CN109490521A - 一种抗平滑肌抗体检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开一种抗平滑肌抗体检测方法，包括：样本收集及贮存，样本及试剂准备；加样后，将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，室温进行第一次温育；根据所述步骤二中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡，浸泡后混匀荧光素和标记抗人球蛋白的结合物，加20ul至一洁净加样板反应区，完全加完二抗后方可开始温育；根据所述步骤三中加样后的载片吸干背面和四边的水分，后室温进行第二次温育；根据所述步骤四中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡后封片；进行结果判断和结果解释；流程科学，标准明确，实践操作效果好，准确率高。

Description

一种抗平滑肌抗体检测方法

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体是指一种抗平滑肌抗体检测方法。

背景技术

抗平滑肌抗体(SMA)是以机体平滑肌组织为抗原的一种自身抗体，无器官及种属特异性，主要为IgG和IgM类型。鼠肝、肾、人甲状腺和血小板等组织与平滑肌的肌动球蛋白具有共同的抗原性。因此用纯化的肌浆球蛋白为抗原可进行沉淀试验、间接血凝试验、放射免疫测定和酶免疫技术检测SMA。但目前最常用的是以平滑肌为抗原片的间接免疫荧光法。

抗平滑肌抗体为自身免疫性肝炎型的血清学标志抗体。在自身免疫性肝病患者中该抗体的检出率相当高。高滴度的抗平滑肌抗体，大于1：1000，为抗F-肌动蛋白，对诊断自身免疫性肝炎的特异性几乎达到100％，当抗体以IgG为主时，见于自身免疫性肝炎：以IgG和IgM为主时，见于自身免疫性肝炎与原发性胆汁性肝硬化重叠的患者。而低滴度的SIMA主要为抗G-肌动蛋白和抗非肌动蛋白成分，抗G-肌动蛋白与酒精性肝硬化相关，非肌动蛋白成分与病毒性肝炎等相关。

借助于自身抗体和各种病毒学指标，可根据不同将自身免疫性肝炎分为很多种亚型，在AIH中，抗细胞核、dsDNA和粒细胞浆抗体与ASMA一起出现。50％的原发性胆汁性肝硬化、酒精性肝硬化、胆管梗阻和2％的健康人群中也可检出低滴度的ASMA。

因此，如何研发一种抗平滑肌抗体检测方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本申请解决的主要问题是提供一种抗平滑肌抗体检测方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，准确率高，以解决一种抗平滑肌抗体检测方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、准确率不高、操作难度高、难以复制操作的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，包括：

步骤一：样本收集及贮存，样本及试剂准备；

步骤二：加样后，将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，室温进行第一次温育；

步骤三：根据所述步骤二中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡，浸泡后混匀荧光素和标记抗人球蛋白的结合物，加20ul至一洁净加样板反应区，完全加完二抗后方可开始温育；

步骤四：根据所述步骤三中加样后的载片吸干背面和四边的水分，后室温进行第二次温育；

步骤五：根据所述步骤四中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡后封片；

步骤六：进行结果判断和结果解释。

进一步的，所述步骤一包括：当载片平衡至室温后打开载片包装，所述载片可用笔标记，避免触及生物薄片；打开载片包装后，载片需在15分钟内进行温育。

进一步的，所述步骤一包括：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水，当加样板没有反应区亲水而周边疏水时，用家用洗涤剂清洗，再用足量的水冲洗，并用纸巾擦干净。

进一步的，所述步骤一中样本准备包括：每个标本做I个稀释梯度，按血清：磷酸盐缓冲液为1：100稀释血清并充分混匀。

进一步的，所述步骤四包括：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间限；检查生物薄片是否与液滴接触良好；室温温育30分钟，避免阳光直射载片。

进一步的，所述封片过程包括：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里，滴加甘油或PBS至盖玻片，从磷酸盐缓冲液洗杯中取出一张载片，用纸擦干背面和四边的水分，不要擦拭反应区间隙。

进一步的，所述步骤六包括：SMA反应性在滴度1：100无反应时，结果判断为阴性，即血清样本中未检出抗线粒体抗体；滴度1：100或更高时，结果判断为弱阳性或阳性，即提示患有慢性活动性肝炎、病毒性肝炎、传染性单核细胞增多症、或其他疾病。

进一步的，还包括质控步骤：每次实验均直接带阴、阳质控与患者标本同时测定。如果阳性对照不出现特异性荧光模型，或阴性对照出现清晰的特异性荧光，则实验结果不可用，实验必须重做。

进一步的，所述质控步骤还包括：试验前，将所有试剂置于室温；使用前，使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液。

本申请提供的抗平滑肌抗体检测方法，在第一次温育时，己稀释的血清与固定在载片反应区上生物薄片上的大鼠食道冰冻组织切片反应。如标本为阳性，己稀释血清中的特异性IgA、IgG和IgM抗体将与包被在固相上的抗原结合。然后加入荧光素FITC标记的抗人IgG抗体进行第二次温育，结合的抗体与荧光素标记的抗人抗体反应，然后再用荧光显微镜观察特异的荧光模型。

操作简单便利并且灵活、降低检测成本，减少步骤流程，提高劳动效率，流程科学，标准明确，实践操作效果好。

具体实施方式

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例一：

取患者坐位静脉血，血清或血浆1ml，标本应无溶血，无脂血，无微生物污染；对溶血++++，黄疸++++，脂血++++的标本拒收，标本的采集应使用清洁无菌的一次性干燥管，标本用量最少50ul，血清和血浆样本在2-8℃保存，保存10天，若室温保存，可存放1天，若长期保存，需置-20℃保存、同时避免反复冻融血清。

