CN109496850A - 一种澳洲坚果不定芽诱导的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及澳洲坚果栽培技术领域,具体涉及一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,首先以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体水培后,用水冲洗外植体,转入超净工作台,经吐温‑20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;然后接种于诱导培养基上进行光照培养,再将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养;本发明是在离体条件下进行澳洲坚果不定芽的诱导,不仅简化了消毒步骤,还获得了健壮、无菌的不定芽。
Description
技术领域
本发明涉及澳洲坚果栽培技术领域,具体涉及一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。
背景技术
澳洲坚果(Macadamia ternifolia F.Muell)是一种原产于澳洲的树生坚果,属于山龙眼科澳洲坚果属,又名夏威夷果、昆兰士果。因其果仁富含蛋白质、维生素和不饱和脂肪酸等,享有“干果之王”的美誉。澳洲坚果作为一种常绿乔木,其生态效益、经济效益具佳。目前,组织培养快速繁殖技术已在木本果树中广泛应用。
在澳洲坚果快速繁育方面,研究者利用澳洲坚果的茎段进行组织培养,如专利号201510868889.X公开了一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法,包括:从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体,将外植体进行消毒处理;将得到的外植体进行诱导培养20-24天,温度为23-25℃,光照强度为2000-2200Lux,每天光照13-15h;将培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段,接入生根培养基在温度为25-27℃培养,依次包括三个阶段:第一阶段,置于2200-2400Lux每天光照14-16h培养12-14天;第二阶段,置于黑暗下培养8-10天;第三阶段,置于2800-3000Lux每天光照18h培养直至生根;但其操作步骤繁琐、粪肥提取液成分复杂。
又如专利号201710038704.1公开了一种澳洲坚果组培扩繁方法,通过对澳洲坚果当年生嫩茎处理、消毒,分别置于启动培养基、增殖培养基以及生根培养基中进行组培,以达到快速扩繁的目的;但其消毒处理时间较长。
再如文献《澳洲坚果的组织培养研究_肖再云》公开了取HAES800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段,先将将材料在70%乙醇中浸15s后,转入0.1%HgCl2中浸8min,然后用无菌水冲洗5次,将HAES800的茎段在(1)号茎段培养基中培养30d后,转入(2)号茎段培养基继续培养,至25d时,愈伤组织增殖及诱导畸胚培养基25~30d转1次,畸胚增殖培养30d转1次,畸胚诱芽培养45~60d转1次,芽增殖及伸长培养30~45d转1次,诱根培养60d,同时还公开了培养基配方;但其周期长、步骤繁杂。
因此,周期长、步骤繁杂、操作困难、病害率、污染率高是目前澳洲坚果快速繁育亟待克服的技术难题及研究热点。
发明内容
本发明为解决上述技术问题,提供了一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。
具体是通过以下技术方案来实现的:
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为20-30℃,水培时间≥15h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法,步骤1)中水培时间为24h,培养温度为25℃。
上述方法,步骤2)中水冲洗时间0.3-0.8h,TWEEN-20浸泡2-5min,酒精消毒时间15-45s,0.1%升汞浸泡时间8-12min,无菌水冲洗3次;优选的,步骤2)中水冲洗时间0.5h,TWEEN-20浸泡3min,酒精消毒时间30s,0.1%升汞浸泡时间10min,无菌水冲洗3次。
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1%。
所述TWEEN-20经120-124℃高压灭菌处理后备用。
上述方法,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10~15d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;优选地,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10~15d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8。
上述方法,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;优选地,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA31.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8。
上述方法,步骤3)中光照培养为:置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养13-16h,光照强度1800-2000Lux;优选地,无菌培养室的温度为26℃,相对湿度70%,光照培养16h,光照强度2000Lux。
上述方法,步骤4)中增殖培养条件为:置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养15-20d,光照强度1800-2000Lux;优选地,无菌培养室的温度为26℃,相对湿度70%,光照培养16h,光照强度2000Lux。
有益效果:
(1)澳洲坚果在生长萌芽期时茎段具有幼年态特性,生长旺盛且带菌较少,再生芽诱导率较高,组织不容易坏死。
(2)TWEEN-20是一种亲水性强的非离子型去污剂,促进消毒液接触表面组织,吸附外植体内部的内生菌;本发明结合TWEEN-20,对消毒剂处理的时间和浓度进行严格的筛选控制,通过TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗的组合消毒方式,将污染率控制在5%以下,且不影响不定芽的诱导和增殖,克服了消毒剂对不定芽诱导和增殖的不良影响。
(3)萘乙酸(NAA)作为一种植物生长调节剂,具有促进细胞分裂与扩大,诱导形成不定根的作用;本发明在培养基中添加低浓度的NAA后,不定芽形成的时间不仅缩短了7天,还确保了芽粗壮。
采用本发明,外植体污染率为3%~5%,不定芽诱导率为97.5%。与现有技术相比,本发明具有如下优点:1.结合吐温20、酒精和升汞混合使用,使得消毒彻底,污染率降低;2.易获得无菌外植体;3.能够在短期内获得再生芽。
