CN109496850B - 一种澳洲坚果不定芽诱导的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及澳洲坚果栽培技术领域，具体涉及一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，首先以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体水培后，用水冲洗外植体，转入超净工作台，经吐温‑20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；然后接种于诱导培养基上进行光照培养，再将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养；本发明是在离体条件下进行澳洲坚果不定芽的诱导，不仅简化了消毒步骤，还获得了健壮、无菌的不定芽。

Description

一种澳洲坚果不定芽诱导的方法
技术领域
本发明涉及澳洲坚果栽培技术领域，具体涉及一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。
背景技术
澳洲坚果(Macadamia ternifolia F.Muell)是一种原产于澳洲的树生坚果，属于山龙眼科澳洲坚果属，又名夏威夷果、昆兰士果。因其果仁富含蛋白质、维生素和不饱和脂肪酸等，享有“干果之王”的美誉。澳洲坚果作为一种常绿乔木，其生态效益、经济效益具佳。目前，组织培养快速繁殖技术已在木本果树中广泛应用。
在澳洲坚果快速繁育方面，研究者利用澳洲坚果的茎段进行组织培养，如专利号201510868889.X公开了一种澳洲坚果的组织培养快速繁殖方法，包括：从澳洲坚果成年树上截取4cm长含有芽的茎段为外植体，将外植体进行消毒处理；将得到的外植体进行诱导培养20-24天，温度为23-25℃，光照强度为2000-2200Lux，每天光照13-15h；将培养出的新长腋芽苗在无菌条件下切成只带一个腋芽的茎段，接入生根培养基在温度为25-27℃培养，依次包括三个阶段：第一阶段，置于2200-2400Lux每天光照14-16h培养12-14天；第二阶段，置于黑暗下培养8-10天；第三阶段，置于2800-3000Lux每天光照18h培养直至生根；但其操作步骤繁琐、粪肥提取液成分复杂。
又如专利号201710038704.1公开了一种澳洲坚果组培扩繁方法，通过对澳洲坚果当年生嫩茎处理、消毒，分别置于启动培养基、增殖培养基以及生根培养基中进行组培，以达到快速扩繁的目的；但其消毒处理时间较长。
再如文献《澳洲坚果的组织培养研究_肖再云》公开了取HAES800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段，先将将材料在70％乙醇中浸15s后，转入0.1％HgCl2中浸8min，然后用无菌水冲洗5次，将HAES800的茎段在(1)号茎段培养基中培养30d后,转入(2)号茎段培养基继续培养,至25d时,愈伤组织增殖及诱导畸胚培养基25～30d转1次,畸胚增殖培养30d转1次,畸胚诱芽培养45～60d转1次,芽增殖及伸长培养30～45d转1次,诱根培养60d，同时还公开了培养基配方；但其周期长、步骤繁杂。
因此，周期长、步骤繁杂、操作困难、病害率、污染率高是目前澳洲坚果快速繁育亟待克服的技术难题及研究热点。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种澳洲坚果不定芽诱导的方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：
1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为20-30℃，水培时间≥15h；
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法，步骤1)中水培时间为24h，培养温度为25℃。
上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.3-0.8h，TWEEN-20浸泡2-5min，酒精消毒时间15-45s，0.1％升汞浸泡时间8-12min，无菌水冲洗3次；优选的，步骤2)中水冲洗时间0.5h，TWEEN-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min，无菌水冲洗3次。
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1％。
所述TWEEN-20经120-124℃高压灭菌处理后备用。
上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；优选地，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8。
上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3(1.0-2.0)mg/L+6-BA(1.0-3.0)mg/L+NAA(0.005-0.05)mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；优选地，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA31.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8。
上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73％的无菌培养室中光照培养13-16h，光照强度1800-2000Lux；优选地，无菌培养室的温度为26℃，相对湿度70％，光照培养16h，光照强度2000Lux。
上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73％的无菌培养室中光照培养15-20d，光照强度1800-2000Lux；优选地，无菌培养室的温度为26℃，相对湿度70％，光照培养16h，光照强度2000Lux。
有益效果：
(1)澳洲坚果在生长萌芽期时茎段具有幼年态特性，生长旺盛且带菌较少，再生芽诱导率较高，组织不容易坏死。
(2)TWEEN-20是一种亲水性强的非离子型去污剂，促进消毒液接触表面组织，吸附外植体内部的内生菌；本发明结合TWEEN-20，对消毒剂处理的时间和浓度进行严格的筛选控制，通过TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗的组合消毒方式，将污染率控制在5％以下，且不影响不定芽的诱导和增殖，克服了消毒剂对不定芽诱导和增殖的不良影响。
(3)萘乙酸(NAA)作为一种植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根的作用；本发明在培养基中添加低浓度的NAA后，不定芽形成的时间不仅缩短了7天，还确保了芽粗壮。
采用本发明，外植体污染率为3％～5％，不定芽诱导率为97.5％。与现有技术相比，本发明具有如下优点：1.结合吐温20、酒精和升汞混合使用，使得消毒彻底，污染率降低；2.易获得无菌外植体；3.能够在短期内获得再生芽。
