠具有所有NODT1D易感基因座，分别包括7号染色体上定位(mapped)于约19Mb和约80至120MB的Idd7和Idd27基因座。这使我们能够确定在非NOD间隔没有报道T1D易感基因。(对于所有图，每个符号均表示单独的小鼠。(饲喂NP、HAMS或HAMSA膳食的15周龄雌性NOD.Gpr43-/-小鼠的(b)粪便、(c)盲肠内容物和(d)外周血(腔静脉)中乙酸根、丁酸根和丙酸根的浓度。***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05(饲喂HAMSA相对于饲喂HAMS的NOD.Gpr43-/-小鼠)。每个符号表示单独的小鼠。数据表示为平均值±SD。所有数据均为三个独立实验的代表。

图13.(a)饲喂NP的雌性NOD.Gpr109a-/-中的T1D发病率。(b)通过基于非加权(左图)和加权(右图)Unifrac距离度量的PCoA图进行的来自饲喂NP、HAMS、HAMSA和HAMSB膳食的NOD和GF重新定植NOD小鼠的粪便的微生物谱分析。基于加权(P＝6.2E-5)和非加权(P＜1E-6)Unifrac二者、1E6置换和Adonis置换多变量统计学(permutational multivariatestatistics)，不同膳食的细菌群落显著不同。该图例用相同颜色表示来自用经NP、HAMS、HAMSA和HAMSB改进微生物区系重新定植的供体NOD小鼠和GF NOD小鼠的微生物区系，其中GF重新定植NOD小鼠在较暗的阴影中。(FT)指示粪便移植。(c)在饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食的NOD小鼠中和对于不同膳食在粪便转移(FT)后的GF NOD小鼠中所选细菌群体在(属水平)的相对丰度。数据表示平均值±SD；每个符号表示单独的小鼠。*P＜0.05。所有数据均为两个独立实验的代表。

具体实施方式

食用作为健康膳食的一部分的提高的纤维因其具有针对慢性病提供保护的潜力而被认可，特别是食用通过结肠微生物区系进行发酵的抗性淀粉(Macia等，2015)。该发酵产生短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)，主要是乙酸、丙酸和丁酸。可能的是，SCFA介导许多归因于纤维的作用，并且其供应对于最佳肠功能至关重要。

大肠中由纤维的细菌发酵产生的SCFA可以以多种方式促进肠健康。例如，这些酸被认为对于通过提高血流来维持内脏功能是重要的，并且有助于改善腹泻中的电解质和流体吸收，维持低结肠pH以限制肠病原体的生长并且还调节结肠肌肉活动。然而，虽然已在患有GI道病症的人群中对高含乙酰化或丁酰化高直链玉米淀粉(acetylated orbutyrylated high amylose maize starch)(分别称为HAMSA和HAMSB)的膳食进行了试验(Annison等，2003，Feehily&Karatzas，2013)，但先前描述的用于校正生态失调(dysbiosis)的大多数努力依赖于益生菌的使用。

本发明人已惊奇地发现，SCFA也在消化系统之外发挥作用，并且特别是在针对自身免疫病提供保护中发挥重要作用。特别地，发明人已发现提供至少两种不同SCFA的组合可提供针对发生自身免疫病的保护，并且还可代表新的治疗模式。

因此，在第一方面，本发明涉及在个体中治疗或预防自身免疫病的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而治疗或预防自身免疫病。

根据本发明使用的短链脂肪酸(SCFA)选自丁酸、乙酸和丙酸。在一个实施方案中，SCFA的组合是乙酸和丙酸的组合。在另一个实施方案中，该组合是丙酸和丁酸。在一个特别优选的实施方案中，SCFA是丁酸和乙酸。在另一个实施方案中，使用了所有三种SCFA。

短链脂肪酸可作为钠、钾、钙或镁盐提供。当两种或更多种短链脂肪酸中的一种是丁酸时，优选地，盐是丁酸钠。当两种或更多种短链脂肪酸中的一种是乙酸时，优选地，盐是乙酸钠。

在一些实施方案中，短链脂肪酸可作为羧酸与具有1至6个碳的支链或非支链烷基醇的酯存在。例如，短链脂肪酸可作为乙酯、丙酯、丁酯、异丙酯、叔丁酯、戊酯或己酯存在。

短链脂肪酸的组合还可包含选自异丁酸、叔丁基羧酸、戊酸、己酸等的另外的短链脂肪酸。此外，所述另外的短链脂肪酸可被一至三个取代基(例如卤素(氟、氯、溴、碘)、氰基、羟基、甲氧基、酮基等)取代。可用的经取代短链脂肪酸的一些实例包括羟基乙酸、酮基丙酸和4，4-三氟丁酸。

当两种或更多种短链脂肪酸中的一种是丁酸时，丁酸以三丁精(tributyrin)形式的前药提供，所述三丁精是由丁酸和甘油构成的酯。

此外，本发明人已发现乙酸和丁酸在不同但互补的途径中发挥作用以改善肠稳态、肠细菌生态学以及Treg数目和功能。例如，不希望受理论束缚，发明人认为丁酸通过Treg相关途径发挥作用，该途径不同于对乙酸描述的途径并且包括增强的TGFβ产生。此外，认为乙酸特别地可用于改变抗原呈递细胞(特别是B细胞)的作用，从而改变自身免疫性T效应细胞的频率。

因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及在个体中治疗或预防自身免疫病的方法，该方法包括在个体中提供治疗有效量的乙酸和丁酸、其酯或盐，从而治疗或预防自身免疫病。

SCFA可通过技术人员已知的任意数量的方式在需要治疗的个体中提供。例如，在一个实施方案中，如本文中进一步描述的，在用于经口、局部或全身施用的药物制剂中提供SCFA。在一个优选实施方案中，并且如本文中进一步描述的，药物制剂适于将SCFA递送至个体的大肠，更特别是结肠。

或者，可将SCFA作为个体膳食的一部分提供给个体，由此提供SCFA用于在膳食剂在胃肠道的期望区域中消化之后与消化道的细胞接触。在一个优选实施方案中，如本文中进一步描述的，膳食剂提供SCFA在结肠中的释放。

本发明的方法可用于预防和/或治疗导致身体的一个或更多个区域中自身免疫性炎性应答提高的任何疾病。因此，本发明的方法可用于治疗与功能障碍/无效的调节性T细胞功能、扩增的自身反应性T效应细胞和/或B细胞功能障碍相关的疾病。可根据本发明预防和/或治疗的疾病是自身免疫病，包括例如选自以下的自身免疫病：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、原发性胆汁性肝硬化和多发性硬化。

本发明的方法在1型糖尿病的预防和治疗中具有特别的效用。

如本文中所用，“防止”、“预防”、“预防性”或“防止性”是指防止发生病症、疾病、障碍或表型，包括异常或症状，或者阻止、防御或免于其发生。需要预防的个体可易于发生自身免疫病。例如，根据本发明来预防自身免疫病包括在被确定为处于发生疾病风险之中的个体中防止所述疾病的发作。可通过遗传检测、环境因素分析、家族史或其他因素将个体确定为处于风险之中。

需要治疗的个体可以是被诊断患有本文中所述的任一种自身免疫病或处于其发生风险之中的个体。本文中使用的术语“治疗”包括使疾病的进展最小化或延迟疾病的进展。例如，本发明的方法可用于在显现出早期疾病迹象的个体中防止疾病的发作。作为一个实例，在I型糖尿病的情况下，具有早期疾病迹象的个体可显现出胰岛损伤的迹象，或者具有为胰腺损伤之标志物的胰岛自身抗体，但尚未具有异常的葡萄糖耐量。疾病的进一步发展可包括异常的葡萄糖耐量，但尚不需要胰岛素治疗。技术人员将理解，本发明的方法可用于在任何这些情况下治疗I型糖尿病。

除灵长类(例如人)之外，多种其他哺乳动物也可根据本发明的方法进行治疗。例如，可治疗哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠，或者其他牛、羊、马、犬、猫、啮齿类或鼠物种。

药物制剂

本发明提供了能够在需要自身免疫病治疗的个体中递送SCFA的药物制剂。

本领域技术人员将理解，本文中所述的药物制剂可包含游离脂肪酸、酯或盐形式，或者作为替代地作为缀合物的SCFA，例如乙酰化或丁酰化淀粉。

本文中所述的药物制剂可包含单一种类的SCFA或者两种或更多种SCFA的组合。例如，在进行本发明的方法时，可向需要自身免疫病治疗的人施用包含两种或更多种SCFA的组合的单一药物剂型。例如，所述剂型可包含乙酸和丁酸、其盐或酯。或者，所述剂型可以包含乙酸和丙酸、其盐或酯，或者丁酸和丙酸及其盐。此外，所述剂型可包含乙酸、丁酸和丙酸中的所有三种，包括其盐或酯。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法通过向有此需要的个体施用包含治疗有效量的丁酸和乙酸、其盐或酯的药物剂型来进行。

本发明的方法还预期提供用包含单一种类SCFA的一种或更多种药物剂型依次或同时给药。

本发明的药物组合物可例如根据例如药物制剂领域公知的那些的技术通过使用常规的固体或液体载剂或稀释剂以及适合于期望施用模式的类型的药用添加剂(例如，赋形剂、黏合剂、防腐剂、稳定剂、香料等)来配制。

本发明的药物组合物可以是适于经口使用的形式，例如如片剂、锭剂(troche)、糖锭(lozenge)、水性或油性混悬剂、可分散的散剂或颗粒剂(granule)、乳剂、硬或软胶囊剂、或者糖浆剂或酏剂。期望用于经口使用的组合物可根据本领域中已知的用于制备药物组合物的任何方法来制备，并且这样的组合物可包含选自甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的一种或更多种物质以提供药学上精致且适口的制剂。片剂包含与适合制备片剂的无毒性可药用赋形剂混合的SCFA活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；黏合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。

延迟释放经口剂型

本发明人已惊奇地发现，将高剂量的乙酸根和丁酸根的组合递送至对象的下肠道，极大地影响自身免疫病并且特别是1型糖尿病(type 1diabetes，T1D)的发生和进展。本发明的方法和用于这些方法的药物制剂允许在小肠或大肠(包括结肠)中提供非常高的SCFA水平，以直接促进肠稳态、肠细菌生态学以及Treg数目和功能的改善。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗或预防自身免疫病的方法，该方法包括：

向个体施用包含治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合的药物剂型，其中所述短链脂肪酸选自丁酸和乙酸和丙酸；

其中所述药物剂型适于将短链脂肪酸释放到个体的下胃肠道中；

从而治疗或预防自身免疫病。

技术人员将熟悉用于产生有利于将活性剂递送至胃肠道的期望区域的延迟释放经口剂型的方法。因此，在一个实施方案中，本发明涉及包含两种或更多种SCFA和药学上有效的赋形剂的经口剂型，其中所述剂型适于将SCFA释放到大肠中。

