CN1094975C - 芽胞杆菌属蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可从一种新型芽胞杆菌菌株I612中获得的洗涤剂用蛋白酶。而且，本发明涉及所述蛋白酶的制备方法、将该蛋白酶用作洗涤剂用酶的用途、以及含有上述本发明蛋白酶的洗涤组合物。
Description
(一)发明领域
本发明涉及可从芽胞杆菌菌株中获得的洗涤剂用蛋白酶。更具体地讲，本发明涉及一种源于一种芽胞杆菌菌株I612的新型碱性蛋白酶。而且，本发明还涉及一种制备所述蛋白酶的方法、将所述蛋白酶用作洗涤剂用酶的用途、以及含有本发明蛋白酶的洗涤组合物。
(二)背景技术
洗涤剂用酶面市已超过20年时间，而且目前已在世界范围内将其确立为粉状洗涤剂和液体洗涤剂的正常成分。
用于洗涤组合物中的酶包括多种不同的酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、以及其它酶，或这些酶的混合物。最重要的商业用酶是蛋白酶。
洗涤剂用蛋白酶的开发利用是这样进行的：先分离天然存在的蛋白酶，然后在洗涤组合物中进行检验。大多数洗涤剂用蛋白酶是从芽胞杆菌属(Bacillus)的成员中获得的。
商用蛋白酶制品的例子有ALCALASETM、ESPERASETM和SAVINASETM，以上制品均由Novo Nordisk A/S(Denmark)出售。ALCALASETM蛋白酶是由地衣型芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的菌株生产的，ESPERASETM和SAVINASETM蛋白酶是通过培养嗜碱性芽胞杆菌而获得的。
洗涤条件，特别是所采用的洗涤温度、所用水的硬度和洗涤剂的成分在不同国度间的差别很大。典型的条件如下：
-低pH和低水硬度：美国和亚洲的液体洗涤剂；
-低pH和高水硬度：欧洲的液体洗涤剂；
-高pH和低水硬度：美国和亚洲的粉状洗涤剂；和
-高pH和高水硬度：欧洲的粉状洗涤剂。
(洗涤剂的低pH通常在8.0-9.5的范围内，特别是在9左右；洗涤剂的高pH通常在10-11.5的范围内，特别是在10.5左右。低水硬度通常在3-6°dH范围内；高水硬度通常在15-20°dH范围内，特别是在18°dH左右)。
另外，为了使洗涤过程更有利于环境，近年来一直在对洗涤剂配方进行改变。洗涤剂工业的以上差异及变化，使得该领域极为复杂。因此，一直以来都希望找到新型的蛋白酶，这种蛋白酶在某种特定条件下表现良好。
(一)发明内容本发明的一个目的是提供在中洗涤温度至低洗涤温度下具有改善了的洗涤性能的新型洗涤剂用蛋白酶。
因此，在第一方面，本发明提供了一种蛋白酶，其特征为：
-具有相同于或部分相同于源于芽胞杆菌菌株I612，DSM9701的蛋白酶的免疫化学特性。
在第二方面，本发明涉及一种以芽胞杆菌菌株I612为代表的分离的生物学上纯的芽胞杆菌菌株培养物。在一个更具体的方面，本发明涉及一种芽胞杆菌菌株I612，DSM9701或其突变型或突变体。
在第三方面，本发明提供了一种制备所述蛋白酶的方法，该方法包括在含有碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中培养一种产蛋白酶的芽胞杆菌菌株I612，然后回收所需要的酶。在一个更具体的方面，对芽胞杆菌I612，DSM9701或其突变体或突变型、或另一种宿主生物进行培养，所述另一种宿主生物带有编码一种蛋白酶的基因，该蛋白酶具有相同于或部分相同于源于芽胞杆菌I612的蛋白酶的免疫化学特性。
在第四方面，要求了将所述酶用作洗涤剂用酶的用途。在更具体的方面，本发明提供了含有所述蛋白酶的洗涤组合物和洗涤剂添加剂。
在第五方面，本发明提供了包括添加所述蛋白酶的洗涤工艺。
下面将结合附图对本发明作进一步说明，其中，
图1表示温度与一种本发明的酶的蛋白分解活性之间的关系(所述酶制剂按例1方法获得，以1％酪蛋白为底物在pH9.5条件下测定)；
图2表示pH与一种本发明的酶的蛋白分解活性之间的关系(所述酶制剂按例1方法获得，以1％酪蛋白为底物在25℃温度下测得)。微生物
能够产生本发明的酶的本发明的新型微生物以自土壤样品中分离的菌株为代表。已按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，于1995年1月30将芽胞杆菌I612保存于DSM(德国微生物和细胞培养物GmbH保藏所)，入藏编号为DSM9701。
本发明的微生物是属于芽胞杆菌属的需氧产孢子细菌。在形态学上可将其描述为游动杆菌，其直径为0.8-1.0μm，长2-5μm。其孢子为筒形至椭圆形，孢子囊的中部至近端不膨大。其生长的最适温度为25-35℃，生长的最适pH值为7-9.5，pH10时生长很弱。微生物的培养
可以在好气条件下，在含有可同化的碳、氮以及其它必需养分的营养培养基中培养本发明的微生物，该培养基是按照现有技术的原理配制养而成。
合适的碳源为诸如蔗糖、葡萄糖和淀粉之类的糖类，或诸如谷粒、麦芽、大米和高梁之类的含有糖类的材料。加入培养基中的糖类的浓度可以在很大范围内波动，例如，可以高达25％，也可以低至1-5％，但通常以8-10％为宜，以上百分比是以葡萄糖的当量计算的。
所述营养培养基中的氮源可以是无机和/或有机性质的，合适的无机氮源为硝酸盐和铵盐。有机氮源为众多常用于涉及细菌培养的发酵工艺的材料。其例子为大豆粉、棉子粉、花生粉、酪蛋白、玉米、玉米浸液、酵母提取物、尿素和白蛋白。另外，所述营养培养基还应含有常用的微量物质。
适于本发明新型芽胞杆菌生长的最适pH是中性的。因此，其培养优选在pH7-9的条件下进行。为了在罐式发酵器中培养，必需采用人工通气法，通气速度类似于常规罐式发酵所采用的通气速度。