本发明是在离体条件下进行澳洲坚果不定芽的诱导，不仅简化了消毒步骤，还获得了健壮、无菌的不定芽。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：
1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为25℃，水培时间为24h；
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.5h，TWEEN-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min，无菌水冲洗3次，无菌水每次冲洗时间为2min；
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；
上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8；
上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8；
上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为26℃、相对湿度70％的无菌培养室中光照培养16h，光照强度2000Lux；
上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为26℃、相对湿度70％的无菌培养室中光照培养16d，光照强度2000Lux。
实施例2
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：
1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为30℃，水培时间为15h；
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.6h，TWEEN-20浸泡4min，酒精消毒时间35s，0.1％升汞浸泡时间12min，无菌水冲洗3次；
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；
上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10～15d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA0.007mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；
上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.7mg/L+6-BA 2.6mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；
上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为26℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养15h，光照强度1900Lux；
上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为26℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养20d，光照强度1900Lux。
实施例3
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：
1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为20℃，水培时间为15h；
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.3h，TWEEN-20浸泡2min，酒精消毒时间15s，0.1％升汞浸泡时间8min，无菌水冲洗3次；
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；
上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为10d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8；
上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA3 1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8；
上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为25℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养13h，光照强度1800Lux；
上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为25℃、相对湿度为67％的无菌培养室中光照培养15d，光照强度1800Lux。
实施例4
一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，包括以下步骤：
1)以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为30℃，水培时间为24h；
2)用水冲洗步骤1)中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3)步骤2)处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4)将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养。
上述方法，步骤2)中水冲洗时间0.8h，TWEEN-20浸泡5min，酒精消毒时间45s，0.1％升汞浸泡时间12min，无菌水冲洗3次；
所述TWEEN-20的质量浓度为0.1％，且经121℃高压灭菌30min后备用；
上述方法，步骤3)中嫩枝在诱导培养基中光照培养时间为15d；不定芽诱导培养基为1/2MS+GA3 2.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；
上述方法，步骤4)中采用的增殖培养基为1/2MS+GA32.0mg/L+6-BA 3.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L，pH5.8-6.0；
上述方法，步骤3)中光照培养为：置于温度为27℃、相对湿度为73％的无菌培养室中光照培养16h，光照强度2000Lux。
上述方法，步骤4)中增殖培养条件为：置于温度为27℃、相对湿度为73％的无菌培养室中光照培养16d，光照强度2000Lux。
试验例1：嫩枝水培工艺筛选