本文中使用的术语“延迟释放”是指通过以下实现的SCFA递送：将包含SCFA的药物组合物配制成使得SCFA的释放将在下GI道中某个通常可预测的位置处完成，相对于如果不改变SCFA递送本来可以完成的，所述位置更远。

本文中使用的术语“胃肠道”或“GI道”是指消化道，即从口延伸至肛门的长度为约30英尺的肌膜管。本文中使用的术语“上胃肠道”意指口腔、咽、食管和胃。本文中使用的术语“下胃肠道”意指小肠和大肠。

本文中使用的术语“小肠”意指由十二指肠、空肠和回肠组成的下胃肠道部分，即，恰好位于胃底的十二指肠括约肌远端且在大肠近端的肠道部分。

本文中使用的术语“大肠”意指开始于盲肠的恰好位于小肠远端的下胃肠道部分，其包括升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠。

在本发明的某些实施方案中，可期望实现将SCFA(作为游离酸、盐、或酯化酸)递送至小肠或其特定区段(例如，十二指肠、空肠或回肠)。在另一些情况下，可期望以推注量将SCFA递送至小肠。

在本发明的某些实施方案中，可期望实现将SCFA(作为游离酸、盐、或酯化酸)递送至大肠或其特定区段(例如，升结肠)。在另一些情况下，可期望以推注量将SCFA递送至大肠。

在一个实施方案中，经口剂型包含这样的肠溶衣，其对在胃中降解具有抗性，但一旦剂型离开胃并进入小肠其就溶解。在一个替代实施方案中，经口剂型包含这样的肠溶衣，其对在胃和小肠中降解具有抗性，但一旦剂型到达大肠中就溶解。技术人员将熟悉使用肠溶衣材料来控制药物剂型中包含的活性成分的释放，使得活性成分被释放在胃肠道中的特定位置。

技术人员将理解，本领域技术人员可通过操纵以下任意一个或更多个来令人满意地控制在小肠或大肠中递送的最终部位和/或速率：

(a)包衣的类型、添加至包衣的赋形剂的类型和水平以及包衣的伴随期望厚度和渗透性(溶胀特性)；

(b)包衣本身和/或经包衣片剂、粒剂(particle)、珠剂或颗粒剂内的时间依赖性条件；

(c)包衣本身和/或经包衣片剂、粒剂、珠剂或颗粒剂内的pH依赖性条件；

(d)包衣的溶解速率；

在本发明的某些实施方案中，可通过将SCFA递送至患有自身免疫病和需要自身免疫病治疗的人或其他哺乳动物的大肠来成功治疗所述人或其他哺乳动物。本文中所述的剂型实现释放至大肠，并且阻止SCFA在口、咽、食管、胃和/或小肠中的不期望释放，从而防止SCFA在其被释放到其在胃肠道中的预期部位之前降解。

用于将SCFA靶向释放在小肠或大肠(包括结肠)中的多种手段均适用于本发明。用于递送至大肠的手段的一些非限制性实例包括pH触发的递送系统和时间依赖性递送系统。

本发明的一个实施方案涉及用不被胃肠液分解以直至到达肠道中的特定期望点再释放SCFA的物质对SCFA进行包衣(或以其他方式包封)。在一个实施方案中，药物组合物的延迟释放通过用以下物质对SCFA的片剂、胶囊剂、粒剂或颗粒剂进行包衣来实现，所述物质是pH依赖性的，即在通常存在于大肠中但不存在于上胃肠道(即，口、口腔、咽、食管或胃)或下GI道的pH下分解或溶解。

本发明的一个实施方案是使用由部分甲基酯化的甲基丙烯酸聚合物制成的pH依赖性肠溶衣材料来递送至小肠或大肠。经口剂型可以是由活性成分的颗粒剂或粒剂制成的经肠溶包衣压制片剂的形式。在低于5.0的pH(即，其通常见于口、咽、食管、胃中)下不溶解但在约pH 5.5至约pH 7.5(即，其存在于小肠和大肠中)可溶的任何肠溶衣均可用于本发明的实践。例如，当期望实现将SCFA递送至大肠时，在低于6.5的pH下完全或部分不溶且在高于pH 6.5下可溶的任何肠溶衣均是合适的。

技术人员将理解pH沿着消化道而变化并且能够确定合适的肠溶衣以确保在胃肠道中的合适或期望位置，剂型崩解并且活性成分被释放。

单独或与其他包衣组合可用于本文中所述治疗方法的适于对活性成分的经口剂型和/或颗粒剂、粒剂或珠剂进行包衣的甲基丙烯酸共聚物是阴离子羧酸聚合物。特别优选的是，该聚合物是丙烯酸类聚合物，最优选部分甲基酯化的甲基丙烯酸聚合物，其中阴离子游离羧基与酯基团的比例为约1∶1。

特别合适的甲基丙烯酸共聚物是Eudragit特别是由Rohm Pharma GmbH，Weiterstadt，West Germany制造的Eudragit 和Eudragit在Eudragit 中，游离羧基与酯基团的比例为约1∶1。此外，已知所述共聚物在pH低于5.5，通常为1.5至5.5(即，其通常存在于上胃肠道的流体中)的胃肠液中不溶解，但在高于5.5的pH(即，其通常存在于下胃肠道的流体中)下易溶。这样的共聚物可用于旨在促进活性成分释放到小肠中的肠溶衣。

替代性共聚物是由Rohm Pharma GmbH和Co.KG，Darmstadt，Germany制造的Eudragit 和Eudragit Eudragit 与Eudragit L30不同，仅是因为游离羧基与酯基的比例为约1∶2。与Eudragit L 一样，Eudragit 也在低于5.5的pH下基本不溶解，但与Eudragit L 30不同，其在pH为5.5至7.0(例如存在于小肠液中)的GI流体中溶解性差。Eudragit 在pH 7.0且更高(即，其通常存在于末端回肠和结肠中)下是可溶的。

Eudragit 也可单独用作包衣，其可通过延迟释放机理提供主要在大肠(比末端回肠更远)开始的SCFA成分递送。此外，在低于pH 7.0的肠液中溶解性差的Eudragit 可与在高于pH 5.5的肠液中可溶的Eudragit L 30组合使用，以实现可配制成将活性成分在肠道的不同区段递送的延迟释放组合物；使用Eudragit L 30得越多，就开始越近端的释放和递送，并且使用Eudragit 得越多，就开始越远端的释放和递送。

包衣可以并且通常将包含增塑剂和可能地其他包衣赋形剂，例如着色剂、表面活性剂、滑石和/或硬脂酸镁，其中许多是包衣领域中公知的。特别地，阴离子羧酸丙烯酸类聚合物通常将包含按重量计10％至25％的增塑剂，尤其是柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、聚乙二醇、乙酰化单甘油酯、丙二醇和三醋精。

使用常规包衣技术(例如流化床或锅包衣)来施加包衣。包衣厚度必须足以确保经口剂型基本上保持完整，直至到达小肠中期望的递送部位。

经口剂型可以是经包衣的压制片剂的形式，其包含SCFA的粒剂或颗粒剂；或者是经包衣或未经包衣的软或硬胶囊剂(例如，明胶、淀粉或羟丙基甲基纤维素)的形式，其包含本身是经肠溶包衣的SCFA的珠剂或粒剂。在本发明的一个实施方案中，片剂是压制的并且片剂是经肠溶包衣的。

时间依赖性递送系统和细菌酶触发系统

在本发明的另一个实施方案中，通过使用时间依赖性递送系统来实现SCFA向大肠的递送。考虑到胃排空之后建立的通过时间，SCFA释放(作为游离酸或酯化酸)可靶向至大肠的不同区段。

适于在本发明中使用的时间依赖性递送系统的方法包括但不限于例如PulsincapTM(Scherer DDS，Strathclyde，UK)、Time ClockTM(Zambon Group，Milan，Italy)和SyncroDose TM(Penwest，Patterson，NY)的装置，以及随时间降解以释放片剂内容物的多种包衣，例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素或任何合适的水凝胶。

在本发明的一个实施方案中，通过使用细菌酶触发系统来实现SCFA向大肠的递送。在结肠中通过细菌酶的作用从中触发药物释放的经口剂型是本领域中已知的。适用于本发明的细菌触发递送系统的多种方法包括二硫化物聚合物、糖苷前药和多糖作为基质/包衣剂(Watts&Illum，1997)。适合使用的细菌触发递送系统的另一些方法公开于Katsuma等，2004)中。在本发明的一个实施方案中，使用结肠靶向递送系统CODES^TM(YamanouchiPharma Technologies，Norman，Okla.)以将SCFA递送至结肠。该系统包含含有SCFA和糖类的片芯，所述片芯用酸溶性材料(例如Eudragit )包衣，并随后用肠溶衣(例如Eudragit )包衣。肠溶衣保护剂型免于在胃中降解，并且随后在胃排空之后在小肠中溶解。当剂型经过小肠时，酸溶性包衣提供针对降解的保护。当剂型到达大肠时，本地微生物区系将片芯中的糖类(例如，乳果糖)发酵成短链脂肪酸(例如异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸)，其随后使酸溶性包衣溶解以在结肠中释放核心片剂内容物。

因此，CODES系统的使用提供了另外一种向有此需要的个体的结肠提供提高量的丁酸的手段。因此，在另一个实施方案中，本发明考虑向个体的结肠提供SCFA，其包括向个体施用包含治疗有效量的乙酸、其酯或盐的药物剂型，

其中所述剂型包含片芯、糖类、酸溶性肠溶衣形式的内肠溶衣(例如Eugradit E)和外肠溶衣抗酸性肠溶衣(例如Eudragit L)。

在另一个实施方案中，所述剂型还在片芯中包含治疗有效量的丁酸、其酯或盐。

技术人员将熟悉可用于结肠靶向SCFA递送的替代方法，其包括压力依赖性系统、CODES^TM技术、微海绵、果胶和半乳甘露聚糖包衣、微生物触发的渗透系统和凝集素。

用于经口使用的制剂也可作为硬明胶胶囊剂提供，其中SCFA与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者作为软明胶胶囊剂提供，其中SCFA与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

水性混悬剂可含有与适于制备水性混悬剂的赋形剂混合的SCFA。这样的赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与来自于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与来自于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性混悬剂还可含有一种或更多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或更多种着色剂、一种或更多种矫味剂，以及一种或更多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。

油性混悬剂可通过将SCFA混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制。油性混悬剂可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或乙酰醇(acetyl alcohol)。可添加甜味剂(例如上文中所述的那些)和矫味剂以提供适口的经口制剂。这些可通过添加抗氧化剂(例如抗坏血酸)来保存。

适于通过添加水来制备水性混悬剂的可分散粉末和颗粒提供与分散剂或润湿剂、助悬剂和一种或更多种防腐剂混合的SCFA。合适的分散剂或润湿剂和助悬剂的实例有以上已经提到的那些。还可存在另外的赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以是水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油；或者矿物油，例如液体石蜡；或者这些的混合物。合适的乳化剂可以是：天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或西黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂；以及来自于脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可包含甜味剂和矫味剂。

