CN108424864B - 一株可降解石油并耐受石油的固氮菌pj12及其应用 - Google Patents

一株可降解石油并耐受石油的固氮菌pj12及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一株可降解石油并耐受石油的固氮菌PJ 12，其保藏编号为：CGMCC No.14659。经固氮酶活性分析表明，本发明所提供的菌株具有较强的固氮酶活性，且在5‑21％氧浓度条件下，均有较高的固氮酶活性。在1％‑5％的石油浓度下，仍可以保持其固氮酶活性。不仅如此，本发明所提供的菌株还具有对长链烷烃的降解能力，所述降解能力可达37‑100％，在未来的石油污染土壤修复中，本发明所提供的菌株在平衡氮素，降解石油污染物方面，具有良好、积极的应用前景。

Description

一株可降解石油并耐受石油的固氮菌PJ12及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一株可降解石油并耐受石油的固氮菌。
背景技术
在生物修复中，微生物发挥了重要作用。在自然进化过程中，微生物经过不同催化机制代谢有机物质，“储存”功能酶做为进化的原始材料，它可以与多种类型的有机成分共存，特别擅长使用自然或合成的有机底物作为碳源和能源，自上世纪40年代起，利用微生物治理石油污染就被认为是一个有力的策略。
生物降解过程中，营养物的添加对激活土著微生物，促进微生物代谢和降解环境中的石油烃有重要作用。然而，过度使用营养物会导致一些潜在的问题，例如过度消耗环境中的氧气，形成厌氧环境，进而降低了土著微生物石油降解能力。好氧生物石油降解经常受到化合态氮水平的限制。2011年Mercer总结了已报道的海滩污染处理中生物处理(生物刺激和降解菌剂添加)的效果，结果发现有10项报道成功，6项报道失败。分析这些失败的案例，推测可能的原因是营养物质，尤其是化合态氮的可利用性。
氮是生物必需的大量元素，研究氮元素的补充机制对了解、促进石油烃污染环境的修复具有重要意义。在自然环境中，一直存在着另一种不容忽视的进程——生物固氮。生物固氮是指固氮生物将大气中的氮气转化为可被生物体利用的氮源过程。固氮作用受到环境中铵、氧浓度的调控，过高浓度的铵及氧通常会抑制其固氮酶活，并与反硝化和各种不同的氮输出途径相结合，从而在生态系统的氮循环和氮平衡中具有极其重要的作用。有关石油污染物降解过程中，固氮微生物的命运，在针对湿地土壤根瘤菌共生固氮体系的研究发现，当石油污染物的浓度从0.5％到20％，导致可利用的N、P的减少，N含量从0.25％降低到0.12％，P浓度从22.66mg/kg降低到13.99mg/kg，固氮菌的存在可以增强原油污染生物治理的能力。研究中发现，尽管固氮生物被油污染所抑制，但有耐受性的一些菌株即便是浓度较低也可以增加石油降解能力。
若能更多地开发可耐受石油，且同时具有降解石油烃能力的固氮菌，对于控制化合态营养元素添加，避免二次污染，激活降解石油微生物活性，将具有重要的理论研究和实践探索的价值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供可降解石油并耐受石油的固氮菌及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一株可降解石油并耐受石油的固氮菌，分类命名为：固氮菌(Azotobacter sp.)，编号PJ 12，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为：2017年9月22日，保藏编号为：CGMCC No.14659。
本发明所提供的菌株PJ 12，采集自辽宁盘锦油田土壤中，利用无氮培养基分离获得，通过16S rRNA基因序列测定，确定其与圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)标准菌株的同源性为99.5％。