发酵之后，可以通过从培养液中除去粗材料制成液体酶浓缩物，或者，如果必要的话，可以采用例如低温蒸发或反向渗透方法浓缩培养液。最后，可以向浓缩物中加入防腐剂。
可以通过用诸如Na2SO4之类的盐或诸如乙醇或丙酮之类的可水混的溶剂进行沉淀，从纯化的和/或浓缩的培养液中制备固体酶制剂。也可以用诸如喷雾干燥之类的适当干燥方法除去培养液中的水分。
检验蛋白分解活性
以酪蛋白为底物测定蛋白分解活性。1酪蛋白蛋白酶单位(CPU)的定义为：在标准条件下(即：在25℃和pH9.5下培养30分钟)，每分钟释放出1mM伯氨基所需要的酶量(通过与丝氨酸标准相比较而测定)。一份编号为AF228的资料披露了该分析方法，该资料可以向Novo Nordisk A/S(Denmark)索取，该资料被收作本文的参考。
酶
本发明的酶是一种新型的洗涤剂用蛋白酶。它可以通过在含有碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中培养本发明的微生物，特别是芽胞杆菌I612，DSM9701或其突变或突变型而获得。也可以通过重组DNA技术获得这种酶。
本发明的蛋白酶以下述物理-化学特性为特征。
物理-化学特性
通过SDS-PAGE测得其分子量为31kD。通过在LKBAmpholinePAG板上进行等电点聚焦测得其pI值约为8.0。该蛋白酶的活性受PMSF、α-1-抗胰蛋白酶和EDTA的抑制。大豆蛋白抑制剂对该蛋白酶的活性没有影响。
发现本发明的蛋白酶既能被PMSF抑制，也能被EDTA抑制，这是十分惊人的；能被PMSF抑制这一事实表明，该蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，但普通丝氨酸蛋白酶是耐EDTA的，而且，极不寻常的是，本发明的蛋白酶能被EDTA抑制，同时，正如在例2中所证实的，它又是一种极好的洗涤用品。
温度与活性的关系是以1％的酪蛋白为底物在pH9.5下测得的。采用上述检验蛋白分解活性的方法，并对该方法加以改进，将培养温度设在10-70℃范围内。
结果如图1所示。从图1中可以看出，在10℃以下至约40℃的温度范围内本发明的蛋白酶都具有蛋白分解活性，最佳温度在30℃左右。从图1中可以看出，在40℃下该蛋白酶的活性不到20％。
活性对pH的依赖性用同样的方法测定，所采用的缓冲液被调整至pH值在6-11的范围内。
结果如图2所示。从图2中可以看出，在pH6以下至pH10左右的范围内本发明的蛋白酶都具有蛋白分解活性，最佳pH值在7-9.5的范围内。
本发明蛋白酶在中等离子强度、中等pH和中等至低洗涤温度下的洗涤剂中特别有效。免疫化学特性
本发明蛋白酶具有相同于或部分相同于(即至少部分相同于)源于芽胞杆菌菌株I612，DSM9701的蛋白酶的免疫化学特性。
对于不同芽胞杆菌属蛋白酶来说，免疫化学特性实际上是一种差异很大的特征：尽管上述最佳pH值、最佳温度、pI等大体相同，但不同的免疫化学特性会使不同洗涤剂的稳定性相差极大。
免疫化学特性可以通过交叉反应鉴定试验进行免疫学测定。所述鉴定试验可以用众所周知的Ouchterlony双免疫扩散方法或用N.H.Axelsen披露的串联交叉免疫电泳(Handbook of Immunoprecipitation-in-GelTechniques；Blackwell Scientific Publications(1983)，第5和14章进行。在同一本书的第5、19和20章中，对“抗原识别”和“部分抗原识别”进行了说明。
按照上述方法，用纯化的本发明蛋白酶对兔子进行免疫，以产生单特异性抗血清。将免疫原同Freund’s佐剂混合，每隔一周皮下注射至兔子体内。在经过为期8周的免疫后，得到抗血清，并用N.H.Axelsen(同上)所述方法从抗血清中制备免疫球蛋白。
采用上述Ouchterlony双免疫扩散试验，证实本发明的蛋白酶与已知的丝氨酸蛋白酶无交叉反应，所述已知蛋白酶如下：
-ALCALASETM(由Novo Nordisk A/S出售)
-SAVINASETM(由Novo Nordisk A/S出售)
-ESPERASETM(由Novo Nordisk A/S出售)
-枯草蛋白酶Novo(由Novo Nordisk A/S出售)
-KAZUSASETM(由SHOWA DENKO出售)，
-披露于WO92/07067中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO92/17576中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO92/17577中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO92/17578中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO93/18140中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO93/24623中的芽胞杆菌属蛋白酶，
-披露于WO94/01532中的芽胞杆菌属蛋白酶，和
-披露于WO95/07350中的芽胞杆菌属蛋白酶，
不同芽胞杆菌属蛋白酶对不同洗涤剂的耐受力有很大差异，现有的用于区别不同芽胞杆菌属蛋白酶的最佳方法是免疫化学识别方法。洗涤组合物
