CN109521205A - Ngal在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物学标识物应用技术领域，特别涉及一种NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用，该生物学标识物NGAL配制成浓度为46.96ng/mL的标准溶液。本发明配制的NGAL标准溶液敏感度为0.957，特异度为0.96，对犬急性肾损伤早期诊断试剂盒的研发具有重要意义。

Description

NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物学标识物应用技术领域，特别涉及一种生物学标识物NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用。

背景技术

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)在急性重症患病动物中是普遍存在的，特征是突然的肾小球滤过率持续下降，患犬的总体死亡率约为50％，且病死率与肾损伤的严重程度密切相关，犬急性肾损伤的预后受诊断时间和治疗方法影响。而影响死亡率的最主要原因之一就是对该病缺乏早期诊断，造成对该病丧失了早期干预治疗的时机。究其原因是对于犬的急性肾损伤缺乏有价值的早期诊断标志物，目前为止宠物临床主要通过血肌酐升高和尿量减少来诊断，最新KDIGO标准提出，在48小时内相对于基线大于或等于0.3mg/dL(26.5μmol/L)的绝对血清肌酸酐(SCr)浓度增加，或在7天时间段内超过50％的血清肌酸酐增加，或超过6小时小于0.5mL/kg/h的尿输出，指示急性肾损伤的诊断。但是，所述标志物不能诊断肾损伤的早期等级，且可能受到其他因素影响。血清尿素氮和血清肌酸酐，只有在肾小管上皮细胞损伤70％～80％时才能提示肾损伤，肾脏往往已发生严重损害，甚至功能衰竭。这表明肾小球的功能下降早已开始，此时采取治疗已经错过了AKI的“治疗机会窗”，而且肾小管上皮细胞的损伤也很难从血肌酐和尿量的检测中得到准确评估。AKI的“治疗干预窗”极为狭窄，且大量临床研究已反复证实未及时治疗的急性肾小管损伤会导致AKI进展为慢性肾脏病。

中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)存在于中性粒细胞过氧化物酶阴性颗粒中，低水平表达于人的肾脏、肺脏、胃和结肠，与炎症，免疫，凋亡等密切相关。NGAL在自身免疫细胞中的表达可抑制药物相关性肾炎的炎症反应，在缺血再灌注损伤中其可上调具有保护作用的IL-10在巨噬细胞中的表达。Sen等研究发现，在烧伤患者AKI发生4h后NGAL明显升高，并且在24h后仍持续升高，而血肌酐水平及尿量在24h内却没有明显变化。Gharishvandi等的研究结果提示高血压患者发生AKI时，相对于血肌酐，血NGAL与肾小球滤过率的相关度更高，NGAL对于AKI早期诊断的敏感性和特异性分别为96％和100％，而血肌酐仅为76％和47％。现有技术中虽然报道了NGAL水平与AKI密切相关，但并未有关于NGAL具体临界值与AKI关系的报道。本发明旨在研究一种生物学标识物NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用。

发明内容

本发明配制的NGAL标准溶液敏感度为0.957，特异度为0.96，对犬急性肾损伤的早期诊断试剂盒的研发具有重要意义。

本发明提供了一种NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用。

优选地，所述生物学标识物NGAL配制成浓度为46.96ng/mL的标准溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明配制的NGAL标准溶液敏感度为0.957，特异度为0.96，对犬急性肾损伤的早期诊断试剂盒的研发具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例2中肌酐无明显升高时HE染色结果图；

图2为本发明实施例2中肌酐升高接近正常上限时HE染色结果图；

图3为本发明实施例2中建立急性肾损伤时HE染色结果图；

图4为本发明实施例2中肌酐无明显升高时TEM观察结果图；

图5为本发明实施例2中肌酐刚升高时TEM观察结果图；

图6为本发明实施例2中建立急性肾损伤时TEM观察结果图；

图7为本发明实施例2中ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合附图1-7对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

一种NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用。

将该生物学标识物NGAL配制成浓度为46.96ng/mL的标准溶液，可用于制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒。

实施例2

为研究上述NGAL的临界浓度，做了如下实验：

(一)实验动物

健康比格犬14只，12-16月龄，雌雄各半，体重5.1±0.2kg，购自黑龙江八一农垦大学实验动物中心，在同一条件下饲养4周进行实验，整个实验过程中饲养管理条件保持一致。

(二)动物实验

1、建立犬急性肾损伤模型

在注射庆大霉素前测得实验犬血浆中NGAL、Kim-1及SCr的浓度作为基线，本实验采用KDIGO标准定义即7d内SCr水平≥基线水平1.5倍为急性肾损伤，实验犬每8h皮下注射20mg/kg庆大霉素诱导肾毒性。在诱导期间每隔6h检测SCr浓度，当实验犬SCr指标高于基线1.5倍时，则急性肾损伤模型建立，停止注射庆大霉素。于第0d至急性肾损伤建立期间，每隔6h采集实验犬头静脉2ml血液，离心，待检，用于生物标志物测量的样品储存在-80℃中待检。

2、标志物含量测定

使用ELISA试剂盒进行批次检测血浆中NGAL、Kim-1浓度，全自动分析仪检测实验犬血肌酐的浓度。其中，NGAL和Kim-1检测ELISA检测遵照试剂盒的说明书进行。步骤如下：