所述圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)标准菌株为ATCC 9043＝DSM 2286＝JCM 20725＝JCM 21503(BEIJERINCK(M.W.):
Figure BDA0001619159080000021
oligonitrophileMikroben.Zentralblatt für Bakteriologie,Parasitenkunde,Infektionskrankheitenund Hygiene.Abteilung II,1901,7,561-582.)。
经固氮酶活性分析表明，本发明所提供的菌株具有630.5nmolC2H4/hr.OD600固氮酶活性，所述菌株在5-21％氧浓度条件下，均有较高的固氮酶活性。且在1％-5％的石油浓度下，仍可以保持其固氮酶活性。
石油污染土壤原位接种实验表明，本发明所提供的菌株可提高土壤固氮酶活性达到3倍，通过同位素15N标记实验定性，确定其在石油污染条件下固定氮素的能力。本发明所提供的菌株不但具有耐受石油固氮能力，还具有对长链烷烃的降解能力，所述降解能力可达37-100％，在未来的石油污染土壤修复中，本发明所提供的菌株在平衡氮素，降解石油污染物方面，具有良好、积极的应用前景。
由于本发明所提供的菌株具有上述独特性质且可被广泛应用，本发明进一步保护与所述菌株PJ 12的16Sr RNA基因序列(SEQ ID NO.1)同源性大于99.9％的同种(固氮菌)菌株(简称PJ 12衍生菌)。
基于对本发明所提供的菌株的上述独特性质，本发明进一步提供了所述菌株PJ12或其衍生菌在降解石油中的应用。
所述降解石油具体表现为，所述固氮菌降解石油中C14-C40的长链烷烃，并优选降解石油中C37-C40的长链烷烃。
进一步地，本发明还提供了所述菌株PJ 12或其衍生菌在石油污染环境中进行固氮的应用。
尤其可以是，在氧浓度为0-21％，和/或石油浓度为1％-5％的环境中发挥固氮作用。
所述环境可以是土壤或污水等。
本领域技术人员应当知晓，本发明旨在提供了具有上述特性的菌株PJ 12或其衍生菌，因此，含有该菌株或由该菌株制备的组合物同样属于本发明的保护范围。所述组合物包括但不限于菌剂、菌肥、或其他产品。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一株可降解石油并耐受石油的固氮菌PJ 12，经固氮酶活性分析表明，本发明所提供的菌株具有较强的固氮酶活性，且在5-21％氧浓度条件下，均有较高的固氮酶活性。且在1％-5％的石油浓度下，仍可以保持其固氮酶活性。
本发明所提供的菌株不但具有耐受石油固氮能力，还具有对长链烷烃的降解能力，所述降解能力可达37-100％，在未来的石油污染土壤修复中，本发明所提供的菌株在平衡氮素，降解石油污染物方面，具有良好、积极的应用前景。
附图说明
图1为本发明所述菌株PJ 12在10％O2以氩气做载气条件下固氮酶活性。
图2为本发明所述菌株PJ 12在不同氧浓度条件下，以氩气做载气29h后固氮酶活性。
图3为本发明所述菌株PJ 12在不同石油浓度下固氮酶活性。
图4为本发明所述菌株PJ 12接种盘锦油泥土壤固氮酶活性。
图5为本发明所述菌株PJ 12复配葡萄糖接种盘锦油泥土壤固氮酶活性。
图6为不同石油浓度条件下，本发明所述菌株PJ 12同位素标记15N含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基，包括：
无氮土壤培养基：葡萄糖10g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；FeSO4·7H2O0.05g；CaCl2·2H2O 0.1g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉15g；水1L；pH 7.0。
无氮培养基(无氮土壤改良)：葡萄糖30g；K2HPO4 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；Fe(Ⅲ)-citrate 0.05g；NaMoO4·2H2O 0.001g；琼脂粉15g；水1L；pH 7.0。
