CN113151100A - 一种厌氧脱卤菌剂及其放大生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种厌氧脱卤菌剂及其放大生产方法,先接种厌氧消化污泥,利用其中的兼性厌氧菌,消耗容器内及水中残留的氧气,使体系处于严格厌氧条件,为后面接种脱卤菌提供一个适合其生长的生态位,此外,再通过后续的乙酸化过程,还能为后续厌氧脱卤菌脱卤作用提供所需的碳源及电子供体(乙酸盐,氢气等)等。这种方法避免了厌氧手套箱或者厌氧操作平台的复杂过程,更加简单,成本更低,可大规模生产厌氧脱卤菌剂,放大培养的脱卤菌剂能实现四氯乙烯、三氯乙烯和顺式‑二氯乙烯的完全脱卤,并能对PCBs进行脱氯,可根据污染区域的大小对菌剂生产规模进行调整,本发明为实际卤代有机物污染场地修复的菌剂需求提供了切实可行的解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及卤代有机物实际场地修复技术领域,更具体地,涉及一种厌氧脱卤菌剂及其放大生产方法。
背景技术
卤代有机物(Organohalide Compounds)为有机物结构中包含一个或多个与碳原子以共价键形式相连的卤素原子(如:氟、氯及溴等)的一大类有机化合物,包括典型的四氯乙烯(PCE)、三氯乙烯(TCE)、多氯联苯(PCBs)、多溴联苯醚(PBDEs)及二恶英和呋喃(PCDD/Fs)等。三氯乙烯,四氯乙烯常作为脱脂剂,有机溶剂以及化学合成的中间体而被广泛应用在军工及工农业。而多氯联苯及多溴联苯醚等这些卤代有机物由于具有良好的热力学及化学稳定性,作为绝缘材料及阻燃剂等被广泛应用于工农业生产中。这些亲酯疏水的卤代有机物由于不当存储、使用和废弃而被排放进入环境介质(如:空气,土壤和地下水)中,并经饮用水及食物链等进入人体及其他生物体,产生生殖毒性,发育毒性及可能的致癌作用,严重危害人类及其他生物的健康。由于这些卤代有机物难以自然降解,并且具有广泛分布及生物毒性的特点,从2001年起被陆续加入了持久性有机污染物名单(Persistent organicpollutants,POPs),开始实施针对性的管控和治理。在美国环保局公布的优先控制污染物(Priority Pollutants)名单的126种物质中有69种是卤代有机污染物,包括氯甲烷、氯乙烷、氯乙烯、氯苯、氯苯酚等。而在我国2018年颁布的建设用地土壤污染风险管控标准(试行)中,也将氯甲烷、氯乙烷、氯乙烯、氯乙烷、氯苯、氯酚、多氯联苯等卤代有机物列入监管范围。因此,卤代有机物的环境污染问题亟需解决。
微生物还原脱卤是实现卤代有机污染原位修复最具潜力的方法之一。主要因为:(1)卤代有机物主要聚积于土壤、沉积物及地下水等厌氧或兼性厌氧的介质中,刚好满足厌氧脱卤菌的生长要求;(2)相比于传统物理和化学方法,微生物还原脱卤具有成本低,无二次污染,对原生环境干扰小等优点;(3)微生物还原脱卤底物范围广,能实现不同卤代有机污染物的修复;(4)微生物还原脱卤修复已有成功应用案例。有机卤代呼吸细菌(Organohalide-respiring bacteria,OHRB)是在卤代有机物修复中起主要作用的一类微生物。但是由于这类脱卤菌:(1)生长、繁殖速度慢;(2)对氧气要求严格,生长条件苛刻;(3)易被其他自然微生物竞争淘汰掉。导致在实际场地中的脱卤菌丰度和活性往往都很低,无法对有机卤代物进行高效脱卤修复。因此需要对脱卤菌进行高效富集并放大生产,为污染场地的原位修复提供高浓度、高活性的菌剂。