本发明是在离体条件下进行澳洲坚果不定芽的诱导,不仅简化了消毒步骤,还获得了健壮、无菌的不定芽。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明,但本发明并不局限于这些实施方式,任何在本实施例基本精神上的改进或代替,仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为25℃,水培时间为24h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法,步骤2)中水冲洗时间0.5h,TWEEN-20浸泡3min,酒精消毒时间30s,0.1%升汞浸泡时间10min,无菌水冲洗3次,无菌水每次冲洗时间为2min;
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1%,且经121℃高压灭菌30min后备用;
上述方法,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10~15d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8;
上述方法,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8;
上述方法,步骤3)中光照培养为:置于温度为26℃、相对湿度70%的无菌培养室中光照培养16h,光照强度2000Lux;
上述方法,步骤4)中增殖培养条件为:置于温度为26℃、相对湿度70%的无菌培养室中光照培养16d,光照强度2000Lux。
实施例2
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为30℃,水培时间为15h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法,步骤2)中水冲洗时间0.6h,TWEEN-20浸泡4min,酒精消毒时间35s,0.1%升汞浸泡时间12min,无菌水冲洗3次;
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1%,且经121℃高压灭菌30min后备用;
上述方法,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10~15d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA0.007mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;
上述方法,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.7mg/L+6-BA 2.6mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;
上述方法,步骤3)中光照培养为:置于温度为26℃、相对湿度为67%的无菌培养室中光照培养15h,光照强度1900Lux;
上述方法,步骤4)中增殖培养条件为:置于温度为26℃、相对湿度为67%的无菌培养室中光照培养20d,光照强度1900Lux。
实施例3
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为20℃,水培时间为15h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法,步骤2)中水冲洗时间0.3h,TWEEN-20浸泡2min,酒精消毒时间15s,0.1%升汞浸泡时间8min,无菌水冲洗3次;
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1%,且经121℃高压灭菌30min后备用;
上述方法,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8;
上述方法,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8;
上述方法,步骤3)中光照培养为:置于温度为25℃、相对湿度为67%的无菌培养室中光照培养13h,光照强度1800Lux;
上述方法,步骤4)中增殖培养条件为:置于温度为25℃、相对湿度为67%的无菌培养室中光照培养15d,光照强度1800Lux。
实施例4
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为30℃,水培时间为24h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法,步骤2)中水冲洗时间0.8h,TWEEN-20浸泡5min,酒精消毒时间45s,0.1%升汞浸泡时间12min,无菌水冲洗3次;
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1%,且经121℃高压灭菌30min后备用;
上述方法,步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为15d;不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 2.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;
上述方法,步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA32.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0;
上述方法,步骤3)中光照培养为:置于温度为27℃、相对湿度为73%的无菌培养室中光照培养16h,光照强度2000Lux。
上述方法,步骤4)中增殖培养条件为:置于温度为27℃、相对湿度为73%的无菌培养室中光照培养16d,光照强度2000Lux。
试验例1:嫩枝水培工艺筛选
选取澳洲坚果品种H2为供试材料,采取澳洲坚果嫩枝带回后放在自来水中分别培养12h,24h和48h,以未处理的嫩枝为对照;其他步骤同实施例1,观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况,统计不定芽的出芽率和污染率,结果如表1所示:
表1
出芽率/% | 污染率/% | |
12h | 97.3 | 3.7 |
24h | 98.7 | 3.0 |
48h | 95.8 | 2.9 |
试验例2:外植体消毒工艺筛选
1.1工艺模式筛选,设置多种灭菌方法具体为:
方法1:实施例1
方法2:75%酒精30s、0.1%升汞10min、无菌水冲洗5次
方法3:1%洁儿灭消毒液10min、75%酒精30s、0.1%升汞10min、无菌水冲洗5次
方法4:1%84消毒液+75%酒精30s、0.1%升汞12min、无菌水冲洗5次
方法5:0.1%吐温20(未灭菌)、75%酒精30s、0.1%升汞8min、无菌水冲洗5次
方法6:实施例1中吐温20替换为吐温40,其他条件相同
将方法1-6处理后的外植体表面水分吸干,接种在实施例1的诱导培养基上,培养方式同实施例1;每组接种30个茎段,3次重复,30d统计污染率、出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度,结果如表2所示:
表2
1.2工艺参数筛选:
利用0.1%吐温20、75%酒精、0.1%升汞、无菌水冲洗的模式进行灭菌处理,其中,0.1%TWEEN-20浸泡时间设1min、3min和5min三个水平,酒精消毒时间设15、30和45s三个水平,升汞消毒时间设定为8、10和12min三个水平,完全组合设计,共27个处理,消毒完成后,用无菌水冲洗3次。将外植体表面水分吸干,接种在诱导培养基上。每处理接种30个茎段,3次重复,30d统计污染率、成活率及出芽率,筛选出最佳工艺为:TWEEN-20浸泡3min,酒精消毒时间30s,0.1%升汞浸泡时间10min。
试验例3诱导培养基筛选:
采用实施例1的水培、消毒方式处理嫩枝后,接种在下述培养基上,每组处理接种30个茎段,3次重复,观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况,统计不定芽的出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度,结果如表3所示:
诱导培养基1:1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基2:1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L
诱导培养基3:1/2MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基4:1/2MS+6-BA 0.3mg/L+GA3 0.3mg/L+维生素B10.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基5:1/2MS+GA3 1.5mg/L+NAA 0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
表3
试验例4增殖培养基的筛选:
采用实施例1的水培、消毒、诱导培养方式处理后,将初代培养诱导出来的不定芽切割后,接种到下述不定芽增殖培养基上,每组处理接种30个外植体,3次重复,30d转瓶1次,观察并记录不定芽的生长状态,60d统计平均增殖数、差异性,结果如表4所示:
增殖培养基1:1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
增殖培养基2:1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
增殖培养基3:1/2MS+6-BA 0.3mg/L+PEG 0.3mg/L+维生素B10.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L
增殖培养基4:1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+PEG 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
表4
试验例5
取HAES800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段作为外植体,分别按照实施例1-4的方法进行培养,统计愈伤组织分化的畸胚率及芽的分化率,结果如表5所示:
表5
实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
畸胚率(%) | 75.3 | 72.4 | 71.8 | 75.5 |
分化率(芽/块·月) | 7 | 6 | 5 | 6 |
Claims (9)
1.一种澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)以澳洲坚果为供试材料,采取抽稍期嫩枝为外植体,将外植体进行水培,水培温度为20-30℃,水培时间≥15h;
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝,转入超净工作台,放入已灭菌的空培养瓶中,经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗,然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用;
3)步骤2)处理完成后,接种于诱导培养基上进行光照培养;
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养;
步骤2)中所述TWEEN-20浓度为0.1%,浸泡时间为2-5min。
2.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤1)中水培时间为24h,培养温度为25℃。
3.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤2)中所述水冲洗时间为0.3-0.8h。
4.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤2)中所述酒精消毒时间为15-45s。
5.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤2)中所述升汞浸泡时间为8-12min。
6.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤3)中所述诱导培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0。
7.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤4)中所述增殖培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L,pH5.8-6.0。
8.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤3中所述光照培养为:置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养13-16h,光照强度1800-2000Lux。
9.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法,其特征在于,步骤4)中所述增殖培养条件为:置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养15-20d,光照强度1800-2000Lux。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN106797886A (zh) * | 2017-01-19 | 2017-06-06 | 西南林业大学 | 澳洲坚果组培扩繁方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
SURIYAN CHA-UM等: "Promoting root induction and growth of in vitro macadamia (Macadamia tetraphylla L.‘Keaau’) plantlets using CO2-enriched photoautotrophic conditions", 《PLANT CELL TISS ORGAN CULT》 * |
罗培四等: "澳洲坚果繁育技术研究进展", 《中国南方果树》 * |
郭凌飞等: "澳洲坚果组织培养研究初报", 《中国农学通报》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109496850B (zh) | 2020-07-28 |
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