根据本发明，所述蛋白酶通常可以是洗涤组合物，如洗碟用或洗衣用洗涤组合物的一种成分。因此，所述蛋白酶可以无尘颗粒、稳定化的液体或被保护的酶的形式含于洗涤组合物中。可以用诸如在US4,106,991和4,661,452(均为Novo Industri A/S所拥有)中所披露的方法生产无尘颗粒，并可以用本领域公知方法选择性地进行包衣。蜡质包衣材料的例子有平均分子量为1000-20000的聚环氧乙烷制品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中的醇含有12-20个碳原子，而且，其中含有15-80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、双-和三甘油酯。在专利GBl483591中披露了适用于流化床技术的成膜包衣材料的例子。举例来说，可以按照已确立的方法通过加入诸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。其它的酶稳定剂为本领域所熟知。可以用披露于EP238,216中的方法制备被保护的酶。
本发明的洗涤组合物可以为任何常见形式，例如，粉状、颗粒状、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有高达70％的水分和0-30％的有机溶剂，或是无水的。
所述洗涤组合物含有一种或几种表面活性剂，每种表面活性剂可以是阴离子型的、非离子型的、阳离子型的或两性离子型的。所述洗涤剂通常含有0-50％的阴离子型表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐(LAS)、α-烯属磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)(AS)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(AEOS或AES)、仲链烷磺酸盐(SAS)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。所述洗涤剂还可以含有0-40％的非离子型表面活性剂，如脂肪醇乙氧基化物(AEO或AE)、羧基化脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖苷、氧化烷基二甲胺、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺或多羟基烷基脂肪酸酰胺(例如在WO92/06154中所披露的)。
所述洗涤组合物还可另外含有一种或几种其它的酶，如淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、过氧化物酶、和氧化酶，如漆酶。
所述洗涤剂可以含有1-65％的洗涤助剂或配位剂、如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸，可溶性硅酸盐或层状硅酸盐(例如SKS-6，购自Hoechst)。所述洗涤剂也可以是未复配的，即基本上无洗涤助剂。
所述洗涤剂中可以含有一种或几种聚合物。其例子有羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、诸如聚丙烯酸酯的聚羧酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和十二烷基异丁烯酸/丙烯酸共聚物。
所述洗涤剂可以含有一种洗白系统，该系统可包括一种诸如过硼酸盐或过碳酸盐的H2O2源，该H2O2源可以与一种诸如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)的成过酸漂白激活剂混合。另外，所述漂白系统还可以含有诸如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。
可以用常用的稳定剂对本发明洗涤组合物的酶进行稳定，例如，诸如丙二醇或甘油之类的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物，如芳族硼酸酯，而且，该组合物可以用披露于WO92/19709和WO92/19708中的方法进行配制。
所述洗涤剂还可以含有其它常见洗涤剂成分，如织物调理剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。
pH值(在使用浓度下在水溶液中测得)一般为中性或碱性，例如在7-11范围内。
本发明范围以内的洗涤组合物的具体形式包括：
1)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 7-12％ |
| 脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C12-18脂肪醇，1-2EO)或烷基硫酸盐(例如C16-C18) | 1-4％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C14-15脂肪醇，7EO) | 5-9％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 14-20％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 2-6％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 15-22％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 0-6％ |
| 柠檬酸钠/柠檬酸(为C6H5Na3O7/C6H8O7) | 0-15％ |
| 过硼酸钠(为NaBO3.H2O) | 11-18％ |