糖浆剂和酏剂可配制成具有甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。其还可包含缓和剂(demulcent)、防腐剂和矫味剂以及着色剂。

直肠栓剂

本发明的方法还考虑通过作为直肠栓剂提供的药物剂型在大肠中提供SCFA。因此，在一个特别的实施方案中，将本发明的药物组合物配制成用于经直肠施用SCFA的栓剂。这些制剂可通过将SCFA与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体，并且因此在直肠中溶化以释放药物。这样的材料包括可可豆脂和聚乙二醇。直肠施用可用于消除胃肠道中与活性剂的经口施用相关的肠肝首过效应。在另一个实施方案中，直肠栓剂可包含作为酯化改性淀粉提供的SCFA，其中在直肠中释放改性淀粉之后，淀粉变得可用于被常驻微生物区系消化并随后作为消化的代谢物释放SCFA。

可注射制剂

本发明还涉及可注射药物制剂用于全身递送SCFA的用途。例如，可将SCFA直接注射到需要治疗或预防自身免疫病的个体的血流中。注射可适于静脉内或动脉内注射。在一个替代实施方案中，可注射制剂可适于皮下注射，以便于局部施用或延迟释放到血流中。

本发明的药物组合物可以是无菌可注射水性或油性混悬剂的形式。该混悬剂可根据已知技术使用以上已经提到的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。药物组合物还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬剂，例如作为在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受载剂和溶剂有水、林格溶液(Ringer’s solution)和等张氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常用作溶剂或混悬介质。出于此目的，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于制备可注射剂。

本发明的药物组合物可方便地以剂量单位形式存在，并且可通过药学领域公知的任何方法制备。所有方法包括使SCFA与可药用赋形剂在一起的步骤，所述赋形剂构成了一种或更多种辅助成分。通常来说，药物组合物如下制备：使SCFA均匀且紧密地与液体载体或细碎固体载体或二者缔合，并随后(如果需要的话)将产物成形为期望的制剂。

本发明的药物组合物也可配制在脂质体中。如本领域中所知，脂质体通常来源于磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在水性介质中的单层或多层水合液晶形成。可使用能够形成脂质体的任何无毒、生理学上可接受且可代谢的脂质。脂质体制剂可包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱，天然的和合成的均可。形成脂质体的方法是本领域中已知的。

本发明的药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。药物组合物中的SCFA和任选地另外的活性剂可作为在容器、包装或分配器中的分离的组分提供，以在本文中所述的本发明用途或方法中在相同或不同的时间单独或一起获取。

本文中使用的术语“可药用”意指载体、稀释剂或赋形剂对其接受者无害。

除非本文中另有说明，否则术语“组合物”和“制剂”可互换使用。

术语“……的施用”和/或“施用……”应理解为意指向需要治疗的个体提供。

膳食剂

酰化高直链淀粉是已知的。例如，这样的淀粉描述于US 5,840,860和Annison等，2003中，其全部内容通过引用并入本文(其中特别地参考实施例1、3、5、6和8)。具体地，乙酰化高直链玉米淀粉(HAMSA)、丁酰化高直链玉米淀粉(HAMSB)和丙酸酯高直链玉米淀粉(propionate high-amylose maize starch，HAMSP)是已知的，如同不含酯化脂肪酸的高直链玉米淀粉(HAMS)。单独使用这些酰化淀粉是已知的，然而，在此之前，先前没有考虑过利用这些淀粉的组合。

本发明人已出乎意料地发现，通过膳食递送高剂量的乙酸根和丁酸根的组合是极大地影响自身免疫病并且特别是1型糖尿病(T1D)的发生和进展的简单方法。膳食和细菌代谢物代表了药物方法的非常有前途的替代方案，以预防或治疗T1D和其他自身免疫病。

本发明的方法允许在结肠下部(lower colon)中释放非常高水平的SCFA，并且与通过摄入单独膳食纤维获得的水平相比，允许显著更高的水平。具体地，由于本文中所述的酰化淀粉对在个体的小肠中降解具有抗性，并且与在正常膳食中发现的淀粉相比具有更高量的脂肪酸，因此本文中所述的膳食剂和膳食使得能够在个体的大肠中提供显著更高剂量的短链脂肪酸，其可以以方便且安全的形式被个体施用或服用。

本文中还描述了用于制备用于本发明方法的膳食剂的示例性方法。

膳食代谢物在许多水平上发挥作用以校正肠或免疫稳态中的缺陷，限制自身反应性T细胞的数目并预防疾病。本发明的一个重要特征是大量乙酸根(天然产物)的膳食递送显示实现整个动物中B细胞分子谱的变化。此外，发现与对于乙酸根所描述的不同，丁酸根通过Treg相关途径针对T1D提供保护。因此，高乙酸根和丁酸根处理的特定组合代表了用于操纵免疫系统细胞而不仅是存在于结肠中的细胞的令人兴奋且简单的手段。

肠微生物区系对膳食的变化迅速作出响应(Faith等，2014；Zelante等，2013)，并且长期使用某些膳食允许耗尽受应激且无竞争性的细菌且由于适应性突变而出现新的更快生长的菌株。总之，本发明人已经示出使用膳食代谢物的方法代表了破坏自身免疫发病机理的新颖且有效的手段。

因此，本发明还提供了用于将两种或更多种短链脂肪酸递送到个体的大肠中的膳食剂，所述膳食剂包含与多个短链脂肪酸共价键合的载体，其中所述短链脂肪酸包括乙酸、丁酸和丙酸中的两种或更多种，并且其中短链脂肪酸通过可在个体的结肠中水解以给出游离脂肪酸的键与载体结合。

例如，在一个实施方案中，每个载体分子包含乙酸和丁酸部分。在一个替代实施方案中，每个载体分子包含乙酸和丙酸部分，或者丙酸和丁酸部分。在另一个实施方案中，每个载体分子包含至少一个乙酸、至少一个丁酸和至少一个丙酸分子。在另一些实施方案中，每个载体分子包含多个SCFA部分，其中SCFA是乙酸、丁酸或丙酸中两种或更多种的组合。

在一个优选实施方案中，载体分子是碳水化合物，但是本领域技术人员将理解可使用其他载体。碳水化合物可以是果胶、树胶、胶浆剂(mucilage)、纤维素、半纤维素、菊糖或寡糖。优选地，碳水化合物是淀粉。

在另一个优选实施方案中，本发明的膳食剂包含用两种不同的SCFA酰化的淀粉分子。例如，淀粉可用多个丁酸和乙酸部分二者酰化。在另一个实施方案中，淀粉用多个丁酸、乙酸和丙酸部分酰化。

本发明还考虑了具有不同取代度(degree of substitution)的多种载体分子。例如，当载体是淀粉分子时，本发明考虑的取代度为0.05至1.0，优选0.1至0.8，且更优选0.5。取代度为0.5意味着在整个淀粉分子中平均每2个葡萄糖分子有一个短链脂肪酸部分。技术人员将理解，短链脂肪酸部分的存在将不一定沿着淀粉分子的长度是均一的，而是代表平均部分数目。技术人员还将理解，当在单个淀粉分子上存在两种短链脂肪酸部分时，假设在淀粉分子上的每种短链脂肪酸部分具有相等的量，则0.5的取代度表示每4个分子大约1个一种类型的短链脂肪酸。

组合膳食

应理解，本发明还涉及向个体提供至少两种膳食剂，用于本文中所述的治疗方法。例如，膳食剂可各自用于向个体的大肠递送单一种类的短链脂肪酸，其中每种膳食剂包含载体，并且每个载体分子通过可在个体的结肠中水解以给出游离脂肪酸的键与短链脂肪酸分子共价键合。载体上每种脂肪酸的取代度为0.1至0.5，优选0.15至0.20。

因此，本发明还涉及组合膳食，该膳食包含两种或更多种上述膳食剂，用于在有此需要的个体的膳食中提供两种或更多种短链脂肪酸。

优选地，组合膳食包含乙酰化淀粉和丁酰化淀粉的组合，其各自如US 5,840,860中所述制备。在另一个实施方案中，组合膳食包含乙酰化淀粉和丙酰化淀粉的组合。在另一个实施方案中，组合膳食包含丁酰化淀粉和丙酰化淀粉的组合。

用于制备包含单一种类短链脂肪酸的膳食剂的方法是已知的，并且描述于US 5,840,860中，其通过引用并入本文并且在实施例中进一步描述。

剂量

本发明方法考虑提供一系列的短链脂肪酸剂量。应当理解，剂量可根据SCFA的施用模式、其被提供的形式(例如，作为经口剂型、注射剂或膳食剂)和短链脂肪酸的预期作用部位而变化。

优选地，当该方法涉及施用经口剂型以将短链脂肪酸的组合递送到个体的大肠中时，剂量为每天约0.01mg/kg至100mg/kg，优选每天0.1mg/kg至100mg/kg，更优选1mg/kg至50mg/kg。在一个最优选的实施方案中，乙酸、丁酸或丙酸中任一种的日剂量为2mg/kg至10mg/kg，包括3、4、5、6、7、8和9mg/kg。

在本发明的方法涉及使用膳食剂或组合膳食将短链脂肪酸的组合递送到大肠中的情况下，技术人员将理解，待食用的膳食剂或膳食的量将根据膳食的组成和并入膳食剂中所包含载体分子中的每种短链脂肪酸的比例而变化。

在一个实施方案中，当所述方法涉及提供包含与单一载体分子结合的两种短链脂肪酸的组合的膳食剂，并且所述载体是具有0.4取代度的淀粉(即，每2.5个分子约1个短链脂肪酸)时，对于50kg个体，剂量为每天约1g淀粉至40g淀粉，优选每天1g淀粉至每天10g淀粉(即每天0.02至0.2g/kg)。更优选地，剂量将为每天2g至8g(每天0.04g/kg至0.16g/kg)。更优选地，对于50kg个体，剂量为每天约3.75g淀粉分子(或0.075g/kg/天)。假设淀粉分子中这些脂肪酸的比例相等，这相当于每种短链脂肪酸约250mg至300mg。

或者，该方法还可包括施用由两种形式的酰化淀粉构成的组合膳食，所述酰化淀粉组合以提供两种短链脂肪酸。例如，经乙酸改性并且具有0.2取代度的淀粉(即，平均每5个葡萄糖分子1个乙酸)可以以每天0.04g/kg至0.16g/kg，更优选每天0.05g/kg至0.1g/kg，且更优选0.075g/kg/天的剂量使用。

施用

在一个实施方案中，SCFA在个体中提供用于在个体的大肠中释放，以使大肠的细胞与SCFA接触。这可通过许多手段来实现，包括使用用于经口施用的经肠溶包衣剂型，其被配制成用于在个体的结肠中释放SCFA。或者，SCFA可以以用于经直肠施用的药物剂型提供。