K.oxytoca培养基：葡萄糖50g；NaCl 2g；FeSO4·7H2O 0.2g；Fe(Ⅲ)-citrate36mg；NaMoO4·2H2O 7.6mg；NH4Ac 1.54g(20mM)；Na2HPO4·12H2O 9.84g；KH2PO4 1.7g；琼脂粉15g；水1L；pH 7.0。
注：不加NH4Ac便是K·oxytoca无氮培养基。
GMCY培养基(改良的无氮土壤培养基)：葡萄糖10g；K2HPO41.0g；MgSO4·7H2O0.2g；FeSO4·7H2O 0.05g；CaCl2·2H2O 0.1g；NaMoO4·2H2O 0.001g；酵母粉0.5g；水解酪蛋白0.5g；麦芽汁0.5g。
实施例1本发明所述菌株PJ 12的固氮酶活性分析
1、固氮酶测定条件：
1)本发明所述菌株PJ 12(简称PJ 12菌株)在GMCY培养基中30℃活化两次，转接液体培养10hr后，K.oxytoca(无氮)培养基洗涤菌体，调整起始OD600＝0.2左右，接种至5mLK.oxytoca(无氮)培养基厌氧管，30℃，转速200rmp。
2)分别在培养4hr，8hr，12hr，16hr，20hr，24hr，28hr，32hr时，将厌氧管置换为氩气后，调整不同氧浓度后，注入乙炔，反应0.5h后注入三氯乙酸终止反应，然后取100μL气体于气谱(SQ-204型气相色谱，FID检测器，2米填充柱，内装GDX502)测定气体中乙烯含量。
SQ-204型气相色谱测定条件：
载体：N2放大器量程：10-11A/mV柱温：70℃检测器温度：150℃；
样品乙烯量(nmol/hr.OD600)＝(样品乙烯峰面积*样品气体体积mL)/1nmol乙烯气体标准峰面积*0.1*hr*OD600
3)乙烯标准峰面积的标定
根据公式PV＝nRT计算当时的实验条件下1nmol气体的体积，以常温23℃，大气压762mmHg计算，1mol气体的体积为22.21mL，1nmol的气体体积为22.2×10-6mL。将2个装满水的100mL反应瓶盖上胶塞(水中进行，使瓶内无空气)，用气体排出100mL水，使瓶内气体体积为100mL，而后从1号反应瓶中取出2.22mL，从2号反应瓶中抽取1mL气体。从乙烯标准气体袋中取2.22mL气体，注入反应瓶1中，混匀后，取1mL混合气体注入2号反应瓶中，则该100mL气体中含有0.0222mL的乙烯，从中取100μL上气相色谱测定，其峰面积则为1nmol乙烯气体的标准峰面积。
由图1和图2可知，本发明所述菌株PJ 12在诱导28小时后，达到最高固氮酶活，活性为630nmol/hr.OD600，是目前公认固氮酶活性最高的K.oxytoca(模式菌株)活性的50％，但菌株PJ 12的优势在于，可在无氧、5％、10％、15％和21％氧浓度条件下均具有固氮酶活性，表明其可以适应更宽的氧浓度，保留其固氮能力。
2、不同石油浓度下PJ 12菌株的固氮能力分析
1)不同石油浓度液体培养基中PJ 12菌株的固氮能力分析
参照固氮酶测定方法，将PJ 12菌株活化后，分别接种在含有0，1，3，5％石油浓度下的K.oxytoca(无氮)培养基，培养条件30℃，200rmp，培养1，2，3，7天和15天分别测定乙烯含量，确定该固氮菌在不同石油浓度条件下是否保持较高的固氮酶活性，结果见图3。由结果可知，PJ 12菌株在这几个石油浓度条件下均具有固氮酶活性，其中随着时间的延长，含有1％石油的样品中，其固氮酶活性升高幅度高于对照，表明在后期随着速效碳源的消耗，PJ 12菌株可以通过降解石油获得固氮所需要的能量和碳源，从而维持其较高的固氮酶活性。
2)石油污染土壤原位固氮酶活性测定
称取研磨均匀的油泥土壤2.5g，每克干土加入0.14mL的7.5％葡萄糖(诱导固氮酶活性)和0.1mL OD600＝1.0的PJ 12菌株菌液于厌氧管中，以未加入菌液污染土壤为对照。厌氧管内以氮气做载气，注入10％C2H2分别培养1，2，3，9天测定C2H4含量并计算。结果见图4、5。由结果可知，无论是否加入葡萄糖做为固氮诱导底物，接种菌剂后，均可以明显提高石油污染土壤固氮酶活性，表明PJ 12菌株可以在耐受石油污染土壤，并且保持其较高的固氮酶活性，推测其对于土壤氮素的固定有显著的作用。