| TAED | 2-6％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 0-3％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂、光漂白剂) | 0-5％ |
2)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 6-11％ |
| 脂肪醇乙氧基硫酸盐(如C12-18脂肪醇，1-2EO或烷基硫酸盐(例如C16-18) | 1-3％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C14-15脂肪醇，7EO) | 5-9％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 15-21％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 24-34％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 4-10％ |
| 柠檬酸钠/柠檬酸(为C6H5Na3O7/C6H8O7) | 0-15％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 1-6％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，抑泡剂、香料) | 0-5％ |
3)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 5-9％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO) | 7-14％ |
| 诸如脂肪酸的皂(例如，C16-22脂肪酸) | 1-3％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 10-17％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 3-9％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 23-33％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 0-4％ |
| 过硼酸钠(为NaBO3.H2O) | 8-16％ |
| TAED | 2-8％ |
| 膦酸盐(如EDTMPA) | 0-1％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 0-3％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
4)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 8-12％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO) | 10-25％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 14-22％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 1-5％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 25-35％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 0-10％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) | 1-3％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，抑泡剂、香料) | 0-5％ |
5)含水液体洗涤组合物，其含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-21％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO，或C12-15脂肪醇，5EO) | 12-18％ |
| 诸如脂肪酸的皂(例如，油酸) | 3-13％ |
| 烯基琥珀酸(C12-14) | 0-13％ |
| 氨基乙醇 | 8-18％ |
| 柠檬酸 | 2-8％ |
| 膦酸盐 | 0-3％ |
| 聚合物(如，PVP，PEG) | 0-3％ |
| 硼酸盐(为B4O7) | 0-2％ |
| 乙醇 | 0-3％ |
| 丙二醇 | 8-14％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
6)水结构的液体洗涤组合物，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-21％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO，或C12-15脂肪醇，5EO) | 3-9％ |
| 诸如脂肪酸的皂(例如，油酸) | 3-10％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 14-22％ |
| 柠檬酸钾 | 9-18％ |
| 硼酸盐(为B4O7) | 0-2％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如PEG，PVP) | 0-3％ |