本发明的药物组合物可通过任何合适的方式施用，例如经口施用，例如以片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂形式；舌下施用；口含施用；肠胃外施用，例如通过皮下、静脉内、肌内、腹膜内或池内注射(intracistemal injection)或输注技术(例如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或混悬剂)；经鼻施用，例如通过吸入喷雾剂；表面施用，例如以乳膏剂或软膏剂的形式；或经直肠施用，例如以栓剂或灌肠剂的形式；在含有无毒可药用载剂或稀释剂的剂量单位制剂中施用。其可例如以适于立即释放或延长释放的形式，例如通过使用例如皮下植入物、经包封球状体或渗透泵的装置来施用。

在一个替代实施方案中，本发明的方法包括通过本文中所述的膳食剂或组合膳食来施用SCFA。

在另一些实施方案中，本发明考虑通过多于一种施用方式来提供SCFA，使得第一种SCFA可通过一种施用方式施用，且第二种SCFA通过替代方式施用。例如，在一个实施方案中，本发明可包括通过施用经口剂型来提供第一种SCFA并且通过静脉内注射适于静脉内注射的剂型来提供第二种SCFA。这对于易遭受首过代谢的SCFA(例如丁酸)的施用可特别有用。然而，技术人员将理解，可使用任意数量的组合来向需要的个体提供SCFA(即，药物剂型的组合、膳食剂与药物剂型的组合，或膳食剂的组合)。

因此，在一合实施方案中，本发明包括在有此需要的个体中预防或治疗自身免疫病的方法，其包括向个体施用包含第一种SCFA的第一药物剂型和包含第二种SCFA的第二药物剂型，其中第一药物剂型适于肠胃外注射，且第二药物剂型适于经口施用。

在一个优选实施方案中，本发明包括在有此需要的个体中预防或治疗自身免疫病的方法，其包括向个体施用包含丁酸、其酯或盐的第一药物剂型和包含乙酸、其酯或盐的第二药物剂型，其中第一药物剂型适于肠胃外注射，且第二药物剂型适于经口施用。

在另一个替代实施方案中，本发明提供了在有此需要的个体中预防或治疗自身免疫病的方法，其包括向个体施用包含乙酸、其酯或盐的第一药物剂型和包含丁酸、其酯或盐的第二药物剂型，其中第一药物剂型适于肠胃外注射，且第二药物剂型适于经口施用。

或者，本发明提供了在有此需要的个体中预防或治疗自身免疫病的方法，其包括向个体施用包含乙酸、其酯或盐的药物剂型和包含丁酸、其酯或盐的膳食剂。药物剂型可适用于肠胃外注射(包括静脉内或皮下注射)、经口施用或作为直肠栓剂。

组合治疗

本发明考虑了与其他方法组合的本文中所述的药物制剂、膳食剂或组合膳食用于向需要治疗或预防自身免疫病的个体的大肠提供高水平SCFA的用途。

例如，本发明的方法包括预先、同时或依次向个体提供一种或更多种包含益生元(prebiotic)或益生菌(probiotic)的药剂，其可用于改变个体的肠中微生物组的组成。技术人员将理解，这样的益生元或益生菌包括经遗传修饰细菌或未经遗传修饰细菌。

此外，本发明还考虑了与其他方法组合的本文中所述的药物制剂、膳食剂或组合膳食用于预防或治疗自身免疫病的用途。

在治疗I型糖尿病的背景下，本发明考虑了组合治疗，其包括施用胰岛素注射剂和根据本文中所述的任何方法施用SCFA。例如，在一个实施方案中，本发明考虑向有此需要的个体施用经口剂型，所述经口剂型适于将两种或更多种SCFA延迟释放到被诊断患有I型糖尿病的个体的大肠中，其中所述个体还接受皮下注射胰岛素。

在一个优选实施方案中，本发明涉及在有此需要的个体中治疗I型糖尿病的方法，其包括向个体施用：

经口剂型，其包含治疗有效量的乙酸和丁酸、其盐或酯，

其中经口剂型适于将乙酸和丁酸、其盐或酯延迟释放到个体的大肠中；

以及

治疗有效量的胰岛素，

从而在个体中治疗I型糖尿病。

实施例

实施例1：动物研究

实验方法

动物和模型

NOD/Lt(NOD)、C57BL/6和NOD.8.3小鼠来自Monash Animal Research Platform，Melbourne Australia。将均为C57BL/6背景的Gpr43-/-小鼠(Maslowski等，2009)和MyD88-/-小鼠(获得自Shizuo Akira)与NOD背景回交＞10次。GF NOD小鼠来自Germ FreeUnit(Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research)。NOD.FoxP3-GFP小鼠(NOD/ShiLt-Tg(FoxP3-EGFP/cre)1cJbs/J获自The Jackson Laboratory，USA。

为了使微生物区系标准化，在开始膳食之前，将来自多窝的小鼠混合并随机分配至各组。使用的经纯化膳食基于对如先前所述(Bajka等，2006)的AIN93-G膳食的均衡改进。从3、5或10周龄开始饲喂小鼠持续3至5周。如先前在(Bajka等，2006)中所述分析粪便、血液和盲肠内容物中的SCFA。如先前所述(等，2009)监测糖尿病。

所有涉及小鼠的实验操作均根据经相关的莫纳什大学动物伦理委员会(澳大利亚墨尔本)(Animal Ethics Committee of Monash University，Melbourne，Australia)批准的方案进行。

动物膳食

对照(LAMS)和乙酰化(HAMSA)、丙酰化(HAMSP)和丁酰化(HAMSB)淀粉膳食含有以下成分：

组分以g/kg计

流式细胞术以及脂多糖和细胞因子测量

单核细胞的免疫表型分析使用以下mAb：CD3e(145-2C11)、CD4(RM4-5)、CD25(PC61)、CD8α(Ly2)、CD44(IM7)、CD45R/B220(RA3-6B2)、IgM(11/41)、CD45RB(16A)、MHC II(I-Ak)(ABk)(10-3.6)、MHC I(H-2Kd)、CD86(B7-2)(GL1)、CD80(B7-1)(16-10A1)、CD62L(MEL-14)、CD103(2E7)、FoxP3(FJK-16s)。同种型对照包括IgG1，λ；IgG；IgG2a，κ。所使用的细胞内蛋白质：如等，2012中所述的IL-10(JES5-16E3)，HELIOS(22F6)和FoxP3按照制造商的转录因子染色方案(eBioscience，Biolegend)进行检测。所有Ab均来自BDBioscience、eBioscience或Biolegend。经染色样品使用BD LSRII流式细胞仪用FACSDiva软件(BD Biosciences)和FlowJo软件版本9.3.2(Tomy Digital Biology)进行分析。脾和PLN T细胞用经PE标记的IGRP206-214(H-2K(d)，VYLKTNVFL)四聚体、经PE标记的IAg7/BDC2.5mi(AHHPIWARMDA)四聚体进行染色。使用经PE标记的TUM(H-2K(d)，KYQAVTTTL)四聚体和经PE标记的IAg7/人CLIP 87-101(PVSKMRMATPLLMQA)四聚体作为所有实验中的阴性对照(由NIH Tetramer Facility，Atlanta，USA提供)，其中肽来自Mimotopes PTY LTD，Australia。

TNFα通过ELISA使用BD OptEIA试剂盒(BD Biosciences)来测量，IL-21通过ELISAReady-SET-Go！试剂盒(eBioscience)来测量，并且IL-22和TGFβ通过生物素化抗体(Biolegend)来测量。血浆脂多糖(LPS)通过ToxinSensorTM Chromogenic LAL内毒素测定试剂盒(GenScript，USA Inc.)根据制造商的手册来测量。

细菌DNA测序和生物信息学

使用QIAamp DNA粪便微型试剂盒(QIAGEN)提取来自粪便的细菌基因组DNA。使用正向引物5’AGAGTTTGATCCTGG 3’和反向引物5’TTACCGCGGCTGCT 3’靶向细菌16S rRNA基因的V1-V3区对DNA样品进行扩增，并使用Roche 454GS FLX+测序仪测序。

使用Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME)软件进行生物信息学分析。使用Pintail算法(Ashelford等，2005)检测并除去嵌合序列，并用Acacia(Bragg等，2012)进行去噪和错误校正。使用QIIME中的uclust算法以97％序列同一性挑选OTU。使用BLAST针对Greengenes数据库(DeSantis等，2006)在QIIME中分配分类。EzTaxon数据库用于另外将代表性OTU序列与可培养菌株的数据库进行比较(Chun等，2007)。网络在Calypso(http：//cgenome.net/calypso/)中可视化。

固有层Treg细胞分离、过继性转移

如先前所述(Arpaia等，2013)制备结肠固有层淋巴细胞。对于过继性转移到NOD/SCID小鼠中，从5周龄开始向NOD小鼠饲喂多种膳食持续10周。在15周时，将小鼠处死，并使用Miltenyi Biotec Pan T细胞分离试剂盒II用Miltenyi Biotec LS MACS分离柱以≥95％纯度从脾、外周淋巴结中分离总T细胞，并将其静脉内注射到用NP膳食饲喂的8周龄NOD/SCID小鼠中，并监测糖尿病的发生。为了分析Treg转化，使用Influx分选仪分选CD3+B220-Foxp3- T细胞(＞95％纯度)，并静脉内(i.v)转移到饲喂NP、HAMS、HAMSA和HAMSB的NOD/SCID小鼠中。对于NOD.8.3CD8+ T细胞的过继性转移，使用MACS CD8α+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)纯化来自NOD.8.3小鼠的脾、PLN和MLN的淋巴细胞。将5×10⁶个经CFSE标记的CD8+ T细胞静脉内注射到先前饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB持续2周的NOD接受者中。小鼠继续相同的膳食，在转移之后4天收获脾、PLN和MLN淋巴细胞并通过CFSE稀释分析CD8+ T细胞增殖后。

组织病理学

使用标准操作处理胰腺组织并染色。对于胰岛炎评分，以3个浓度(相隔100μm)获取胰腺切片。从5至15只小鼠中对至少100个胰岛进行评分。根据以下系统对胰岛进行分级：0级-无胰岛炎指征，1级-＜25％浸润，2级-25％至50％浸润，3级-50％至75％浸润，以及4级-＞75％浸润。

肠微生物区系经口管饲

收集粪便和盲肠内容物并以100μg物质：1ml PBS的比例将其重悬于脱氧PBS中。然后，将混合物均质化，以1000rpm离心5分钟，并将上清液用于管饲。向妊娠GF NOD小鼠及其幼仔管饲来自饲喂HAMS、HAMSA和HAMSB的8至10周龄NOD供体的200νl粪便和盲肠混合物。使母鼠在妊娠E18和分娩之后两周时接受混合物的两次经口管饲。使幼仔在断奶时(20-26日龄)在24小时内接受混合物的两次经口管饲。然后，追踪幼仔的发病率。

染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)