中国专利CN111676147A公开了一种富集和分离四氯乙烯脱氯菌的方法及应用,从四氯乙烯污染物中采集沉积物样品后,在0.5~1mmol/L四氯乙烯为唯一电子受体的DL-乳酸钠厌氧脱氯液体培养基中完全厌氧培养,由于脱卤菌严格厌氧,并且无法自身合成生长所需的碳源及其他辅酶因子,因此在实验室培养方法中往往是采用血清瓶(50~200mL),在厌氧条件下加入配置好的无氧营养盐溶液(液体培养基,包含碳源,电子供体和辅酶因子等),盖上丁基胶塞,保持厌氧环境。这种厌氧脱卤菌培养方法对于希望获得大量的脱卤菌剂以应用于实际场地修复是不实际的。主要是因为:(1)操作复杂;(2)成本较高;(3)单次菌剂产量小;(4)厌氧脱卤菌对环境的厌氧要求很高,很难实现大规模生产。
因此,开发一种厌氧脱卤菌剂高效、低成本的放大生产方法,对于卤代有机污染物的原位修复至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有厌氧脱卤菌剂的生产操作复杂、产量小、厌氧脱卤菌对环境的厌氧要求很高,很难实现大规模生产的缺陷和不足,提供一种厌氧脱卤菌剂的放大生产方法。通过厌氧消化污泥中的兼性厌氧菌先消耗培养体系中的氧气,为后续接种厌氧脱卤菌提供一个适合其生长的生态位,以及所需的碳源及电子供体,然后再接种厌氧脱卤菌进行培养,本发明的方法可以实现厌氧脱卤菌剂的放大生产,操作更为简便高效,成本低,为卤代有机污染物的原位修复提供高浓度的脱卤菌剂。
本发明的又一目的是提供一种厌氧脱卤菌剂。
本发明的另一目的是提供一种厌氧脱卤菌剂的放大生产方法的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种厌氧脱卤菌剂的放大生产方法,将菌剂培养容器在密封条件下先接种厌氧消化污泥,于室温下培养,使体系处于严格厌氧条件,氧化还原电位≦-200mV,通过厌氧产甲烷过程,当甲烷浓度不低于0.2mmol/L时,此时体系达到适合厌氧脱卤菌生长的生态位,加入卤代有机物,再接种厌氧脱卤菌富集物,于室温下培养。
本发明先在体系中接种厌氧消化污泥,利用其中的兼性厌氧菌消耗容器内及水中残留的氧气,使体系处于厌氧条件,为后面接种脱卤菌提供一个适合其生长的生态位,此外,再通过厌氧消化污泥的厌氧发酵及乙酸化过程,可以为后续厌氧脱卤菌脱卤作用提供所需的碳源及电子供体(乙酸盐,氢气等)等。这种两步法(先产甲烷再脱卤)培养厌氧脱卤菌的方法,既可以避免厌氧手套箱或者厌氧操作台的复杂过程,还能节约成本,并且对于一定体积范围内的放大培养都能很好的实现该操作。
优选地,所述厌氧消化污泥占容器体积0.04%~0.4%。
优选地,所述厌氧消化污泥占容器体积0.06%~0.1%。
更优选地,所述厌氧消化污泥占容器体积0.08%。
所述厌氧消化污泥是由活性污泥经兼性菌和厌氧菌进行厌氧生化反应驯化得到。
优选地,所述厌氧脱卤菌富集物占容器体积0.5%~5%。
更优选地,所述厌氧脱卤菌富集物占容器体积1%。
所述脱卤菌富集物是通过前期富集培养工作所得,具体方法可参考中国专利CN111676147A。通过采集城市四氯乙烯污染沉积物样品,取5mL接种至500mL以1mmol/Lol/L四氯乙烯为唯一电子受体的DL-乳酸钠厌氧液体培养基中,厌氧条件下于30℃条件下培养,待四氯乙烯完全脱氯后,保持同等培养条件,进行3次传代至培养液中,所得无沉积物残留的培养液即为厌氧脱卤菌富集物。其主要含有脱卤球菌(Dehalococcoides),丰度超过80%,还有少量的脱卤单胞菌(Dehalogenimonas)和脱卤杆菌(Dehalobacter)等。所述脱卤菌富集物能有效地将PCE完全脱氯形成无毒的乙烯,并且还能实现对多氯联苯的脱卤。