(1)在室温下(18-25℃)将试剂盒内的试剂放置至少30min(平衡)，试剂盒内含有微孔酶标板、标准品、样本稀释液、检测抗体-HRP、20×洗涤缓冲液、底物A、底物B及终止液，按说明书配制各种试剂备用。

(2)设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

(3)样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

(4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

(6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

(7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。结果如表1：

表1给药前后肾损伤血清中标志物的浓度变化

其中，与注射前比较，*代表差异显著，P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。

由表1可知，血液中Kim-1、NGAL浓度随用药时间延长逐渐升高，与肾脏损伤程度有良好的相关性；实验第18h血浆中NGAL浓度，第30h血浆中Kim-1浓度显著高于基线浓度，显著升高时间早于SCr。实验第78h血液中SCr浓度显著高于(实验前)基线浓度，显著升高时间晚于NGAL、Kim-1。

3、苏木素-伊红染色

于肌酐无明显升高(80μmol/L)、肌酐升高到临界正常范围(159μmol/L)、建立急性肾损伤当天每时间点随机摘取1只犬的肾组织病理学样品。取出的一侧肾组织室温固定于10％中性福尔马林72h后，进行脱水、包埋、切片，最后进行苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察组织病理学改变并评价肾脏损伤程度，损伤程度按照0到5分分级评分：没有损伤：0分；损伤面积<10％：1分；10％≤损伤面积<25％：2分；25％≤损伤面积<50％：3分；50％≤损伤面积<75％：4分；大于75％的广泛损伤：5分。分别取肾皮质和肾外髓部20个视野(×200,High Power Field,HPF)，计算20个视野发生损害的平均值，取各视野的肾小管损伤评分值的平均值作为最后评分。结果如表2及图1-3：

表2肾小管损伤评分(n＝2)

由表2及图1-3可知，血肌酐无明显升高时，SCr含量无显著升高，血浆中的NGAL、Kim-1含量显著增加，此时肾脏肾小管上皮细胞轻度水肿及空泡变化等轻度损伤。血肌酐升高接近正常上限时，SCr含量及NGAL、Kim-1含量均显著增加，此时肾脏出现较严重的损伤，皮质肾小管可见明显的扩张，间质增宽。建立急性肾损伤时，SCr含量及NGAL、Kim-1含量均显著增加，此时肾皮质大面积的肾小管变性、坏死，管腔有较多的细胞碎片和颗粒管型，基底膜裸露明显,髓质相对损伤轻，可见细胞肿胀、排列紊乱、核活化、空泡变性及管型。由此可看出，庆大霉素造成的损伤部位主要为肾皮质区，且随用药时间的延长，肾脏损伤程度逐渐加重，而在肾脏轻度损伤时血肌酐含量并无明显增加，但血浆中NGAL、Kim-1含量在肾脏轻度损伤时已经显著增加，且随损伤的严重程度增加而增加。

4、透射电镜(TEM)观察

肾组织取2mm×2mm×2mm大小，立即投入磷酸缓冲2.5％戊二醛固定液中，4℃固定24h，磷酸缓冲漂洗，1％OsO4后固1h，进行脱水、包埋、超薄切片，铅、铀双重染色观察、拍照观察肾超微结构损伤情况。结果如图4-6：

由图4-6可知，肌酐无明显升高时细胞核无固缩，细胞质及线粒体水肿较轻，线粒体嵴尚存，溶酶体数量及体积均较肌酐升高及建立急性肾损伤时程度轻，此时血肌酐虽无明显升高但血浆中的NGAL、Kim-1含量显著增加。肌酐升高到正常值上限时线粒体明显肿胀呈圆泡样，结构模糊，嵴紊乱，断裂缺失，部分呈空泡变性，部分崩解，细胞核结构松散，核染色质稀淡，此时血肌酐及血浆中的NGAL、Kim-1含量均显著增加。建立急性肾损伤时线粒体高度肿胀，细胞核皱缩变形溶酶体数量及体积增多增大，出现大量自噬体，肾小管上皮细胞遭到严重破坏，此时血肌酐无明显升高，但血浆中的NGAL、Kim-1含量显著增加，且与肾小管损伤程度呈正相关。

5、ROC分析

进行ROC分析，得ROC曲线及曲线下面积，结果如表3及图7：

表3NGAL、Kim-1分界值、敏感度和特异度及ROC曲线下面积

由表3可见，NGAL、Kim-1曲线下面积P均<0.05，说明NGAL、Kim-1对于疾病的诊断具有显著的意义。而曲线下面积越大，说明该项检验的诊断效能越大。NGAL对于疾病诊断最有价值，其次是Kim-1。

由图7中曲线的坐标可以求出，NGAL的约登指数最大值＝0.917，对应NGAL＝46.96，可以作为NGAL诊断疾病发生的临界点，当NGAL>46.96ng/mL时，可以诊断为疾病发生，对应的敏感度＝0.957，特异度＝0.96。Kim-1的约登指数最大值＝0.785，对应的Kim-1＝80.95，可以作为Kim-1诊断疾病发生的临界点，当Kim-1>80.95pg/mL时，可以诊断为疾病发生，对应的敏感度＝0.978，特异度＝0.807。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的NGAL在制备犬急性肾损伤早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物学标识物NGAL配制成浓度为46.96ng/mL的标准溶液。