选取澳洲坚果品种H2为供试材料，采取澳洲坚果嫩枝带回后放在自来水中分别培养12h，24h和48h，以未处理的嫩枝为对照；其他步骤同实施例1，观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况，统计不定芽的出芽率和污染率，结果如表1所示：
表1
出芽率/％ 污染率/％
12h 97.3 3.7
24h 98.7 3.0
48h 95.8 2.9
试验例2：外植体消毒工艺筛选
1.1工艺模式筛选，设置多种灭菌方法具体为：
方法1：实施例1
方法2：75％酒精30s、0.1％升汞10min、无菌水冲洗5次
方法3：1％洁儿灭消毒液10min、75％酒精30s、0.1％升汞10min、无菌水冲洗5次
方法4：1％84消毒液+75％酒精30s、0.1％升汞12min、无菌水冲洗5次
方法5：0.1％吐温20(未灭菌)、75％酒精30s、0.1％升汞8min、无菌水冲洗5次
方法6：实施例1中吐温20替换为吐温40，其他条件相同
将方法1-6处理后的外植体表面水分吸干，接种在实施例1的诱导培养基上，培养方式同实施例1；每组接种30个茎段，3次重复，30d统计污染率、出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度，结果如表2所示：
表2
Figure BDA0001878948030000091
Figure BDA0001878948030000101
1.2工艺参数筛选：
利用0.1％吐温20、75％酒精、0.1％升汞、无菌水冲洗的模式进行灭菌处理，其中，0.1％TWEEN-20浸泡时间设1min、3min和5min三个水平，酒精消毒时间设15、30和45s三个水平，升汞消毒时间设定为8、10和12min三个水平，完全组合设计，共27个处理，消毒完成后，用无菌水冲洗3次。将外植体表面水分吸干，接种在诱导培养基上。每处理接种30个茎段，3次重复，30d统计污染率、成活率及出芽率，筛选出最佳工艺为：TWEEN-20浸泡3min，酒精消毒时间30s，0.1％升汞浸泡时间10min。
试验例3诱导培养基筛选：
采用实施例1的水培、消毒方式处理嫩枝后，接种在下述培养基上，每组处理接种30个茎段，3次重复，观察并记录不定芽的诱导情况及不定芽的生长状况，统计不定芽的出芽率、每个外植体产生的平均芽苗数、芽苗的平均长度，结果如表3所示：
诱导培养基1：1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+NAA0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基2：1/2MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L
诱导培养基3:1/2MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基4：1/2MS+6-BA 0.3mg/L+GA3 0.3mg/L+维生素B10.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
诱导培养基5：1/2MS+GA3 1.5mg/L+NAA 0.005mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
表3
Figure BDA0001878948030000111
试验例4增殖培养基的筛选：
采用实施例1的水培、消毒、诱导培养方式处理后，将初代培养诱导出来的不定芽切割后，接种到下述不定芽增殖培养基上，每组处理接种30个外植体，3次重复，30d转瓶1次，观察并记录不定芽的生长状态，60d统计平均增殖数、差异性，结果如表4所示：
增殖培养基1：1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
增殖培养基2：1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
增殖培养基3：1/2MS+6-BA 0.3mg/L+PEG 0.3mg/L+维生素B10.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L
增殖培养基4：1/2MS+GA3 1.5mg/L+6-BA 1.0mg/L+PEG 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8.0g/L
表4
Figure BDA0001878948030000121
试验例5
取HAES800接穗嫩芽,切成带腋芽或顶芽的茎段作为外植体，分别按照实施例1-4的方法进行培养，统计愈伤组织分化的畸胚率及芽的分化率，结果如表5所示：
表5
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
畸胚率(％) 75.3 72.4 71.8 75.5
分化率(芽/块·月) 7 6 5 6

Claims (5)

1.一种澳洲坚果不定芽诱导的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）以澳洲坚果为供试材料，采取抽稍期嫩枝为外植体，将外植体进行水培，水培温度为20-30℃，水培时间≥15h；
2）用水冲洗步骤1）中嫩枝，转入超净工作台，放入已灭菌的空培养瓶中，经TWEEN-20浸泡、酒精消毒、升汞浸泡、无菌水冲洗，然后放在灭过菌的滤纸上吸干表面水份备用；
3）步骤2）处理完成后，接种于诱导培养基上进行光照培养；
4）将诱导的不定芽接种于增殖培养基上进行增殖培养；
步骤2）中所述TWEEN-20浓度为0.1%，浸泡时间为2-5min；
步骤2）中所述酒精消毒时间为15-45s；
步骤2）中所述升汞浸泡时间为8-12 min；
步骤3）中所述诱导培养基为1/2MS +GA3 (1.0-2.0) mg/L +6-BA (1.0-3.0) mg/L+NAA (0.005-0.05) mg/L +蔗糖30 g/L +琼脂8.0 g/L，pH5.8-6.0；
步骤4）中所述增殖培养基为1/2MS +GA3 (1.0-2.0) mg/L +6-BA (1.0-3.0)mg/L +NAA (0.005-0.05)mg/L+蔗糖30 g/L +琼脂8.0 g/L，pH5.8-6.0。
2.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤1）中水培时间为24h，培养温度为25℃。
3.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤2）中所述水冲洗时间为0.3-0.8 h。
4.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤3）中所述光照培养为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养13-16h，光照强度1800-2000Lux。
5.如权利要求1所述澳洲坚果不定芽诱导的方法，其特征在于，步骤4）中所述增殖培养条件为：置于温度为25-27℃、相对湿度为67-73%的无菌培养室中光照培养15-20d，光照强度1800-2000Lux。
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