| 锚定聚合物，如异丁烯酸十二烷基酯/丙烯酸共聚物；摩尔比为25∶1；MW3800 | 0-3％ |
| 甘油 | 0-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，分散剂、抑泡剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
7)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 脂肪醇硫酸盐 | 5-10％ |
| 乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 | 3-9％ |
| 诸如脂肪酸的皂 | 0-3％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 5-10％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 20-40％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 2-8％ |
| 过硼酸钠(为NaBO3.H2O) | 12-18％ |
| TAED | 2-7％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成分(例如，荧光增白剂、抑泡剂、香料) | 0-5％ |
8)制成颗粒状的洗涤组合物，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 8-14％ |
| 乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺 | 5-11％ |
| 诸如脂肪酸的皂 | 0-3％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 4-10％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 1-4％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 30-50％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 3-11％ |
| 柠檬酸钠(为C6H5Na3O7) | 5-12％ |
| 聚合物(例如，PVP，马来酸/丙烯酸共聚物，PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，抑泡剂、香料) | 0-5％ |
9)制成颗粒状的洗涤组合物，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 6-12％ |
| 非离子型表面活性剂 | 1-4％ |
| 诸如脂肪酸的皂 | 2-6％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 14-22％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 18-32％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 5-20％ |
| 柠檬酸钠(为C6H5Na3O7) | 3-8％ |
| 过硼酸钠(为NaBO3.H2O) | 4-9％ |
| 漂白激活剂(例如，NOBS或TAED) | 1-5％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-2％ |
| 聚合物(例如，聚羧酸酯或PEG) | 1-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如荧光增白剂、香料) | 0-5％ |
10)含水液体洗涤组合物，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 15-23％ |
| 脂肪醇乙氧基硫酸盐(例如C12-15脂肪醇，2-3EO) | 8-15％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO或C12-15脂肪醇，5EO) | 3-9％ |
| 诸如脂肪酸的皂(例如，月桂酸) | 0-3％ |
| 氨基乙醇 | 1-5％ |
| 柠檬酸钠 | 5-10％ |
| 水溶助长剂(如甲苯磺酸钠) | 2-6％ |
| 硼酸盐(为B4O7) | 0-2％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-1％ |
| 乙醇 | 1-3％ |
| 丙二醇 | 2-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，聚合物、分散剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
11)含水的液体洗涤组合物，其中含有
| 直链烷基苯磺酸盐(以酸计) | 20-32％ |
| 脂肪醇乙氧基化物(例如，C12-15脂肪醇，7EO或C12-15脂肪醇，5EO) | 6-12％ |
| 氨基乙醇 | 2-6％ |
| 柠檬酸 | 8-14％ |
| 硼酸盐(为B4O7) | 1-3％ |
| 聚合物(例如，马来酸/丙烯酸共聚物，锚定聚合物，如异丁烯酸十二烷基酯/丙烯酸共聚物) | 0-3％ |