如(Thorburn等，2015)中所述进行染色质免疫沉淀(ChIP)。简言之，将经分选的CD4+CD25-(＞95％纯度)T细胞在0.6％多聚甲醛中固定，用PBS洗涤，然后在NP-40裂解缓冲液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCL(pH 7.4)，10mM NaCl，10mM MgCl2和蛋白酶抑制剂)，随后是SDS裂解缓冲液(1％SDS，10mM EDTA，50mM Tris-HCl(pH 8.1)和蛋白酶抑制剂)中裂解。使用Bioruptor Next Gen(Diagenode)将DNA在4℃下声处理30个循环，20秒开启，30秒关闭。将经声处理的染色质产物在1％Triton X-100，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，2mM EDTA中稀释。用IgG对照、抗组蛋白H3、抗乙酰基-组蛋白H3(Lys9)或抗-高乙酰化组蛋白H4(五乙酰化；K5、8、12、16和20乙酰化)抗体(Millipore，USA)进行ChIP。用蛋白A/G-Sepharose分离染色质，并用低盐缓冲液(0.1％SDS，1％Triton X-100，20mM Tris-HCl(pH8.1)，150mM NaCl和2mM EDTA)、高盐缓冲液(0.1％SDS，1％Triton X-100，20mM Tris-HCl(pH 8.1)，500mM NaCl和2mM EDTA)洗涤，并在LiCl缓冲液(0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，10mM Tris-HCl(pH 8.1)，1mM EDTA和0.25M LiCl)中稀释。在洗脱缓冲液(1％SDS和100mMNaHCO3)中回收DNA，在65℃下通过高盐处理(200mM NaCl)脱交联并在50℃下用蛋白酶K(40μg/ml蛋白酶K，10mM EDTA，40mM Tris-HCl(pH 8.1))处理。分离DNA用于使用对Foxp3启动子具有特异性的引物(F CTG AGG TTT GGA GCA GAA GGA，R GAG GCA GGT AGA GAC AGCATT G)进行qPCR。相对于H3，提供乙酰化的倍数提高。

实时PCR分析和Treg细胞单细胞表达分析

使用寡聚(dT)18引物扩增mRNA，提取来自结肠的RNA并使用Bioline的Tetro cDNA合成试剂盒将其转化为cDNA。在Biorad的Cfx384实时系统上使用Bioneer的Accupower 2xGreenstar qPCR主混合物进行qPCR。将所有表达相对于管家基因β-肌动蛋白进行标准化。将来自合并的PLN(n＝10只小鼠)的CD4+CD45RB低CD25+ Treg细胞单独直接分选到96孔qPCR板(Influx细胞分选仪器，BDBiosciences)中。使用The Life Technology Single-cell to CT试剂盒根据制造商的说明进行单细胞PCR。如先前所述(Polo等，2012)使用Biomark仪器(Fluidigm)进行单细胞表达分析。结果表示为Log2Ex＝-(Cq[基因]-LOD)。如果Log2Ex值为负，则Log2Ex＝0。

RNA-seq

使用RNeasy Qiagen试剂盒进行RNA提取。使用RNAseq测序通过Illumina 100-基础HT模式测序化学以片段末端读取格式将cRNA与整个小鼠基因组阵列杂交，按照IlluminaHiSeq 1500泳道对样品进行条形码编码。简言之，用单端测序对来自4种膳食×4个重复的RNA样品测序，每个样品约2000万个读出。

表1(a)来自15周龄饲喂HAMSA与饲喂HAMS的雌性NOD小鼠、饲喂HAMSB与饲喂HAMS的雌性NOD小鼠和饲喂HAMSA与饲喂HAMSB的雌性NOD小鼠的脾IgM+B220+ B细胞中差异表达的转录物。基因表达的平均倍数变化。使用q＜0.05的FDR截止值来限定组间差异表达的基因。(b)用于扩增mRNA用于RT-PCR表达分析的寡聚(dT)18引物的列表。

统计学分析

通过使用非参数曼-惠特尼U检验(GraphPad Prism软件，La Jolla，CA，USA)计算P值确定用于比较两个独立组的统计学显著性。对于所有膳食数据，进行以下比较：(1)NP与HAMS，(2)HAMS与HAMSA，(3)HAMS与HAMSB，(4)NP与HAMSA，(5)NP与HAMSB。将糖尿病发病率研究以Kaplan-Meier存活图绘图并以2个自由度使用Mantel-Cox对数秩检验进行分析。****P＜0.0001，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。

结果

肠微生物代谢物与针对糖尿病的保护相关

与年龄和性别匹配的NOD小鼠相比，SPF NOD.MyD88-/-小鼠中SCFA乙酸根的外周血浓度高度地升高(2-3倍)(图1a)。这也与SPF NOD.MyD88-/-小鼠的粪便中乙酸的高浓度一致(图9b)，表明SCFA产生细菌与保护之间存在正相关关系。丁酸根在外周血中也升高(图1a)，但是在正常条件下几乎检测不到这种代谢物。与SPF NOD小鼠(5-20μM)相比，在SPFNOD.MyD88-/-小鼠中发现肝门静脉血中的高浓度丁酸根(50-100μM)(图1b)。肝门静脉血中的乙酸根浓度支持在外周血中观察到的结果。

为了确定微生物区系来源的SCFA是否改变发病率，检查了在GF条件下饲养的正常NOD小鼠中的疾病进展。与SPF NOD小鼠相比，GF NOD小鼠组群中的糖尿病外显率(penetrance)更高(图1c)，并且这与粪便中丁酸根浓度显著降低相关(图9B)。虽然在SPF和GF NOD小鼠之间粪便乙酸根浓度没有显著变化，但是与GF相比，在SPF NOD.MyD88-/-小鼠中发现了更高浓度的粪便乙酸根和丁酸根(图9b)。

胰岛中的胰岛炎在NOD小鼠中在约5周龄时出现，并且显性糖尿病在15至30周龄期间在60％至80％的雌性中发生但仅在20％至30％的雄性中发生。一致地，发现与年龄匹配的雄性NOD小鼠相比，年轻雌性NOD小鼠的外周血中乙酸根和丁酸根二者的浓度均显著更低(图1d)。在C57/BL6小鼠中未观察到粪便SCFA浓度的性别差异(图9c)，表明SCFA的细菌产生不足是雌性NOD小鼠的特殊现象。

为了确定经口施用乙酸(以提高其在循环中的浓度)是否可调节疾病进展，将乙酸盐添加至NOD雌性小鼠的饮用水中。从5周龄开始，乙酸盐处理显著延迟糖尿病的发生(在30周龄时，发病率为40％相对于对照中的70％)(图1e)。在10周龄(开始处理之后5周)时，乙酸盐处理的NOD小鼠具有更多没有免疫细胞浸润的胰岛，以及更少具有高级浸润(胰岛炎评分为3或4)的胰岛(图1f)。

通过高乙酸根和丁酸根产生膳食提高SCFA针对T1D提供保护

SCFA的经口施用使其循环浓度迅速且短暂地升高，但不模拟其通过膳食纤维的细菌发酵从结肠的持续吸收(Topping&Clifton，2001和Illman等，1988)。除了来源于纤维的SCFA的组合作用之外，一个重要的问题是单独的SCFA在T1D风险中的作用。因此，使用专用高直链玉米淀粉(HAMS)膳食，其是乙酰化(HAMSA)或丁酰化(HAMSB)的。酰化淀粉(HAMS)在很大程度上抵抗小肠淀粉分解并通至结肠，在那里细菌释放其并入的特定SCFA。然后，在产生正常范围的SCFA下发酵HHAMS。已示出，这些淀粉是评估特定SCFA(即乙酸根与丁酸根)对肠生物学的作用的有力工具(Fukuda等，2011；Clarke等，2008；Bajka等，2010)。

在用HAMSA或HAMSB膳食饲喂雌性NOD小鼠5周后，与饲喂HAMS的对照NOD小鼠相比，粪便、盲肠消化物、肝门静脉血和外周静脉血中乙酸根或丁酸根的浓度显著提高(图2a)。这些结果示出了靶向结肠细菌的高乙酸根和丁酸根产生膳食分别产生乙酸根和丁酸根的有效能力，以及其如何以高浓度到达外周循环。乙酸根被认为是厌氧发酵的终产物，但产生丁酸根的细菌(例如普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii))可以是乙酸根的净使用者。这可解释饲喂HAMSA的小鼠中的略高丁酸根浓度。同样地，饲喂HAMSA和HAMSB的小鼠中都较高的肠丙酸根浓度表明乙酸根或丁酸根的高递送反馈至丙酸根的细菌产生(图2a)。使用任一膳食的小鼠均与饲喂HAMS或饲喂非纯化(nonpurified，NP)膳食的小鼠具有类似的体重(图9d)。膳食没有显著改变门静脉血或外周血中的丙酸根浓度。

在NOD小鼠中，与从胰岛炎进展至临床糖尿病相关的免疫炎性事件发生在5至15周龄之间(等，2008；Ayyavoo等，2013)。针对抗原(例如胰岛素)的自身抗体可在早至5周时出现，表明免疫耐受的破坏充分发生在显性糖尿病的迹象之前。

为了确定相对晚施用专用高SCFA产生膳食是否会影响T1D的发生，从10周龄开始向雌性NOD小鼠饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB持续5周，并随后将小鼠恢复至对照NP膳食并监测糖尿病发病率。到30周龄时，连续饲喂NP膳食的雌性NOD小鼠以预期的高频率发生糖尿病(图2b)。与饲喂NP的雌性NOD小鼠相比，HAMS膳食没有显著延迟糖尿病。相比之下，71％饲喂HAMSA和62％饲喂HAMSB的雌性NOD小鼠被保护免于T1D(图2b)。代表性组织学和胰岛炎评分显示，与饲喂HAMS的15周龄NOD小鼠相比，饲喂HAMSA和饲喂HAMSB的年龄匹配雌性NOD小鼠具有更高数量的没有浸润的胰岛(0级)，差异保持直至30周龄(图2c)。

与用其他膳食进行的完全一样，向NOD小鼠饲喂HAMSA和HAMSB(15％+15％)的组合。图2d显示使用该组合膳食，100％的NOD小鼠被保护免于糖尿病直至28周。

饲喂HAMSA降低自身免疫性T细胞频率

T1D的发病机理涉及通过自身反应性T细胞来杀伤胰岛β细胞。引人注目的是，这两种膳食但特别是产生乙酸根的HAMSA显著降低识别胰岛特异性抗原葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)的脾致糖尿病CD8+ T细胞和携带致糖尿病T细胞受体BDC2.5的CD4+细胞的频率(图3a，b)。IGRP反应性四聚体+CD8+ T细胞的频率从饲喂NAMS的对照NOD小鼠中的约1％降低至饲喂HAMSA的小鼠中的0.2％(图3a)，并且BDC2.5-反应性四聚体+CD4+ T细胞降低2倍(图2b)。