优选地,所述菌剂培养容器中含有水、缓冲剂和碳源。
优选地,所述水体积占容器体积95%~99%。
更优选地,所述水体积占容器体积97%~98.9%。
进一步优选地,所述水体积占容器体积98.82%。
优选地,所述缓冲剂为碳酸氢钠和/或Tris乙磺酸。
更优选地,所述缓冲剂为碳酸氢钠。
优选地,所述缓冲剂的浓度为25~45mmol/L。
更优选地,所述缓冲剂的浓度为28~32mmol/L。
进一步优选地,所述缓冲剂的浓度为30mmol/L。
优选地,所述接种厌氧消化污泥后于室温下培养时间为7~14天。
优选地,所述卤代有机物的浓度为0.25~2mmol/L。
更优选地,所述卤代有机物的浓度为1mmol/Lol/L。
优选地,采用气相色谱监测产甲烷活性。
优选地,所述碳源的COD为100~720mg/L。
更优选地,所述碳源的COD为200~380mg/L。
进一步优选地,所述碳源的COD为360mg/L。
优选地,所述碳源为木薯粉、葡萄糖、乳酸钠、糖蜜、污泥消解上清液中的一种或几种。
优选地,所述碳源为木薯粉和污泥消解上清液。
所述污泥消解上清液是基于实验室前期研究结果的方法制备所得,具体为:将从污水处理厂取回的活性污泥静置3~4小时后,倒掉上清液,并进行离心浓缩,调节总悬浮固体(TSS)为27g/L。加入0.15mol/L NaOH,于烘箱中170℃处理70分钟,待其冷却离心,收集上清液即得。
优选地,所述卤代有机物为四氯乙烯(PCE)、三氯乙烯(TCE)、顺式/反式-二氯乙烯(cis/trans-DCE)、一氯乙烯(VC)中的一种或几种。
更优选地,所述卤代有机物为PCE、TCE、cis-DCE。以上卤代有机物作为电子受体,易于被厌氧脱卤菌利用并能使厌氧脱卤菌的数量得到快速增长。
进一步优选地,所述卤代有机物为TCE。
优选地,所述脱卤菌富集物中含有脱卤球菌、脱卤单胞菌和脱卤杆菌中的一种或几种。
本发明保护上述放大生产方法生产的厌氧脱卤菌剂。
本发明还保护上述放大生产方法在厌氧脱卤菌剂的生产或卤代有机物实际场地修复中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明提供的厌氧脱卤菌剂的放大生产方法,先接种厌氧消化污泥,利用其中的兼性厌氧菌,消耗容器内及水中残留的氧气,使体系处于严格厌氧条件,可以为后面接种脱卤菌提供一个适合其生长的生态位,无需耗费大量的精力和成本去营造一个人工的厌氧环境。此外,通过厌氧发酵及乙酸化过程,还能为后续厌氧脱卤菌脱卤作用提供所需的碳源及电子供体(乙酸盐,氢气等)等,无需额外添加碳源及电子供体,节约成本。这种两步法(先产甲烷再脱卤)培养厌氧脱卤菌既可以避免厌氧手套箱或者厌氧操作台的复杂过程,而且相对于传统厌氧脱卤菌培养操作更加简单,成本更低,可实现厌氧脱卤菌的放大生产,本发明的方法比实验室脱卤菌培养方法效率提高200倍以上,获得同一体积菌剂的成本不到实验厌氧培养的1/400,同时放大培养的脱卤菌剂能实现四氯乙烯、三氯乙烯和顺式-二氯乙烯的完全脱卤,并能对PCB进行脱氯。本发明提供的厌氧脱卤菌剂放大生产方法,能为原位修复受污染的土壤或地下水体快速地提供大量的、高浓度的、高活性的脱卤菌剂,并根据污染区域的大小对菌剂生产规模进行调整,本发明为实际卤代有机物污染场地修复的菌剂需求提供了切实可行的解决方案。
附图说明
图1为实施例1采用20L容量的小口塑料桶培养条件下三氯乙烯还原脱氯动力学。
图2为实施例1培养的富集菌剂群落分布及细胞数量图。
图3为对比例1实验室血清瓶(100mL)厌氧培养条件下三氯乙烯还原脱氯动力学。