| 甘油 | 3-8％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，水溶助长剂、分散剂、香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
12)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| 阴离子型表面活性剂(直链烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、α-烯属磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、链烷磺酸盐、皂) | 25-40％ |
| 非离子型表面活性剂(例如，脂肪醇乙氧基化物) | 1-10％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 8-25％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 5-15％ |
| 硫酸钠(为Na2SO4) | 0-5％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 15-28％ |
| 过硼酸钠(为NaBO3.4H2O) | 0-20％ |
| 漂白激活剂(TAED或NOBS) | 0-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，香料、荧光增白剂) | 0-5％ |
13)如1)-12)所述的洗涤组合物，其中，全部或部分直链烷基苯磺酸盐被(C12-C18)烷基硫酸盐所取代。
14)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| (C12-C18)烷基硫酸盐 | 9-15％ |
| 脂肪醇乙氧基化物 | 3-6％ |
| 多羟基烷基脂肪酸酰胺 | 1-5％ |
| 沸石(为NaAlSiO4) | 10-20％ |
| 层状二硅酸盐(例如，SK56，购自Hoechst) | 10-20％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 3-12％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 0-6％ |
| 柠檬酸钠 | 4-8％ |
| 过碳酸钠 | 13-22％ |
| TAED | 3-8％ |
| 聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP) | 0-5％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，荧光增白剂，光漂白剂，香料、抑泡剂) | 0-5％ |
15)制成颗粒状的洗涤组合物，其堆积密度至少为600g/l，其中含有
| (C12-C18)烷基硫酸盐 | 4-8％ |
| 脂肪醇乙氧基化物 | 11-15％ |
| 皂 | 1-4％ |
| 沸石MAP或沸石A | 35-45％ |
| 碳酸钠(为Na2CO3) | 2-8％ |
| 可溶性硅酸盐(为Na2O，2SiO2) | 0-4％ |
| 过碳酸钠 | 13-22％ |
| TAED | 1-8％ |
| 羧甲基纤维素 | 0-3％ |
| 聚合物(例如，聚羧酸酯和PVP) | 0-3％ |
| 酶(以纯酶蛋白计) | 0.0001-0.1％ |
| 微量成份(例如，荧光增白剂、膦酸盐、香料) | 0-3％ |
16)如1)-15)的洗涤组合物，其含有一种稳定化的或包封的过酸，或作为另一种成分，或用于取代上述漂白系统。
17)如1)、3)、7)、9)和12)的洗涤组合物，其中，过硼酸盐被过碳酸盐所取代。
18)如1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的洗涤组合物，其另外含有一种锰催化剂。例如，该锰催化剂可以是在“Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching”(Nature369，1994，PP.637-639)中所披露的化合物之一。
19)制成无水洗涤液体的洗涤组合物，它含有诸如直链烷氧基化伯醇的液体非离子型表面活性剂、助洗剂系统(例如磷酸盐)、酶和碱。该洗涤剂还可以含有阴离子型表面活性剂和/或漂白系统。
本发明的蛋白酶可以洗涤剂中的常用浓度加入。在本发明的洗涤组合物中，所述蛋白酶可以相当于每升洗涤液0.00001-1mg(以纯酶蛋白计)蛋白酶的量加入。(四)实施方式
以下的实施例将对本发明作进一步说明，从任何意义上讲，这些实施例的用意都不在于像权利要求书那样限定本发明的范围。例1
在30℃下，在旋转摇床(300r.p.m)上，于含有100ml培养基的体积为500ml的折流锥形烧瓶中培养芽胞杆菌菌株I612，DSM9701，培养基的配方如下(每升中含量)：
马铃薯淀粉 100 g
磨碎的大麦 50 g
大豆粉 20 g
Na2HPO4×12H2 9 g
Pluronic 0.1 g
酪蛋白酸钠 10 g
上述培养基中的淀粉是用α-淀粉酶液化过的，而培养基通过在120℃下加热45分钟进行灭菌。
灭菌以后，通过加入10ml 1M的碳酸氢钠溶液将pH调至9.0。
培养(3天)以后，以及在分离固体材料以后，用常规层析方法纯化蛋白酶。
从2.5l培养液中得50ml蛋白酶溶液，浓度为45CPU/l。通过SDS-PAGE判断其纯度大于90％。