NOD 8.3小鼠迅速发生糖尿病，其中到10周龄时发病率为约100％。令人感兴趣的是，饲喂HAMSA膳食的NOD.8.3小鼠显示出糖尿病发生的显著延迟(图3c)。在饲喂HAMSA而不是饲喂HAMSB的NOD8.3小鼠中，IGPR反应性T细胞的百分比显著降低(图3d)。

在NOD小鼠中乙酸根对B细胞的作用针对T1D提供保护

SCFA可能通过影响其他细胞类型(例如支持自身反应性T细胞扩增的APC)而削弱自身免疫应答。为了检验这一点，向NOD.8.3小鼠饲喂不同的膳食。NOD.8.3小鼠的集落迅速发生糖尿病，其中截止10周龄时发病率为约100％，因为其表达来源于识别IGRP61的CD8+ T细胞克隆NY8.3的TCRαβ转基因。饲喂HAMSA(而不是HAMSB)膳食的NOD.8.3小鼠表现出显著延迟的糖尿病发生(图3c)。饲喂HAMSA而不是饲喂HAMSB的NOD8.3小鼠中IGRP反应性T细胞的数目显著降低(图3d)。饲喂HAMSA的NOD8.3小鼠中Treg细胞的频率类似于在饲喂HAMSB和饲喂HAMS的NOD8.3小鼠(数据未示出)中观察到的频率，表明存在其他机理。抗原呈递B细胞在NOD小鼠中的CD8+扩增中发挥重要作用。将NOD8.3 T细胞转移到缺乏B细胞的NOD.μMT^(-/-)或NOD/SCID小鼠中使糖尿病无法高效地转移，但转移通过预先植入B细胞而恢复(等，2012；Ziegler等，2013)。在先前的研究中，发现B细胞通过直接向CD4+和CD8+ T细胞呈递胰岛抗原并抑制Treg细胞功能而在NOD小鼠中促进疾病(Bajka等，2010；Lagger等，2002；Yamaguchi等，2010)。饲喂HAMSA的NOD小鼠表现出脾和派尔集合淋巴结(Peyer’s patch)中IgM+ B220+ B细胞的频率和数目降低(图4a)。引人注目的是，通过流式细胞术，来自饲喂HAMSA(而不是饲喂HAMSB)的NOD小鼠的脾和PLN的IgM+ B220+ B细胞显示MHC I以及APC的共刺激分子CD86的表达显著降低(图4b，10a)。在CD40、MHC II或CD80表达中未观察到变化(图10b)。为了证实这些发现，使用基因微阵列来探询来自饲喂不同膳食的小鼠的B细胞。

在CD80/B7.1、CD86/B7.2、B2M、PRDM1(Blimp1)和MYD88的基因表达水平验证总B细胞在蛋白质水平的变化(图10c)。β2-微球蛋白和MyD88对于MHC I表达是必需的，而Blimp1对于调节B细胞增殖和分化是必需的。令人感兴趣的是，HAMSA和HAMSB均降低了IL12产生成熟边缘区(mature marginal zone，MZB)B细胞中的CD86表达(图4c)，所述细胞是参与免疫耐受的破坏的亚群。对于上述基因转录物，B细胞中表达的变化表明乙酸根或丁酸根膳食可对全局基因转录具有深远作用。对从用NP、HAMS、HAMSA或HAMSB膳食饲喂5周的15周龄小鼠分离的95％纯经分选脾B细胞进行RNA测序。在多维标度分析(multidimensional scalinganalysis)中，来自饲喂HAMSA的小鼠的IgM+B220+ B细胞进一步远离对照样品(HAMS或NP)(图4d)，表明支持提高的表达的可变性的提高。实际上，与NP膳食相比，在HAMSA和HAMSB之间有208个基因差异表达。14个基因参与重要的B细胞功能，例如抗原呈递、BCR信号传导、细胞代谢和细胞毒性T细胞的活化(图4e和表1a)。提高的膳食SCFA下调热休克蛋白基因(例如Hspa1a和Hspa1b)，并且尿水平升高与T1D患儿中的进行性肾衰竭相关(Yilmaz等，2016)。类似地，HAMSA和HAMSB二者均下调Il10ra的表达。在感染模型中，IL10受体的阻断显著降低血浆B细胞并促成感染。SCFA抑制HDAC活性并维持组蛋白乙酰化。发现B细胞上Gnb3的表达提高，该基因与HDAC3的表达降低相关。HDAC1和2缺陷的小鼠显示出被破坏的B细胞发育、存活和活化。来自饲喂HAMSA的小鼠的成熟B细胞亚群(MZB和FOB)中HDAC3转录物的表达显著降低(图4f)，这可能与我们观察到的显著基因表达变化相关。这与MHC I和CD86的表达降低相关，说明B细胞向CD8+ T细胞交叉呈递自身抗原的能力降低。

为了测试HAMSA或HAMSB是否影响NOD小鼠中APC支持体内自身反应性T细胞增殖的能力，将纯化的经CFSE标记NOD8.3 CD8+ T细胞转移到已饲喂HAMS、HAMSA或HAMSB的8至10周龄NOD小鼠中。因此，NOD8.3 CD8+ T细胞的应答应主要涉及膳食对细胞类型(例如APC)而不是直接对响应性NOD8.3 T细胞的作用。在转移之后3至4天，对转移的胰岛特异性NOD8.3CD8+ T细胞的增殖进行分析，并且发现其在饲喂NP膳食的NOD小鼠的PLN中广泛分裂，并且在饲喂HAMS膳食的NOD小鼠的PLN中在较小(但不显著)的程度上分裂(图4g)。引人注目的是，当向NOD小鼠饲喂HAMSA时，自身反应性NOD8.3 CD8+ T细胞无法在PLN中增殖。NOD.8.3T细胞在PLN中的增殖没有由于饲喂HAMSB而降低。T细胞增殖对PLN(在那里胰岛自身抗原排出并且发生APC-T细胞活化)是特异性的，因为NOD.8.3 T细胞不在包括NP在内的任何膳食组的MLN中增殖(图10d)。因此，膳食乙酸影响B细胞数、其表型，并且显示影响其在体内扩增自身反应性T细胞的能力。

丁酸根调节NOD小鼠中淋巴组织中的Treg数目和功能

SCFA调节Treg细胞，尽管已经在肠中证实了作用，但其对其他对T1D发生重要的初级细胞的作用尚不清楚。检查饲喂HAMSA和HAMSB膳食的15周龄雌性NOD小鼠的T细胞区室，并且发现这两种膳食均使结肠中表达肠归巢激活标志物CD103的CD4+FoxP3+ Treg细胞群扩增(图11a)，这与对C57BL/6小鼠所报道的类似。向NOD小鼠饲喂HAMSB导致肝门静脉中丁酸根的水平非常高。与饲喂HAMS的NOD小鼠相比，乙酸根和丁酸根产生膳食均使脾Treg细胞的频率和数目提高2倍(图5a)。在PLN和MLN中，在Treg细胞的绝对数目中观察到频率的适度提高(图11b)。

将来自饲喂不同膳食10周的15周龄雌性NOD小鼠的＞95％纯化脾T细胞转移到缺乏T细胞和B细胞的雌性NOD/SCID小鼠中。NOD/SCID接受者的使用确保了膳食对T细胞的任何作用都可以完全归因于条件化供体T细胞，并且该作用可与乙酸根/丁酸根对肠稳态或其他系统的作用分开检测。来自饲喂NP的NOD小鼠的T细胞在所有接受者中均迅速转移糖尿病，其中在转移之后加速发生(图5b)。形成鲜明对比的是，94％接受来自饲喂HAMSB的NOD小鼠的T细胞的NOD/SCID接受者在转移之后被完全保护免于糖尿病持续20周或更长时间(图5b)。尽管HAMSA对T效应细胞的频率有作用，但来自饲喂HAMSA的NOD小鼠的T细胞无法完全保护(转移之后20周时，30％无糖尿病小鼠)(图3a-d)。

为了确定HAMSB条件化Treg细胞是否介导在NOD/SCID小鼠中观察到的保护作用，将来自NOD.FoxP3-GFP小鼠的总Foxp3-T细胞过继转移。在过继转移之前2周，向接受者NOD/SCID小鼠饲喂不同的膳食，并且使这些小鼠保持饲喂相同的膳食并监测其发病率。在转移之后三周，分析CD4+ T细胞的Foxp3、IL-10和HELIOS的表达。显著地，仅饲喂HAMSB的NOD/SCID小鼠显示出表达Foxp3、IL-10和HELIOS的CD4+ T细胞的显著频率和数目(图5c，d)。

在外周Treg细胞(CD4+CD25-)前体的FOXP3基因座处的组蛋白的乙酰化先前已与增强的Treg功能相关(Thorbum等，2015)。考虑到在饲喂HAMSA和饲喂HAMSB的NOD小鼠中(特别是在肝门静脉中)观察到高浓度的乙酸根和丁酸根(图2a)，检测了高乙酸根或丁酸根产生膳食对FOXP3基因座处组蛋白修饰的影响，特别是在体内外周Treg细胞中。HAMSB膳食(而不是HAMSA)显著提高脾T细胞中Foxp3启动子处的H3K9乙酰化和H4五乙酰化(图5e)。为了检测外周Treg细胞前体中的组蛋白乙酰化是否与Treg细胞中Foxp3表达提高相关，进行了单独经分选CD4+CD45RB低CD25+ T细胞(Treg设门)的单细胞转录物组(transcriptomeanalysis)分析。与饲喂HAMS的NOD小鼠相比，仅HAMSB引起Foxp3转录物表达提高(图5f)。此外，饲喂HAMSB的NOD小鼠中的Treg细胞具有提高的基因转录物表达，这些转录物包括Gata3、Gitr和Sell(CD62L)(图5g)，其对于Treg细胞活化、功能和迁移是重要的。

代谢物感测GPCR GPR43和GPR109a在NOD糖尿病中发挥次要作用

乙酸根和丁酸根的主要代谢物感测GPCR是GPR43，其由包括活化巨噬细胞、B细胞和Treg细胞的多样的免疫细胞类型表达。为了确定乙酸根和丁酸根的免疫调节作用是否通过该GPCR介导，将C57.Gpr43-/-小鼠与NOD背景回交13代(NOD.Gpr43-/-)(图12a)。NOD.Gpr43+/+与NOD.Gpr43-/-小鼠之间的疾病发病率存在趋势(但无显著差异)。到20周时，70％的NOD.Gpr43-/-小鼠发生了糖尿病，类似于相同膳食的NOD.Gpr43+/+同窝小鼠(图6a)。然而，NOD.Gpr43-/-小鼠展现出更多的胰岛炎症(胰岛炎1至4级)并且表现出更少的未浸润胰岛(＜20％)(图6b)。这表明GPR43在保护免于β-细胞胰岛破坏方面只起到次要作用。然而，HAMSA膳食仅部分地延迟了NOD.Gpr43-/-小鼠中的糖尿病进展，并且与饲喂NP的NOD.Gpr43-/-小鼠相比，这些小鼠具有较少的浸润胰岛(图6a，b)。细胞表型分析显示，与NOD.Gpr43+/+同窝小鼠相比，NOD.Gpr43-/-小鼠的脾和PLN中包含显著降低数目的Treg细胞和更高数目的IgM+B220+ B细胞(图6c，d)。在NOD.Gpr43+/+小鼠中，HAMSA提高Treg细胞并且降低自身反应性T细胞，但在NOD.Gpr43-/-同窝小鼠中则不是(图6c-e)。如在15周龄雌性NOD.Gpr43-/-小鼠的粪便中测量的，乙酰化淀粉膳食仍然能够递送大量乙酸根(图12b-d)。CRISPR产生NOD.Gpr109a-/-小鼠系中的发病率显示，80％的NOD.Gpr109a-/-小鼠以与WT NOD小鼠类似的速率进展至糖尿病(图13a)。