图4为实施例2采用20L容量的小口塑料桶培养条件下顺式-二氯乙烯还原脱氯动力学。
图5为实施例2采用20L容量的小口塑料桶培养条件下四氯乙烯还原脱氯动力学。
图6为对比例2在不加厌氧消化污泥条件下三氯乙烯脱氯动力学。
图7为对比例3加入的厌氧消化污泥占容器体积1%条件下三氯乙烯脱氯动力学。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明,本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种厌氧脱卤菌剂的放大生产方法,具体步骤为:选用20L聚乙烯小口塑料桶,装上体积比为98.92%的自来水,依次加入30mM浓度的碳酸氢钠作为pH缓冲剂,360mg/L COD的木薯粉(180mg/L COD)和污泥消解上清液(180mg/LCOD)混合物,体积分数为0.08%厌氧消化污泥,再用封口膜包好,于室温下培养2周。用气相色谱(火焰离子检测器(FID),GasPro分离柱)监测其产甲烷情况,当甲烷浓度不低于0.2mmol/L时,表明体系处于严格厌氧条件,厌氧还原电位≦-200mV,此时加入1mmol/L三氯乙烯作为脱卤菌的电子受体,并按1%接种脱卤菌富集物,于室温下继续培养。
为了在利用脱卤菌剂修复污染场地时不人为引入其他卤代有机物,应待三氯乙烯完全脱氯形成无毒的乙烯,而没有其他中间产物积累后才能将脱卤菌剂投入使用。
本实施例结果如图1所示,在培养37天后,1mmol/L的三氯乙烯完全脱氯形成无毒的乙烯,同时得到了富集的厌氧脱卤菌剂。通过16S rRNA测序及定量聚合酶链式反应(qPCR)分析发现,经过37天培养之后,厌氧脱卤菌的相对丰度达到8.4%,细菌的浓度达到1.36*108细胞/毫升,如图2所示。
实施例2
本实施例的方法同实施例1,区别在于,以卤代有机物顺式-二氯乙烯为单一变量,进行厌氧脱卤菌的培养。结果如图4所示,在经过51天的培养后,顺式-二氯乙烯被完全脱氯形成无毒的乙烯。同样得到了富集的厌氧脱卤菌剂。
实施例3
本实施例的方法同实施例1,区别在于,以卤代有机物四氯乙烯为单一变量,进行厌氧脱卤菌的培养。结果如图5所示,在经过35天的培养后,四氯乙烯被完全脱氯形成无毒的乙烯。同样得到了富集的厌氧脱卤菌剂。
对比实施例1~3三种氯代烯烃作为底物培养脱卤菌结果发现,相同浓度下的四氯乙烯和三氯乙烯较顺式-二氯乙烯能缩短厌氧脱卤菌的培养周期。
对比例1
本对比例为采用实验室血清瓶(100mL),在严格厌氧培养条件,接种脱卤菌富集物。具体步骤为:按照中国专利CN111676147A的方法,在厌氧手套箱中按照液体培养基的配制方法,制备DL-乳酸钠厌氧液体营养盐培养基(培养基主要包含盐、微量元素供体、pH调节剂、缓冲剂、氧指示剂、有机还原剂、维他命、DL-乳酸钠和L-半胱氨酸等),经过高压灭菌之后,加入1mmol/L TCE作为唯一电子受体,再接种1%厌氧脱卤菌富集物,于30℃恒温培养。
图3结果表明,对比例1的方法也需要35天左右才能将相同浓度的三氯乙烯完全脱氯。但是这种实验室条件下获得的厌氧脱卤菌产量小,且对环境的厌氧要求很高,不适合大规模培养。
对比例2
本对比例同实施例1,区别在于,不接种厌氧消化污泥,于室温培养2周,加入1mmol/L三氯乙烯后,直接接种脱卤菌富集物进行培养。结果如图6所示,在不加厌氧消化污泥条件下,厌氧脱卤菌无法实现脱卤作用。
对比例3
本对比例同实施例1,区别在于,加入的厌氧消化污泥占容器体积1%。结果如图7所示,在培养53天后,1mmol/L TCE才被完全脱氯产生乙烯。从实验结果可知,当加入厌氧消化污泥的量过大,可能由于厌氧产甲烷菌会与厌氧脱卤菌竞争碳源和电子供体氢气,从而影响脱卤菌脱卤活性,出现明显的脱卤滞后现象,导致脱卤周期延长。