有关按该实施例制备的酶制剂的特征在本说明书的前文部分已做过说明，现参见前述内容即可。例2芽胞杆菌I612蛋白酶的洗涤性能(在25℃下)
洗涤性能试验是用被草汗污染的棉布在一个模拟洗涤系统中在25℃的恒温下洗涤10分钟而进行的。
试验是分别在1、2、7.5、20和50nM的蛋白酶浓度下进行的。
试验中使用了2.0g/l美国型粉状洗涤组合物。在加入本发明的蛋白酶之前，所述洗涤剂不含任何酶。将洗涤剂溶于约6°dH(德国硬度)的水中。洗涤液的pH值为10。织物/洗涤液之比为大约每升洗涤液5g织物。每种酶浓度进行两个独立的试验。
在对织物进行洗涤之后，将所述棉布用自来水冲洗20分钟，然后风干。通过在一台Datacolor Elrephometer2000上在460nm波长下测得的减退值(％R)的变化(ΔR)，检验本发明蛋白酶和SavinaseTM的性能，ΔR为加蛋白酶洗涤以后的减退值减去不加蛋白酶洗涤后的减退值。
以上结果示于下面的表1中(2个试验的平均值)
表1
| 蛋白酶浓度(nM) | ΔRI612 SAVINASETM |
| 127.52050 | 1.9 1.74.2 2.49.1 5.514.4 11.117.8 14.3 |
从表1中可以看出，在所有试验过的蛋白酶浓度下，芽胞杆菌I612的ΔR均高于SavinaseTM的ΔR，即本发明的蛋白酶在25℃下，在所有试验过的浓度下均具有较好的洗涤性能。
例3
芽胞杆菌I612蛋白酶的洗涤性能(在15℃下)
洗涤性能试验是用被草汁污染的棉布在一个模拟洗涤系统中在15℃的恒温下洗涤10分钟而进行的。
试验是分别在2、7.5、20和50nM的蛋白酶浓度下进行。
试验中使用2.0g/l具有以下配方的洗涤剂：
直链烷基苯磺酸盐 0.3 g/l
脂肪醇乙氧基化物 0.04 g/l
皂 0.1 g/l
Na2SO4 0.3 g/l
Na2CO3 0.4 g/l
沸石 0.6 g/l
柠檬酸钠 0.08 g/l
羧甲基纤维素 0.006 g/l
聚羧酸酯 0.083 g/l
将该洗涤剂溶于大约6°dH(德国硬度)的水中。将洗涤液的pH调至10。织物/洗涤液之比大约为每升洗涤液5g织物。每种酶浓度进行两个独立的试验。
在对织物进行洗涤之后，用自来水将所述棉布冲洗20分钟，然后风干。通过在一台Datacolor Elrephometer 2000上在460nm波长下测得的减退值(％R)的变化(ΔR)，检验本发明蛋白酶和SavinaseTM的性能，ΔR为加蛋白酶洗涤以后的减退值减去不加蛋白酶洗涤以后的减退值。
上述试验的结果如下面的表2所示(2个试验的平均值)。
表2
| 蛋白酶浓度(nM) | ΔRI612 SAVINASETM |
| 27.52050 | 2.5 2.36.6 3.910.5 7.914.5 11.8 |
从表2中可以看出，在所有试验过的蛋白酶浓度下，芽胞杆菌I612的ΔR均高于SavinaseTM的ΔR，即：在15℃下，本发明蛋白酶在所有试验过的浓度下均具有较好的洗涤性能。
与保藏微生物有关的说明
(PCT细则13bis)
| A.下面所作说明涉及本说明书第2页第10-11行提到的微生物。 | |
| B.保藏物的表示 其他保藏物表示在附页口 | |
| 保藏机构名称德国微生物和细胞培养物保藏所 | |
| 保藏机构地址(包括邮政编码和国家)德意志联邦共和国，不伦瑞克，Mascheroder街1b号，D-38124 | |
| 保藏日期1995年1月30日 | 入藏登记号DSM 9701 |
| C.其他说明(如果不适用的话，留出空白) 该信息在副页上继续口 | |
| 在规定这样的“专家解决方案”的那些指定国，专利申请的审理过程中，保藏微生物的样品仅提供给由索取该样品的人指定的独立的专家(参见，例如欧洲专利公约细则28(4)/澳大利亚法规1991 No 71的实施细则3.25)。 | |
| D.对其进行说明的指定国(如果该项说明不是对所有的指定国) | |
| E.单独提交的说明(如果不适用的话，留出空白) | |
| 下列说明以后将提交给国际局(定义说明的一般性质，例如，“保藏物的入藏登记号”) | |
| 仅供国际局使用口该页由国际局于下列日期收到： |
| 授权的官员 |
PCT/RO/134表(1992年7月)
Claims (10)
1.一种蛋白酶，其特征在于它具有相同于源于芽胞杆菌菌株I612，DSM9701的蛋白酶的免疫化学特性，其特征还在于：
(a)表观分子量为31kD；
(b)pI为8.0；
(c)在25℃下，以酪蛋白为底物测定的最佳pH值在7-9.5范围内；
(d)在pH9.5下，以酪蛋白为底物测定的最佳温度约为30℃，在40℃时的活性低于20％；
(e)该蛋白酶能被PMSF和EDTA抑制。
2.如权利要求1的蛋白酶，可从芽胞杆菌菌株I612，DSM9701中获得。
3.一种分离的生物学上纯的芽胞杆菌菌株I612，DSM9701的培养物。
4.一种制备权利要求1-2中任一项的蛋白酶的方法，该方法包括在含有碳源、氮源和无机盐的合适营养培养基中培养权利要求3的产蛋白酶芽胞杆菌菌株，然后回收所需要的酶。
5.如权利要求4的方法，其中，对芽胞杆菌菌株I612，DSM9701进行培养。
6.将权利要求1-2中任一项的蛋白酶用作洗涤剂用酶的用途。
7.一种洗涤组合物，含有权利要求1-2中任一项的蛋白酶。
8.如权利要求7的洗涤组合物，它还含有一种或几种其它酶。
9.一种洗涤剂添加剂，含有权利要求1-2中任一项的蛋白酶，该蛋白酶以无尘颗粒、液体的形式提供。
10.一种洗涤方法，包括添加权利要求1-2中任一项的蛋白酶。
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