CN109536400A - 一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂、制备方法及其在焦化废水中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂、制备方法及其在焦化废水中的应用,属于微生物技术领域,克服现有技术中焦化废水COD值高、降解效率差、回收率低等缺陷。解决方案为:首先,制备氧化石墨烯纳米复合材料;其次,制备固定化的生物复合制剂。本发明利用氧化石墨烯纳米复合材料固定柠檬酸杆菌和假单胞菌得到微生物复合制剂,固定化后的微生物对于焦化废水出水COD的去除率更高,去除效果更好。固定化柠檬酸杆菌和假单胞菌能循环利用至少5次,且保持着良好的吸附、解吸效果。本发明制备得到的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,针对焦化废水处理厂二沉池出水进行研究,反应后COD去除率为68%~78%。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,特别涉及一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂、制备方法及其在焦化废水中的应用。
背景技术
众所周知,焦化废水是由复杂的有机污染物构成的,这些有机物性质稳定,其中一些具有致毒和致癌的性质,通常 COD 值很高,因此,焦化废水属于典型的难以治理并且具有毒性的废水。固定化微生物技术处理难去除的有毒有害有机污染物废水,具有处理效率高、无二次污染等优势,因此具有良好的应用和研究前景。
焦化废水的治理一直受到国内外污水处理领域专家的广泛关注,但经过几十年的研究仍未出现突破性的进展。焦化废水成分较复杂,含有酚类、多环芳烃和氧氮硫等杂环有机污染物,属于较难生物降解的有机工业废水。近几十年来,随着大量人工合成化合物不断进入环境中,结构的复杂性使其很难在短时间内被微生物利用,并且难降解有机物是焦化废水的主要成分,因此使用生物强化处理技术可以充分发挥微生物的降解污染物的潜能,从而加强难降解有机物处理效果。现有技术降解效率差,回收率不高等缺陷,本发明提供了一种生物复合制剂。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足,解决焦化废水COD值高的技术问题,克服现有技术中降解效率差、回收率低等缺陷,本发明提供一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂、制备方法及其在焦化废水中的应用。
本发明通过以下技术方案予以实现。
一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,微生物复合制剂包括柠檬酸杆菌和假单胞菌。
进一步地,所述柠檬酸杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏,柠檬酸杆菌的菌种号为CICC21906;所述假单胞菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,假单胞菌的菌种号为CGMCC1.1732。
一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1、制备液体发酵培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、0.03gMnSO4·H20、0.7g氯化钾、1.0gNH4NO3,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
制备固体斜面和平板培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、17.0g~18.0g琼脂,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
S2、制备湿菌体:首先,将保存于-20℃的柠檬酸杆菌和假单胞菌菌株分别取出,在超净工作台上于凝固备用的固体斜面培养基中划线,30℃恒温培养48h;然后,待培养基中长出单菌落,再将活化的菌株挑取白色单菌落转进10mL液体培养基中,30℃恒温环境中以170r/min摇床培养18h;最后,将活化后的柠檬酸杆菌和假单胞菌培养液分装在已灭菌的离心管中,放入离心机中在4℃环境中离心40min,离心机转速为4000r/min,离心后将上清液倒掉,倒置离心管10min,即可获取柠檬杆菌和假单胞菌湿菌体,用无菌水将菌体重悬至0.1g/mL;
S3、制备氧化石墨烯纳米复合材料载体:
①、氧化石墨烯的合成:首先,称取1.0g石墨粉和0.5g 硝酸钠加入到23mL浓度为98%的浓硫酸中,冰浴冷却到0℃~5℃,强烈搅拌混合液的同时将3.0g 高锰酸钾缓慢加入混合液中,控制混合液温度不超过20℃,反应2h;其次,将混合液从冰浴环境中取出后移入水温为35℃的恒温水浴锅中隔水保温12h,然后在混合液中缓慢加入46mL二次蒸馏水,将混合液移到80℃~98℃的恒温油浴锅中保温15min~40min;再次,将混合液用二次蒸馏水稀释到140mL,加入2.5mL浓度为30%的双氧水,将混合液搅拌后过滤,并用二次蒸馏水洗涤3次;最后,将洗净的混合物在70℃环境中真空干燥12h;
②氧化石墨烯水溶液的制备:在蒸馏水中加入10mg氧化石墨粉末,配制成一系列浓度为0.05%wt.~ 0.3%wt.的氧化石墨烯水溶液,超声分散60 min,离心去除水溶液中的大颗粒后备用;
S4、制备固定化微生物复合制剂:
①、向容积为50mL的两口烧瓶中加入20 mL步骤S3配置好的氧化石墨烯溶液,然后向氧化石墨烯溶液中加入0.5%wt.明胶、0.42%~0.84%wt.丙烯酸,于100℃恒温水浴锅中搅拌3小时使其充分溶解混合,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
②、待溶液在无菌条件下冷却后,加入步骤S2中获得的柠檬酸杆菌菌液1mL和假单胞菌菌液1mL,充分混合均匀后,加入过硫酸铵20mg、已二酸双酯2~3mg,搅拌后在氮气保护气氛围中培养30min,再加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺20μL,混合均匀后将溶液快速倒入模具中,室温交联反应12h;
③、取出交联后的小球,用生理盐水冲洗3次后,即得氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,收集备用。
进一步地,所述步骤S2中,无菌水中菌体的数量为6.33×109~1.9×1010个/mL。
进一步地,所述步骤S3中,超声波功率为100 W。
进一步地,所述步骤S3中,离心机转速为3000 rpm。
一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂在降低焦化废水的COD值中的应用。
与现有技术相比本发明的有益效果为:
本发明利用氧化石墨烯纳米复合材料固定柠檬酸杆菌和假单胞菌得到微生物复合制剂,相比于微生物的降解作用,固定化后的微生物对于焦化废水出水COD的去除率更高,去除效果更好。固定化柠檬酸杆菌和假单胞菌能循环利用至少5次,且保持着良好的吸附、解吸效果。
本发明制备得到的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,针对焦化废水处理厂二沉池出水进行研究,反应后COD去除率为68%~78%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例一
一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的生物复合制剂,按照如下步骤制备而得:
S1、制备液体发酵培养基:称取原料:3.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g氯化钠、0.7g氯化钾、0.03gMnSO4·H20、1.0gNH4NO3,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.2,121℃环境中以205.8kPa压力(即2.1kg/cm2)灭菌30min;
制备固体斜面和平板培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、17.0g~18.0g琼脂,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
S2、制备湿菌体:首先,将保存于-20℃的柠檬酸杆菌和假单胞菌菌株分别取出,在超净工作台上于凝固备用的固体斜面培养基中划线,30℃恒温培养48h。然后,待培养基中长出单菌落,再将活化的菌株挑取白色单菌落转进10mL液体培养基中,30℃恒温环境中以170r/min摇床培养18h。最后,将活化后的柠檬酸杆菌和假单胞菌培养液分装在已灭菌的离心管中,放入离心机中在4℃环境中离心40min,离心机转速为4000r/min,离心后将上清液倒掉,倒置离心管10min,即可获取柠檬杆菌和假单胞菌湿菌体,用无菌水将菌体重悬至0.1g/mL(6.33×109~1.9×1010个);
S3、制备氧化石墨烯纳米复合材料载体:
①、氧化石墨烯的合成:首先,称取1.0g石墨粉和0.5g硝酸钠加入到23mL浓度为98%的浓硫酸中,冰浴冷却到0℃,强烈搅拌混合液的同时将3.0g 高锰酸钾缓慢加入混合液中,严格控制加入的速度,使混合液温度不超过20℃,反应2h;其次,将混合液从冰浴环境中取出后移入水温为35℃的恒温水浴锅中隔水保温12h,然后在混合液中缓慢加入46mL二次蒸馏水,将混合液移到98℃的恒温油浴锅中,保持15min;再次,将混合液用二次蒸馏水稀释到140mL,加入2.5mL浓度为30%的双氧水,将混合液搅拌后过滤,并用二次蒸馏水洗涤3次;最后,将洗净的混合物在70℃环境中真空干燥12h;
②氧化石墨烯(GO)水溶液的制备,在20 mL蒸馏水中加入10mg的氧化石墨粉末,配制成浓度为0.05%wt.的GO水溶液,超声(100 W)分散 60 min,离心(3000 rpm)去除水溶液中较大的颗粒后备用;
S4、制备固定化微生物复合制剂:
①、50mL两口烧瓶加入 20 mL 配置好的 GO 溶液,然后加入100mg明胶、84mg丙烯酸,于100℃恒温水浴锅中搅拌3小时使其充分溶解混合,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
②、待溶液在无菌条件下冷却后,加入步骤S2中获得的柠檬酸杆菌菌液1mL和假单胞菌菌液1mL,充分混合均匀后,加入过硫酸铵(APS)20mg、已二酸双酯(BIS)2~3mg,搅拌后在氮气保护气氛围中培养30min,再加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺20μL,混合均匀后将溶液快速倒入模具中,室温交联反应12h;