乙酸根和丁酸根均校正NOD小鼠中的缺陷肠上皮完整性

人和小鼠的自身免疫性糖尿病与“肠泄漏(gut leakiness)”和紧密连接蛋白闭合蛋白(occluding)的低表达相关。在雌性NOD小鼠中，有证据表明，基于闭合蛋白和其他紧密连接标志物的表达降低(相对于其在C57BL/6(但不是Balb/c小鼠)中的表达)，肠壁形成有效屏障的能力受损(图7a)。相反，具有较低糖尿病发病率的雄性NOD小鼠相对于C57BL/6和Balb/c小鼠具有更高的紧密连接标志物表达(图7a)。与饲喂HAMS的NOD对照相比，饲喂高乙酸根和丁酸根产生膳食显著提高了NOD小鼠的结肠中闭合蛋白的表达(图7b)。与SCFA在保持上皮肠完整性和抑制组织炎症中的作用一致，HAMSA并且特别是HAMSB膳食引起血清脂多糖(LPS)浓度显著降低，类似于C57BL/6小鼠中的那些(图7c)。

提高的循环促炎细胞因子与进展至T1D相关。HAMSA和HAMSB膳食均促进了从促炎至抗炎的细胞因子谱转变(图7d，e)。NOD小鼠中糖尿病发生所需的两种细胞因子TNFα和IL-21的血清浓度在饲喂HAMS的延迟NOD小鼠或饲喂HAMSA和饲喂HAMSB的受保护NOD小鼠中显著降低，类似于在受保护的NOD.MyD88-/-小鼠中观察到的(图7d)。与饲喂HAMS的对照NOD小鼠和饲喂NP的致糖尿病NOD小鼠相比，IL-22(一种维持肠黏膜屏障完整性的肠稳态相关细胞因子)在饲喂HAMSA的NOD小鼠中显著升高(图7e)，并且在饲喂HAMSB的NOD小鼠中在较小程度上升高。

富乙酸根膳食引起肠微生物生态学的有益变化

本研究检测了HAMSA和HAMSB膳食的保护作用是否可完全归因于肠中某些细菌的丰度和/或多样性的变化。通过管饲粪便和盲肠内容物的混合物，使GF NOD小鼠重新定植有来自饲喂NP、HAMS、HAMSA或HAMSB的15周龄NOD小鼠的肠细菌(如图2b所示)。然后，将微生物区系重构的NOD小鼠全部置于相同的NP膳食，并随时间监测糖尿病的发生。与饲喂HAMS的SPF供体小鼠相比，重新定植有HAMS成形微生物区系的GF NOD小鼠没有显示出发病率差异(图8a)。然而，接受通过HAMSA膳食成形的微生物区系的GF NOD小鼠表现出针对糖尿病的显著保护，其中80％的GF雌性NOD小鼠在30周内无糖尿病(图8a)。重新定植有HAMSB成形微生物区系的GF NOD小鼠迅速进展至糖尿病，表明HAMSB膳食通过直接供应丁酸根而不改变肠微生物区系来介导其作用。粪便细菌分析表明，乙酸根和丁酸根产生膳食(与对照HAMS膳食相比)均引起饲喂膳食的15周龄供体NOD小鼠和年龄匹配的重新定植GF NOD小鼠中粪便微生物组成的显著变化(图8b，13b)。尽管饲喂HAMSA和饲喂HAMSB的供体小鼠均显示出提高的拟杆菌属丰度(图8c)，但在GF NOD小鼠的重新定植之后未发现差异(图13c)。拟杆菌属是产生乙酸根/丁酸根的厌氧细菌，并且在人和小鼠中与诱导更高的Treg细胞数相关。单独的HAMSA显著降低了供体和重新定植GF NOD小鼠中乳杆菌属(Lactobacillus)和副拟杆菌属(Parabacteroides)的丰度(图8c，13c)。接受HAMSA成形微生物区系的GF NOD小鼠显示梭菌属(Clostridium)的丰度提高(图13c)。与用HAMS成形微生物区系重构的GF NOD小鼠相比，用HAMSA成形微生物区系重构的GF NOD小鼠在肝门静脉血和盲肠内容物中具有显著更高的乙酸浓度(图8d)。重新定植有HAMSA成形微生物区系的GF NOD小鼠显示PLN中的CD4⁺Foxp3⁺Treg细胞提高(图8e)，支持乙酸在Treg生物学中的作用。因此，HAMSA膳食介导的保护通过整个细菌群落的变化和乙酸根产生细菌的长出而发生。

与饲喂HAMS的NOD小鼠相比，饲喂HAMSA的SPF NOD小鼠显示谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸和异亮氨酸的粪便浓度显著降低(图8f)。谷氨酸是一种关键的细菌代谢物，其主要通过一种已知胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶(GAD)的作用而在代谢过程和应激反应中发挥重要作用。在饲喂HAMSA膳食的15周龄NOD小鼠和重新定植有HAMSA成形微生物区系的受保护GFNOD小鼠中发现谷氨酸降低(图8f)。亮氨酸家族的同种型在饲喂HAMSA的NOD小鼠中提高(图13f)。

讨论

组合的专用乙酰化或丁酰化淀粉膳食显示出针对NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的显著保护。乙酸根和丁酸根的作用仅部分重叠，表明机理不同。乙酸根在降低自身反应性T细胞的频率方面特别有效，而丁酸根对于提高Treg细胞的功能是优异的。这里报道的代谢物方法几乎较正了NOD小鼠中导致疾病的所有缺陷-肠微生物区系组成和肠完整性、炎性细胞因子(例如IL-21和TNFα)、缺陷Treg生物学和自身反应性效应T细胞的丰度。这些发现强调了膳食、肠细菌及其代谢物对免疫应答的深远影响。实际上，许多免疫参数(包括重要免疫亚群(Treg、B细胞和效应T)的频率，以及其基因表达谱)显示可简单地通过膳食/细菌代谢物进行操纵。

HAMSA递送的乙酸根对自身免疫性T效应细胞频率具有显著作用。这可通过乙酸根(以及在较低程度上，丁酸根)对APC(特别是B细胞)的作用来解释。B细胞通过其与特定胰岛抗原反应性T细胞的相互作用而在从胰岛炎至临床糖尿病的转变中发挥重要作用。缺乏足够共刺激分子的B细胞可以是致耐受性的。我们研究的重要特征是，递送大量乙酸根(天然产物)可在整个动物中实现B细胞分子谱的变化。乙酸根(而非丁酸根)有效地改变外周B细胞表型的原因可涉及可递送至外周循环的更高水平的乙酸根，因为丁酸根通常在肝中代谢。然而，乙酸根也可通过不同的途径发挥作用，例如其下调Hdac3转录的能力。饲喂HAMSA的NOD小鼠中B细胞上共刺激分子和MHC I的下调与IGRP+CD8+的低频率(图3a，b)和体内自身反应性NOD8.3细胞的扩增大大降低(图3d)相关。T1D患者中的自身反应性T细胞数可通过简单地递送高乙酸根产生膳食而显著降低。T1D患者的通过四聚体监测所测量的自身反应性T细胞频率降低可快得多地指示代谢物膳食具有期望的效果，而不是为临床结果等待数年。

HAMSB条件化T细胞(包括Treg细胞)在转移至NOD/SCID接受者小鼠之后几乎完全针对T1D提供保护。因此，丁酸根与上述针对乙酸根所述的途径不同，通过Treg相关途径针对T1D提供保护。这可能与关键Treg细胞基因的转录提高以及丁酸根(而不是乙酸根)抑制HDAC的酶活性的能力相关。先前的研究表明，NOD小鼠中的遗传缺陷独特地影响特定Treg细胞亚群在PLN中的定位，使其在抑制活性方面存在缺陷(Buhlmann等，1995)。因此，丁酸根可以已经校正PLN(或外周)Treg细胞的受损抑制功能。HAMSB增强TGFβ的产生，这对Treg细胞的功能很重要。此外，乙酸根和丁酸根可通过抑制血液和组织中的炎性细胞因子和LPS或者控制Treg与Th17分化来间接影响Treg细胞。特别地，IL-21在T1D发生期间至关重要。其在NOD小鼠84-86中诱导B细胞和自身反应性细胞毒性CD8+细胞的增殖，并且负调节Treg细胞分化和活性。

膳食和代谢物对T1D发病机理的影响可与胰腺或PLN与肠的接近度相关。T1D可特别地适合于膳食代谢物方法，因为胰腺和PLN与肠具有直接的淋巴连接，并且可受肝门静脉和可能地腹膜腔中高浓度乙酸根或丁酸根影响。还可想到免疫细胞在高乙酸根或丁酸根环境(即结肠)与PLN、脾和其他地方之间再循环。

将肠微生物区系成形为高SCFA产生的微生物区系可以是预防或治疗人疾病的一种策略。SCFA是共生细菌(特别是拟杆菌属的成员)的主要代谢物之一。此处使用的专用膳食扩增了拟杆菌属物种的数目，并且导致更多数目的Treg细胞。观察到GF重新定植NOD小鼠中梭菌属的比例大大提高，表明这些对于结肠和外周中Treg细胞数的扩增可能是重要的(图8e)。在一项研究中，产生乙酸根的细菌物种(例如青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)或梭菌属簇XIVa或IV物种(其由乙酸根产生丁酸根))的丰度与许多β-细胞自身抗体特异性成反比(de Goffau等，2013)。我们不排除通过HAMSA膳食选择的肠微生物区系促进其他有益代谢物途径的可能性。例如，产生结合芳烃受体(aryl hydrocarbonreceptor，AhR)的色氨酸代谢物的微生物增强肠稳态和Treg生物学(Thorbum等，2014；Zelante等，2013；Li等，2011)。校正生态失调的大多数努力都依赖于益生菌，但是校正不利微生物区系组成的最佳手段可能是通过使用如此处所述的膳食。肠微生物区系对膳食的变化迅速作出响应(David等，2014；Kau等，2011)，并且长期使用某些膳食允许受应激且无竞争性细菌的耗尽且由于适应性突变而出现新的快速生长菌株(Zhu和Ye，2003；Zhu和Yang2003)。

