CN109490262B - 基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器及制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的制备方法，其通过化学共价链接方式将带末端氨基和荧光基团的微囊藻毒素适配体DNA固定在具有生物相容性且具有较大比表面积的氧化锌纳米线表面，制得具有荧光活性的氧化锌纳米线，即微囊藻毒素传感器，从而当带有荧光基团的氧化锌纳米线与微囊藻毒素结合后，由于微囊藻毒素与微囊藻毒素适配体DNA特异性结合使荧光淬灭，进而建立一套灵敏度高、特异性强的水体藻毒素传感体系。相应地，本发明还提供了一种利用上述制备方法制备得到的微囊藻毒素传感器及其在检测MC‑LR中的应用。

Description

基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器及制备方法、应用

技术领域

本发明涉及传感技术领域，具有涉及一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素光学传感器及其制备方法，以及该微囊藻毒素光学传感器在微囊藻毒素检测中的应用。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是蓝藻细菌繁殖过程中产生的致命性氰基毒素中的一种，它广泛存在于海水和谈水中。MC污染严重影响了水质和水生生物的安全，而这些毒素生物链在动植物中蓄积，并通过食物链对人体健康产生危害，例如引发肝癌、肠癌等多种疾病，已成果国内外普遍关注的环境问题。针对饮用水中存在的微囊藻毒素可能产生的健康危害，许多国家、机构都指定了饮用水微囊藻毒素的限值，如世界卫生组织规定水体里藻毒素最高允许含量为1ug/L。目前，国内外监测藻毒素的方法有很多种，包括：高校液相色谱法检测，基于酶和抗体的免疫传感法，荧光和紫外以及对比色法，当然用的最多的还是电化学传感方法。然而，这些方法大多操作繁琐或需要标记，并且需要大型设备和专业人员进行操作，同时检测的灵敏度也不高。

氧化锌纳米材料因独特的光电性能及较大的激子束缚能被广泛用于场效应晶体管和光电传感器件制备中。其中，一维氧化锌纳米线表面极性极强，因此，可利用一维氧化锌纳米线的表面活性实现生物分子的高校负载和高灵敏度响应，同时，因其低毒性、生物相容性、可降解性、空气稳定性和大的比表面积在生物传感研究中备受青睐。然而，将一维氧化锌纳米线应用于检测微囊藻毒素的检测却尚未见报道。

基于此，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、操作便捷且成本低廉的基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感体系。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明提供一种灵敏度高、特异性强、操作便捷且成本低廉的微囊藻毒素传感器的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的制备方法，其包括步骤：以硅烷试剂作为偶联剂，采用带末端氨基和荧光双官能团的微囊藻毒素适配体 DNA对氧化锌纳米线进行表面化学反应修饰，使得微囊藻毒素适配体DNA通过化学共价的方式固定在氧化锌纳米线表面。

其中，所述氧化锌纳米线是采用无催化剂化学气相沉积法制备得到的。

其中，所述采用无催化剂化学气相沉积法制备氧化锌纳米线的步骤，具体包括步骤：

以质量比为3：1称取氧化锌和金刚石粉末均匀平铺于石英舟槽内，得到混合粉体；

将混合粉体和经过刻蚀处理的硅/二氧化硅基底置于管式炉内加热30分钟升温至450度，并停留3-5分钟，然后再次加热50分钟升温至960度，恒温 3-6分钟，且当升温至600度时，通入氧气；

其中，加热过程中，当温度为450度以下时，保持管式炉内气压10千帕以下；当温度从450度升温至960过程中，气压逐渐升至11KPa-30KPa，并保持恒压直至氧化锌纳米线生长完成。

进一步地，所述氧化锌纳米线的直径为100-200nm，长度为50-100um。

其中，以硅烷试剂作为偶联剂，采用微囊藻毒素适应体DNA对氧化锌纳米线进行表面化学反应共价修饰的步骤，具体包括步骤：

将生长在硅/二氧化硅基底上的氧化锌纳米线进行空气等离子体处理，使用功率10w的等离子体清洗机处理30分钟；

将清洗后的氧化锌纳米线与带末端氧化乙烷的硅烷试剂在无水甲苯中反应 3小时，反应温度为60度；

采用无水甲苯以及丙酮清洗除去多余的反应物，得到带环氧乙基的氧化锌纳米线；

将带环氧乙基的氧化锌纳米线与带末端氨基和荧光分子的微囊藻毒素适配体DNA以1：10的摩尔浓度比在磷酸缓冲体系中作用5小时，从而通过氨基与环氧乙基的亲核作用将微囊藻毒素适配体DNA键接到氧化锌纳米线表面。

本发明的另一方面，还提供了一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器，其是采用上述制备方法制备得到的。

本发明的另一方面，还提供了一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的应用。

本发明的有益之处在于：

本发明通过化学共价链接方式将带末端氨基和荧光基团的微囊藻毒素适配体DNA固定在具有生物相容性且具有较大比表面积的氧化锌纳米线表面，制得具有荧光活性的氧化锌纳米线，即微囊藻毒素传感器，从而当荧光纳米线与微囊藻毒素结合后，由于藻毒素与适配体特异性结合使荧光淬灭，进而建立一套灵敏度高、特异性强的水体藻毒素传感体系。

附图说明

图1为本发明的一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的原理示意图；

图2a为反应氧化锌纳米线经带荧光基团的适配体化学共价修饰后与不同含量MC-LR相互作用后在570nm波长的绿光激发1s的荧光图；

图2b为反应氧化锌纳米线经物理吸附附着带荧光基团的适配体后与1nM 的MC-LR相互作用在570nm波长的绿光激发1s的荧光图；

图3a、图3b和图3c分别为将接有微囊藻毒素适配体DNA的氧化锌分别与 0.1nM的MC-RR,0.1nM的MC-YR和0.1nM的叶绿素作用后的荧光图；

图3d为将接有微囊藻毒素适配体DNA的氧化锌与0.1nM的MC-LR，MC-RR, MC-YR和叶绿素四者的混合物作用后的荧光图3d。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本实施例的基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的制备方法，包括步骤：