由以上结果可知,本发明的方法比实验室厌氧脱卤菌培养方法按照单次培养获得菌剂体积计算,效率提高200倍以上(实验室严格厌氧条件为100mL,本发明方法为20L),获得同一体积菌剂的成本不到实验室厌氧培养的1/400,可见本发明的放大生产方法能实现脱卤菌快速、高效、低成本的富集,为实际场地修复应用提供高浓度、高活性的脱卤菌剂。
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种厌氧脱卤菌剂的放大生产方法,其特征在于,将菌剂培养容器在密封条件下先接种厌氧消化污泥,于室温下培养,使体系处于严格厌氧条件。当氧化还原电位≦-200mV,并且通过厌氧产甲烷过程的甲烷浓度不低于0.2mmol/L时,此时体系达到适合厌氧脱卤菌生长的生态位,加入卤代有机物,再接种厌氧脱卤菌富集物,于室温下培养。
2.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述厌氧消化污泥占容器体积0.04%~0.4%。
3.根据权利要求1或2所述放大生产方法,其特征在于,所述厌氧脱卤菌富集物占容器体积0.5%~5%。
4.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述菌剂培养容器中含有水、缓冲剂和碳源。
5.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述卤代有机物的浓度为0.25~2mmol/L。
6.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述碳源的COD为100~720mg/L。
7.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述卤代有机物为四氯乙烯、三氯乙烯、顺式/反式-二氯乙烯、一氯乙烯中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述放大生产方法,其特征在于,所述脱卤菌富集物中含有脱卤球菌、脱卤单胞菌和脱卤杆菌中的一种或几种。
9.权利要求1~8任一项所述放大生产方法生产的厌氧脱卤菌剂。
10.权利要求1~8任一项所述放大生产方法在厌氧脱卤菌剂的生产或卤代有机物实际场地修复中的应用。
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谢冰 等: "《废水生化处理》", 31 March 2020, 上海交通大学出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116904342A (zh) * | 2023-05-17 | 2023-10-20 | 北京博诚立新环境科技股份有限公司 | 一种培养厌氧脱卤菌剂的方法及其在污染修复中的应用 |
CN116904342B (zh) * | 2023-05-17 | 2024-01-26 | 北京博诚立新环境科技股份有限公司 | 一种培养厌氧脱卤菌剂的方法及其在污染修复中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113151100B (zh) | 2023-06-27 |
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