在分子水平，针对糖尿病的保护可能涉及代谢物感测GPCR(例如GPR43)的参与以及HDAC的抑制。这允许通过GPCR的立即信号传导事件，以及基因转录的变化。GPR43促进了高乙酸根产生HAMSA膳食的至少部分保护作用。在NOD.Gpr43-/-小鼠中，包括PLN在内的数种组织中Treg细胞的数目显著降低。GPR43还影响乙酸根膳食限制自身反应性效应T细胞频率的能力。可想到，GPR43与表观遗传机理协同作用。例如，GPR43信号传导可促进乙酸根进入细胞。GPR43的另一个主要作用是增强肠上皮屏障功能。其通过激活上皮细胞中的炎性体(inflammasome)途径和产生促肠稳态细胞因子IL-18来实现这一点。因此，GPR43可能在膳食介导的针对T1D的保护中在数个水平上发挥作用。代谢物影响免疫应答的另一个主要途径是HDAC抑制。体内乙酸根递送显著降低B细胞中的Hdac3转录物表达。这可能会导致类似于选择细胞中HDAC3缺乏或者在化学抑制剂或丁酸根的情况下HDAC酶抑制的表型，先前的研究已表明其具有抗炎作用。在DC中，广泛的HDAC抑制导致CD40、CD80和CD8696的显著下调，类似于我们在此使用乙酸膳食在B细胞中观察到的。我们的研究还表明，HAMSB/丁酸根增强脾Treg细胞中Foxp3基因座的启动子区中的组蛋白H3乙酰化。

实施例2：含有两种或更多种脂肪酸的酰化淀粉的制备(大规模)

方法：

1)在恒定搅拌下在金属容器中用浸入式加热器将DMSO(24L)加热至高于80℃。

2)移出加热器，并通过家用筛向正搅拌的DMSO中缓慢添加玉米淀粉(440g)，以确保均匀分散(以避免结块)。将混合物不断搅拌1小时，此时所有淀粉都已溶解，留下澄清的黏稠溶液。

3)添加1-MID(80mL)，以及选自乙酸酐-85mL、丙酸酐-132mL和丁酸酐170mL中的一 种、两种或三种酸酐。

4)孵育4小时后，通过添加3L水使过量的酸酐分解，并将反应混合物倒入2体积乙醇中。

5)将沉淀的酰化淀粉产物用乙醇(80％v/v)洗涤数次以除去DMSO和其他反应物，并在40℃下在热空气室中干燥。

6)使对照淀粉经历假操作，其中不向淀粉添加1-MID或酸酐。

7)将淀粉研磨成细粉并进行分析。

结果

以上生产的每种酰化淀粉产品的DS是类似的。应当理解，在步骤3中仅使用一种酸酐的情况下，酰化淀粉仅含有1种短链脂肪酸部分。当使用2种酸酐(例如，乙酸和丁酸)时，酰化淀粉将含有乙酸酯和丁酸酯部分二者的混合物。当使用3种酸酐时，酰化淀粉将含有所有三种脂肪酸部分的混合物。

实施例3：富SCFA膳食的制备

通过以上实施例2中详述的大规模操作制备大量(约500g)的酰化淀粉。

制备含有乙酰化和丁酰化淀粉二者的组合膳食，并且其含有以下成分：

·酪蛋白(200g/kg)

·甲硫氨酸(1.5g/kg)

·蔗糖(50g/kg)

·淀粉(251.5g/kg)

·玉米油(100g/kg)

·矿物质混合物(35g/kg)

·维生素混合物(10g/kg)

·酒石酸胆碱(2g/kg)

·纤维素(50g/kg)

·乙酰化淀粉(150g/kg)

·丁酰化淀粉(150g/kg)

上述膳食中酰化淀粉的百分比为30％(15％∶15％，乙酰化∶丁酰化淀粉)。

可制备替代组合膳食，其包含：

可将膳食冷挤压成丸粒，干燥并在使用之前储存在低温下。或者，可将膳食制备成粉末，以包含在如本文中所述的食品中。

应当理解，可使用300g含有乙酸根和丁酸根部分二者的酰化淀粉(而不是150g仅用一种短链脂肪酸酰化的淀粉)来制备类似的膳食。

实施例4：含有乙酰化和丁酰化淀粉的食品

本文中所述的酰化淀粉可以以粉末形式用作多种食品中的补充剂。例如：

A.含有乙酰化和丁酰化淀粉的快速面团(rapid dough)的配方：

·80份面粉

·10份乙酰化淀粉

·10份丁酰化淀粉

·2份脂肪

·2份盐

·1份改进剂(improver)

·2.5份酵母

B.可使用本文中所述的酰化淀粉补充的另一些食品：

上述酰化淀粉的粉末也可添加至一系列热食品，包括意大利面酱(pasta sauce)、意大利烩饭(risotto)、肉汁(gravy)、汤和粥中，或者添加至冷食品，包括牛奶、谷物、巧克力/香草蛋羹(vanilla custard)、布丁和果蔬汁(juice)中。

应当理解，在本说明书中公开和限定的本发明扩展至正文或附图中所提到或者通过正文或附图明显的两个或更多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多个替代方面。

参考文献

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序列表

<110> 莫纳什大学

联邦科学和工业研究组织

<120> 用于治疗和预防自身免疫病的代谢物

<130> 50178139DAS

<150> AU2016903143

<151> 2016-08-10

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims (39)

1.在个体中预防自身免疫病或延迟其发作的方法，所述方法包括在所述个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而预防所述自身免疫病或延迟其发作。

2.权利要求1所述的方法，其中所述个体被确定为处于发生自身免疫病的风险之中。

3.权利要求1所述的方法，其中所述个体被确定为具有与发生自身免疫病的风险相关的自身抗体或炎性标志物。

4.在个体中延迟或防止自身免疫病进展或治疗自身免疫病的方法，所述方法包括在所述个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而治疗或延迟所述进展或治疗所述自身免疫病。

5.在处于自身免疫病风险之中或患有自身免疫病的个体中减轻或治疗炎症的方法，其包括在所述个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而在所述个体中减轻或治疗炎症。

6.权利要求5所述的方法，其中所述方法包括降低所述个体中一种或更多种促炎细胞因子的比例。

7.权利要求5或6所述的方法，其中所述方法包括提高所述个体中一种或更多种抗炎细胞因子的比例。

8.在处于自身免疫病风险之中或患有自身免疫病的个体中预防、降低或治疗自身免疫的方法，其包括在所述个体中提供治疗有效量的两种或更多种短链脂肪酸、其酯或盐的组合，从而在所述个体中预防、降低或治疗自身免疫。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述自身免疫病选自：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化或原发性胆汁性肝硬化。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述自身免疫病是1型糖尿病。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短链脂肪酸选自丁酸和乙酸和丙酸。

12.根据权利要求11所述的方法，其中短链脂肪酸的所述组合是丁酸和乙酸。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中短链脂肪酸的所述组合在所述个体的大肠中提供。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中短链脂肪酸的所述组合通过向所述个体经口施用包含所述短链脂肪酸的膳食剂或药物组合物来在所述个体中提供。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述膳食剂包含与至少一种短链脂肪酸共价键合的载体分子，其中所述共价键对在所述个体的小肠中降解具有抗性但可在结肠中水解以在所述个体的结肠中提供游离脂肪酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述载体是淀粉。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述药物组合物适于将所述短链脂肪酸释放到所述个体的大肠中。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述药物组合物适于将所述短链脂肪酸释放到所述个体的结肠中。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述药物组合物是包含肠溶衣的经口剂型，所述肠溶衣对在胃和小肠中降解具有抗性。

20.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述短链脂肪酸通过向所述个体经直肠施用包含所述短链脂肪酸的药物组合物来在所述个体中提供。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述药物组合物是栓剂。

22.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述短链脂肪酸通过向所述个体中注射包含所述短链脂肪酸的药物组合物来在所述个体中提供。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述药物组合物适于皮下、静脉内或动脉内注射。

24.用于将选自乙酸、丁酸和丙酸的两种或更多种短链脂肪酸递送到个体的大肠中的膳食剂，所述膳食剂包含通过可在个体的结肠中水解以给出游离脂肪酸的键与所述短链脂肪酸共价键合的载体。

25.根据权利要求24所述的膳食剂，其中所述载体是选自淀粉、树胶、寡糖或果胶的碳水化合物。

26.权利要求25所述的膳食剂，其中所述载体是淀粉，并且其中每个淀粉分子与至少一个丁酸和至少一个乙酸分子共价键合。

27.权利要求24至26中任一项所述的膳食剂在治疗自身免疫病中或用于延迟自身免疫病进展的用途，所述自身免疫病选自：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、原发性胆汁性肝硬化和多发性硬化。

28.权利要求24至26中任一项所述的膳食剂用于预防自身免疫病或延迟其发作的用途，所述自身免疫病选自：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、原发性胆汁性肝硬化和多发性硬化。

29.用于在个体中治疗1型糖尿病或用于延迟其进展的膳食，其中所述膳食包含第一和第二膳食剂的组合，所述第一膳食剂包含与丁酸部分共价键合的载体分子，所述第二膳食剂包含与乙酸部分共价键合的载体分子，其中在每种膳食剂中，所述部分通过可在个体的结肠中水解以给出游离丁酸和游离乙酸的键与所述载体键合。

30.用于在个体中预防1型糖尿病或延迟其发作的膳食，其中所述膳食包含第一和第二膳食剂的组合，所述第一膳食剂包含与丁酸部分共价键合的载体分子，所述第二膳食剂包含与乙酸部分共价键合的载体分子，其中在每种膳食剂中，所述部分通过可在个体的结肠中水解以给出游离丁酸和游离乙酸的键与所述载体键合。

31.丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种在制备用于治疗或预防自身免疫病的药物中的用途。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述自身免疫病选自：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化和原发性胆汁性肝硬化。

33.治疗有效量的丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种，其用于治疗或预防选自以下的自身免疫病：1型糖尿病、银屑病、类风湿性关节炎、炎性肠病、乳糜泻、自身免疫性肝炎、心肌炎、狼疮肾炎、多发性硬化和原发性胆汁性肝硬化。

34.用于治疗自身免疫病或用于延迟其进展的药物组合物，其中所述组合物包含丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种、其酯或盐的组合，以及可药用赋形剂，其中所述丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种、其酯或盐是所述组合物中的活性成分。

35.用于预防自身免疫病或延迟其发作的药物组合物，其中所述组合物包含丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种、其酯或盐的组合，以及可药用赋形剂，其中所述丁酸、乙酸和丙酸中的两种或更多种、其酯或盐是所述组合物中的活性成分。

36.根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述药物组合物适于经口施用。

37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含肠溶衣，所述肠溶衣对在胃和小肠中降解具有抗性，从而提供短链脂肪酸向大肠中的释放。

38.根据权利要求34或35所述的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射组合物。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的药物组合物，其包含丁酸和乙酸、其酯或盐。