3)石油污染条件下PJ 12菌株稳定同位素15N标记实验
将活化后的PJ 12菌株和阳性对照菌株K.oxytoca(检测固氮酶活性常用的模式菌株，可通过商业途径购买)活化后，接种到250mL厌氧瓶中，使用改良后的无氮土壤培养基100mL，按要求加入0，1％，3％，5％浓度的石油，同时将厌氧瓶内载气置换为氩气，注入5mL15N2，30℃，200rmp。培养48h后收集菌体，使用无菌dd H2O反复洗涤后，真空干燥，将菌体冻干粉送至深圳市华科精信-清华深圳研究生院同位素实验室检测其固定的15N2。结果见表1和图6。
表1 PJ 12菌株，K.oxytoca 15N同位素标记检测结果
Figure BDA0001619159080000071
Figure BDA0001619159080000081
注：KO代表阳性对照菌株在石油浓度为0条件下的实验组别。
由结果可知，PJ 12菌株确实可以在含有石油条件下进行固氮作用，而且其固定氮素能力比作为阳性对照的菌株K.oxytoca高20倍以上，并且在0，1％，3％，5％不同的石油浓度下均保持的较高的固氮能力，其中含有石油的样品固氮能力更好，表明PJ 12菌株不但可以耐受石油烃，并且可能具有一定的石油降解能力。
4、PJ 12菌株降解石油能力的分析
1)PJ 12菌株液体无氮培养基中的降解能力分析
利用称重法，对PJ 12菌株降解石油能力进行分析。利用无氮土壤液体培养基，培养PJ 12菌株15天后，将摇瓶培养液全部倾入250mL的分液漏斗中，加入适量正己烷，加盖充分振摇2min，期间注意放气，静置分层后，弃下层液体。
用适量正己烷将摇瓶中剩余的石油充分溶解后也倒入分液漏斗中,加盖充分振摇,注意放气，静置，待液体充分分层后，弃去下层液体。
将上层正己烷萃取液利用放有2g无水Na2S04脱脂棉的漏斗过滤，滤液放入事先洗净烘干、恒重、称量后的50mL锥形瓶中。
再用少许正己烷冲洗摇瓶，将液体倒入分液漏斗中，重复前面的操作，直至摇瓶中的石油被抽提干净为止。
将装有抽提液的锥形瓶60℃左右水浴锅中，在通风橱里蒸干正己烷溶剂，干燥器中恒重后称量。
降解率计算式如下:
降解率＝1-(W1-W2)/W0×100％
W0：初始石油质量(g)；
W1：锥形瓶+样品中残油的质量(g)；
W2：锥形瓶的质量(g)；
结果表明PJ 12菌株不但可以在无氮培养基中生长，并且可以降解石油，降解率达到10.38％。
2)PJ 12菌株土壤模拟降解实验
将盘锦油田落地油污染土壤研钵研磨后，过100目筛，去除碎石和杂质，处理后的土样称取20g至锡箔纸容器中，将PJ 12菌株培养至对数期后，收集菌体，调整OD600＝1.0，将250μL菌液稀释至1mL无菌水中，用喷壶均匀接种至土样中，混合后，置于30℃培养箱中，培养期间保持含水量在30％，一个月后，分析降解活性。
总石油烃提取方法如下：
(1)40mL棕色小瓶，水洗1遍，丙酮涮洗3遍(试剂可重复利用如A2可再用于B1)；
(2)准备锥形瓶、玻璃漏斗、玻璃毛。锥形瓶用分析天平称重g1，单位为克。锥形瓶口架设“玻璃漏斗+玻璃毛+无水硫酸钠(2g)”。玻璃毛双层；
(3)取10g土放入棕色小瓶，质量记为m，单位为克；
(4)倒入约30mL二氯甲烷，在室温下超声提取10分钟，再放入离心机在800转/分的条件下离心10分钟，后将上清液倒出，经玻璃漏斗+玻璃毛过滤到锥形瓶。注意：超声提取时瓶盖不要盖紧，超声波能量会使瓶内气体溢出；
(5)重复(4)提取1次，合并提取液(高浓度提取2次，低浓度提取3次)；
(6)将盛放萃取液的锥形瓶放入氮吹仪，氮吹吹干到5mL，后放入通风厨自然通风，挥发至体积不变。(也可以放入通风橱，经一夜风干)；
(7)分析天平称重g2，单位为克；
(8)TPH＝(g2-g1)/m*106，mg/kg；
(9)用50mL正己烷溶解干燥后的样品，混合均匀后分装出1mL至密闭的试剂瓶中，取1μL样品上机测定，使用仪器为气相色谱安捷伦7890，条件为：