载片须于-40℃至-8℃保存，其他试剂2-8℃保存，如果保存恰当，自生产之日起，试剂盒中各组分可稳定12个月。

试剂开封后于2-8℃保存，在没有污染的情况下可稳定至有效期。

操作步骤包括：

为防止载片发生冷凝而破坏基质，只有当载片平衡至室温后才能打开包装。载片可用笔标记，不要触及生物薄片。打开保护袋后，载片需在15分钟内进行温育。不使用保护袋破损的载片。

FITC标记的二抗：直接使用，使用前需用加样器充分混匀。

阳性和阴性对照：直接使用，在初次使用前需用加样器充分混匀。

PBS吐温缓冲液：1包磷酸盐溶于1升蒸馏水，并加入2ml吐温20充分混匀。配例好的PBS吐温缓冲液于2-8℃可保存约1周，如果溶液变浑或出现污染则不能使用。

加样板：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水。必要时用一点家用洗涤剂清洗，再用足量的水冲洗，并用纸巾擦干净。

样本准备：每个标本做1个稀释梯度。用1000ul磷酸盐缓冲液+10ul血清稀释血清并充分混匀。

加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25ul的1：100稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。

将载片覆有生物薄片的一一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温(18-25℃)温育30分钟；

清洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟，注意水流不要太急，不要直接对着基质冲，然后立即将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中没泡至少5分钟，注意载片不要吹干。

加样：混匀荧光素-标记抗人球蛋白(结合物)，加20ul至一洁净加样板反应区，完全加完二抗后方可开始温育，最多可加50张载片；

从磷酸盐缓冲波洗杯中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦去背面和边缘的水后，立即将载片没有生物薄片的一一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。室温(18-25℃)温育30分钟。从此时开始，应避免阳光直射载片。

冲洗：用烧杯盛磷酸盐缓冲液流水冲洗载片1秒钟，注意水流不要太急，不要直接对着基质冲，然后立即将其浸入装有磷酸盐缓冲液的小杯中浸泡至少5分钟。

封片：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加甘油或PBS至盖玻片：每一个反应区约10ul。从磷酸盐缓冲液洗杯中取出一张载片，用纸擦干背面和四边的水分，注意不要擦拭反应区间隙。将载片覆有生物薄片的一面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并轻轻调整使盖玻片嵌入到载片的凹槽里。然后继续下一张。

SMA反应性在滴度1：100无反应时，结果判断为阴性，即血清样本中未检出抗线粒体抗体；滴度1：100或更高时，结果判断为弱阳性或阳性，即提示患有慢性活动性肝炎、病毒性肝炎、传染性单核细胞增多症、或其他疾病。

只有全部使用本试剂盒内的试剂才能保正检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及荧光标记物，必须使用试剂盒配备的不要使用其它批号产品。

开始试验前，将所有试剂置于室温。

每一一种试剂都是致检测的教感度的降低。经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果经过稀释或改动都会导致检测的敏感度降低。

在储存及孵育过程中避免将试剂利暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。

试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液。

每次实验均直接带阴、阳质控与患者标本同时测定。如果阳性对照不出现特异性荧光模型，或阴性对照出现清晰的特异性荧光，则实验结果不可用，实验必须重做。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，包括：

步骤一：样本收集及贮存，样本及试剂准备；

步骤二：加样后，将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，室温进行第一次温育；

步骤三：根据所述步骤二中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡，浸泡后混匀荧光素和标记抗人球蛋白的结合物，加20ul至一洁净加样板反应区，完全加完二抗后方可开始温育；

步骤四：根据所述步骤三中加样后的载片吸干背面和四边的水分，后室温进行第二次温育；

步骤五：根据所述步骤四中温育后的载片用烧杯盛放磷酸盐缓冲液流水冲洗，将其没入装有磷酸盐级冲液的小杯中浸泡后封片；

步骤六：进行结果判断和结果解释。

2.根据权利要求1所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述步骤一包括：当载片平衡至室温后打开载片包装，所述载片可用笔标记，避免触及生物薄片；打开载片包装后，载片需在15分钟内进行温育。

3.根据权利要求1所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述步骤一包括：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水，当加样板没有反应区亲水而周边疏水时，用家用洗涤剂清洗，再用足量的水冲洗，并用纸巾擦干净。

4.根据权利要求3所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述步骤一中样本准备包括：每个标本做I个稀释梯度，按血清：磷酸盐缓冲液为1：100稀释血清并充分混匀。

5.根据权利要求4所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述步骤四包括：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间限；检查生物薄片是否与液滴接触良好；室温温育30分钟，避免阳光直射载片。

6.根据权利要求5所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述封片过程包括：将盖玻片直接放在泡沫板的凹槽里，滴加甘油或PBS至盖玻片，从磷酸盐缓冲液洗杯中取出一张载片，用纸擦干背面和四边的水分，不要擦拭反应区间隙。

7.根据权利要求6所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述步骤六包括：SMA反应性在滴度1：100无反应时，结果判断为阴性，即血清样本中未检出抗线粒体抗体；滴度1：100或更高时，结果判断为弱阳性或阳性，即提示患有慢性活动性肝炎、病毒性肝炎、传染性单核细胞增多症、或其他疾病。

8.根据权利要求7所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，还包括质控步骤：每次实验均直接带阴、阳质控与患者标本同时测定。如果阳性对照不出现特异性荧光模型，或阴性对照出现清晰的特异性荧光，则实验结果不可用，实验必须重做。

9.根据权利要求8所述的抗平滑肌抗体检测方法，其特征在于，所述质控步骤还包括：试验前，将所有试剂置于室温；使用前，使用前振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液。