③、取出交联后的小球,用生理盐水冲洗3次后,即得氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,收集备用,制得的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂中包括柠檬酸杆菌和假单胞菌,所述柠檬酸杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏,柠檬酸杆菌的菌种号为CICC21906;所述假单胞菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,假单胞菌的菌种号为CGMCC1.1732。制得的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂能够应用于降低焦化废水的COD值。
化学需氧量(COD),是指在一定条件下,将 1 升水样中还原性物质全部氧化所需要消耗的氧化剂的量,换算成需要氧的毫克数,以 mg/L 为单位。焦化废水中的具有还原性的物质主要为有机物、硫化物、亚硝酸盐等,而其中最主要的为有机物。因此,通常用 COD来作为衡量废水中有机物含量的多少。COD 越高,说明水体中有机物含量越高,污染越严重。因此,我们用降解前后 COD 的变化量来衡量有机污染物降解的效果。
本次实验中化学需氧量(COD)的测定采用分光光度法。取待测样品 2ml,加入量程为 0-1500ppm 的 COD 试剂管(CHEMetrics 公司)中,摇匀。将试管放入试管加热仪中,150℃加热 120 分钟消解至管中无颗粒物,冷却至室温待测。将消解后的样品利用 COD-1000型便携式 COD 测定仪(上海新仪微波化学科技公司)进行测定,直接可读取 COD 数值。
焦化废水处理厂沉池出水降解前后COD变化,降解前COD为5318.66mg/L,降解后COD降低至1701.97 mg/L,去除率为68%。
实施例二
一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的生物复合制剂,按照如下步骤制备而得:
S1、制备液体发酵培养基:称取原料:3.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g氯化钠、0.7g氯化钾、0.03gMnSO4·H20、1.0gNH4NO3,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
制备固体斜面和平板培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、17.0g~18.0g琼脂,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
S2、制备湿菌体:首先,将保存于-20℃的柠檬酸杆菌和假单胞菌菌株分别取出,在超净工作台上于凝固备用的固体斜面培养基中划线,30℃恒温培养48h。然后,待培养基中长出单菌落,再将活化的菌株挑取白色单菌落转进10mL液体培养基中,30℃恒温环境中以170r/min摇床培养18h;最后,将活化后的柠檬酸杆菌和假单胞菌培养液分装在已灭菌的离心管中,放入离心机4℃离心40min,离心机转速为4000r/min,离心后将上清液倒掉,倒置离心管10min,即可获取柠檬杆菌和假单胞菌湿菌体,用无菌水将菌体重悬至0.1g/mL(6.33×109~1.9×1010个);
S3、制备氧化石墨烯纳米复合材料载体:
①、氧化石墨烯的合成:首先,称取1.0g石墨粉和0.5g 硝酸钠加入到23mL浓度为98%的浓硫酸中,冰浴冷却到0℃,强烈搅拌的同时将3.0g 高锰酸钾加入混合液,严格控制加入的速度,使混合液温度不超过20℃,反应2h;其次,将混合液从冰浴环境中取出后移入水温为35℃的恒温水浴锅中隔水保温30min,然后在混合液中缓慢加入46mL二次蒸馏水,将混合液移到98℃的恒温油浴锅中,保持15min;再次,将混合液用二次蒸馏水稀释到140mL,加入2.5mL浓度为30%的双氧水,将混合液搅拌后过滤,并用二次蒸馏水洗涤3次;最后,将洗净的混合物在70℃环境中真空干燥12h;
②、氧化石墨烯(GO)水溶液的制备,在20 mL蒸馏水中加入60mg的氧化石墨粉末,配制成浓度为 0.3%wt.的GO水溶液,超声(100 W)分散 60 min,离心(3000 rpm)去除水溶液中较大的颗粒后备用;
S4、制备固定化微生物复合制剂:
①、向容积为50mL的两口烧瓶中加入20 mL步骤S3配置好的氧化石墨烯溶液,然后向氧化石墨烯溶液中加入100mg明胶、168mg丙烯酸,于100℃恒温水浴锅中搅拌3小时使其充分溶解混合,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
②、待溶液在无菌条件下冷却后,加入步骤S2中获得的柠檬酸杆菌菌液1mL和假单胞菌菌液1mL,充分混合均匀后,加入20mg过硫酸铵(APS)、3mg已二酸双酯(BIS),搅拌后在氮气保护气氛围中培养30min,再加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)20μL ,混合均匀后将溶液快速倒入模具中,室温交联反应12h;
③、取出交联后的小球,用生理盐水冲洗3次后,即得氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,收集备用。
化学需氧量(COD),是指在一定条件下,将 1 升水样中还原性物质全部氧化所需要消耗的氧化剂的量,换算成需要氧的毫克数,以 mg/L 为单位。焦化废水中的具有还原性的物质主要为有机物、硫化物、亚硝酸盐等,而其中最主要的为有机物。因此,通常用 COD来作为衡量废水中有机物含量的多少。COD 越高,说明水体中有机物含量越高,污染越严重。因此,我们用降解前后 COD 的变化量来衡量有机污染物降解的效果。