柱箱温度：300℃，检测器：320℃，气谱柱：HP5，载气：氮气，助燃为空气和氢气，气压0.5pa；
检测烷烃C1-C40降解活性。
降解活性(％)＝100-(AsX100/Aac)
As＝样品吸收峰面积
Aac＝对照样品吸收峰面积
PJ 12菌株降解石油烃结果见表2，由结果可知，从C14-C40均有不同程度的降解，其中长链烷烃的降解能力较强，对C37-C40的降解活性最高，可以达到80％-100％，表明PJ12菌株在污染土壤中，可以稳定存在，在固定氮素、激活土著微生物和降解石油烃方面都具有重要的作用。
表2 PJ 12菌株的石油污染土壤模拟实验烷烃降解率
Figure BDA0001619159080000101
Figure BDA0001619159080000111
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一株可降解石油并耐受石油的固氮菌PJ 12及其应用
<141> 2018-04-02
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA/RNA
<213> 固氮菌(Azotobacter sp.)
<400> 1
cttatcctcg tggtaccgtc ctcccgaagg ttagactagc tacttctgga gcaacccact 60
cccatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc gacattctga 120
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catggctgga tcaggctttc gcccattgtc caatattccc cactgctgcc tcccgtagga 1140
gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtgac tgatcatcct ctcagaccag ttacggatcg 1200
tcgccttggt gagcctttac cccaccaact agctaatccg acctaggctc atccgatagc 1260
gtgaggtccg aagagccccc actttctccc gtaggacgta tgcggtatta gcgttccttt 1320
cgaaacgttg tcccccacta tcgggcagat tcctaggcat tactcacccg tccgccgctg 1380
aatcgggatg caagcacccc tcatccgctc gactgcatgt gtagctgc 1428

Claims (8)

1.一株可降解石油并耐受石油的固氮菌PJ 12，其特征在于，所述固氮菌PJ 12的分类命名为固氮菌(Azotobacter sp.)，其保藏编号为：CGMCC No.14659。
2.权利要求1所述的固氮菌PJ 12在降解石油中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述固氮菌降解石油中C14-C40的长链烷烃。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述固氮菌降解石油中C37-C40的长链烷烃。
5.权利要求1所述的固氮菌PJ 12在石油污染环境中进行固氮的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述环境中的氧浓度为0-21％。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述环境中的石油浓度为1％-5％。
8.含有权利要求1所述的固氮菌PJ 12的组合物，其特征在于，所述组合物包括但不限于菌剂、菌肥。
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