本次实验中化学需氧量(COD)的测定采用分光光度法。取待测样品 2ml,加入量程为 0-1500ppm 的 COD 试剂管(CHEMetrics 公司)中,摇匀。将试管放入试管加热仪中,150℃加热 120 分钟消解至管中无颗粒物,冷却至室温待测。将消解后的样品利用 COD-1000型便携式 COD 测定仪(上海新仪微波化学科技公司)进行测定,直接可读取 COD 数值。
焦化废水处理厂二沉池出水降解前后COD变化,降解前COD为5324.86mg/L,降解后COD降低至1171.46 mg/L,去除率为78%。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,其特征在于:微生物复合制剂包括柠檬酸杆菌和假单胞菌。
2.根据权利要求1所述的微生物复合制剂,其特征在于:所述柠檬酸杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏,柠檬酸杆菌的菌种号为CICC21906;所述假单胞菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,假单胞菌的菌种号为CGMCC1.1732。
3.一种如权利要求1所述的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
S1、制备液体发酵培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、0.03gMnSO4·H20、0.7g氯化钾、1.0gNH4NO3,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
制备固体斜面和平板培养基:称取原料:3.0g~5.0g牛肉膏,10.0g蛋白胨,5.0g~10.0g氯化钠、17.0g~18.0g琼脂,将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中,调节混合溶液的pH值为7.0~7.2,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
S2、制备湿菌体:首先,将保存于-20℃的柠檬酸杆菌和假单胞菌菌株分别取出,在超净工作台上于凝固备用的固体斜面培养基中划线,30℃恒温培养48h;然后,待培养基中长出单菌落,再将活化的菌株挑取白色单菌落转进10mL液体培养基中,30℃恒温环境中以170r/min摇床培养18h;最后,将活化后的柠檬酸杆菌和假单胞菌培养液分装在已灭菌的离心管中,放入离心机中在4℃环境中离心40min,离心机转速为4000r/min,离心后将上清液倒掉,倒置离心管10min,即可获取柠檬杆菌和假单胞菌湿菌体,用无菌水将菌体重悬至0.1g/mL;
S3、制备氧化石墨烯纳米复合材料载体:
①、氧化石墨烯的合成:首先,称取1.0g石墨粉和0.5g 硝酸钠加入到23mL浓度为98%的浓硫酸中,冰浴冷却到0℃~5℃,强烈搅拌混合液的同时将3.0g 高锰酸钾缓慢加入混合液中,控制混合液温度不超过20℃,反应2h;其次,将混合液从冰浴环境中取出后移入水温为35℃的恒温水浴锅中隔水保温12h,然后在混合液中缓慢加入46mL二次蒸馏水,将混合液移到80℃~98℃的恒温油浴锅中保温15min~40min;再次,将混合液用二次蒸馏水稀释到140mL,加入2.5mL浓度为30%的双氧水,将混合液搅拌后过滤,并用二次蒸馏水洗涤3次;最后,将洗净的混合物在70℃环境中真空干燥12h;
②氧化石墨烯水溶液的制备:在蒸馏水中加入10mg氧化石墨粉末,配制成一系列浓度为0.05%wt.~ 0.3%wt.的氧化石墨烯水溶液,超声分散60 min,离心去除水溶液中的大颗粒后备用;
S4、制备固定化微生物复合制剂:
①、向容积为50mL的两口烧瓶中加入20 mL步骤S3配置好的氧化石墨烯溶液,然后向氧化石墨烯溶液中加入0.5%wt.明胶、0.42%~0.84%wt.丙烯酸,于100℃恒温水浴锅中搅拌3小时使其充分溶解混合,121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min;
②、待溶液在无菌条件下冷却后,加入步骤S2中获得的柠檬酸杆菌菌液1mL和假单胞菌菌液1mL,充分混合均匀后,加入过硫酸铵20mg、已二酸双酯2~3mg,搅拌后在氮气保护气氛围中培养30min,再加入N,N,N',N'-四甲基二乙胺20μL,混合均匀后将溶液快速倒入模具中,室温交联反应12h;
③、取出交联后的小球,用生理盐水冲洗3次后,即得氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂,收集备用。
4.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S2中,无菌水中菌体的数量为6.33×109~1.9×1010个/mL。
5.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S3中,超声波功率为100 W。
6.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S3中,离心机转速为3000 rpm。
7.一种如权利要求1所述的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂在降低焦化废水的COD值中的应用。
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