1)制备氧化锌纳米线：

称取0.3克氧化锌和0.1克金刚石粉末均匀平铺于石英舟槽内；

将经过刻蚀处理的长在硅基底上的二氧化硅基片竖直立在粉体上方，并将石英舟置于管式炉中央，然后在8KPa的气压下(从室温开始)加热30分钟升温至450度，停留3-5分钟；

再次加热50分钟使其升温至960度，恒温3-6分钟，且当温度升温至600 度时，通入氧气，而从450度升温至960度的过程中逐渐增加气压至 11KPa-30Kpa，并保持恒温至氧化锌纳米线生长完成。

本实施例中，在加热的整个过程中都保持载气氩气在通着，且制备得到的氧化锌纳米线的直径大概在100-200纳米，长度在50-100微米，并且经过刻蚀处理的二氧化硅上刻蚀出了条形凹槽结构，而在刻蚀边角处有缺陷的地方更容易生长氧化锌纳米线，并且生长更加密集。

2)氧化锌纳米线的表面活化及共价修饰

将上述步骤1)中生长得到的长在硅/二氧化硅基底上的氧化锌纳米线进行空气等离子体处理，即使用功率10瓦的等离子体清洗机处理30分钟；

将清洗后的氧化锌纳米线与带末端环氧乙烷的硅烷试剂在无水甲苯中反应 3小时，反应温度为60度，得到硅烷化氧化锌(即ZnO-GOPS)；(当然，本实施例中该步骤中也可采用带末端氨基的硅烷试剂来替换带末端环氧乙烷的硅烷试剂，且现将其与茂二醛反应后再在无水甲醛中反映得到硅烷化氧化锌；)

再用无水甲苯以及丙酮清洗出去多余的反应物，制得带环氧乙基的氧化锌纳米线；

将上述得到的带环氧乙基的氧化锌纳米线与1uM的带末端氨基和荧光分子的微囊藻毒素适配体DNA(以下简称适配体)在10mM的磷酸缓冲体系中室温条件下作用5小时，从而通过氨基与环氧乙基的亲核作用将藻毒素适配体DNA (即荧光适配体)键接到氧化锌纳米线表面，从而得到带荧光基团的微囊藻毒素氧化锌纳米线，即微囊藻毒素传感器。

本实施例中，通过化学共价链接方式将带末端氨基和荧光基团的适配体固定在具有生物相容性且具有较大比表面积的氧化锌纳米线表面，从而制得具有荧光(官能团)活性的氧化锌纳米线，即微囊藻毒素传感器，再利用微囊藻毒素与适配体之间的特异性结合将传感器的荧光基团包埋而产生荧光淬灭现象，进而实现了光学间接检测MC-LR的目的。参见图1，本实施例的制备方法制备得到的该微囊藻毒素传感器的工作过程和原理如下：

将上述制备方法制备得到的带荧光基团的氧化锌纳米线与含有MC-LR(1nM 以下)和5mM MgCl₂的50mM Tris-buffer溶液在震荡下作用1小时，使得适配体末端的荧光基团被包埋起来，导致氧化锌纳米线的荧光淬灭，从而实现光学间接检测MC-LR。

参见图2a，通过荧光显微镜能观察到明显的荧光变化：氧化锌(ZnO)及硅烷化氧化锌(ZnO-GOPS)是不带荧光的，而当氧化锌接上带荧光的微囊藻毒素适配体DNA(ZnO-DNA)后，发出明显的红光；当将接有微囊藻毒素适配体 DNA的氧化锌与0.1nM的MC-LR作用后荧光明显减弱，而与1nM的MC-LR作用后荧光完全淬灭。

本实施例的制备方法制备得到的该微囊藻毒素传感器的造价成本低廉，且操作简单，并且其检测限度可以达到0.1nM，比现有的其他方式检测限度仅为 10-20ng(1nmol/mlX0.32＝0.32ng/ml)，也即是说，本实施例中的传感器的检测精度远远高于现有的检测方式的检测精度。

为了验证本实施例中采用化学共价修饰氧化锌纳米线表面的方法制备得到的微囊藻毒素传感器的反应优势，本实施例中还提供了另一种微囊藻毒素传感器，其具体方式是在氧化锌纳米线表面通过物理吸附方式附着带双官能团(带末端氨基和荧光官能团)的微囊藻毒素适配体DNA，具体地：

首先，制备氧化锌纳米线，然后将生长的氧化锌纳米线经过同样的等离子体活化处理后(即使用功率10w的等立体清洗机处理30分钟)，直接浸泡在带双官能团的微囊藻毒素适配体DNA缓冲液中同等条件反应处理(即直接将等离子活化后的氧化锌纳米线与1uM的适配体DNA在10mM的磷酸缓冲体系中室温作用5小时)后得到表面吸附有荧光基团的适配体的氧化锌纳米线。

然而，通过物理吸附附着在氧化锌纳米线上的带荧光基团的适配体DNA分子在经过等离子清洗机清洗后绝大部分脱落，因此，其荧光要弱很多，且将其与1nM的MC-LR作用后，荧光没有明显变化，参见图2b。

为了进一步验证本实施例中所选取的适配体DNA与微囊藻毒素(MC-LR)具有特异性相互作用，且其不受水体其他污染物的强干扰，在相同条件下检测蓝藻毒素家族的其他类毒素比如MC-RR,MC-YR以及水体里广泛存在含量丰富的叶绿素等：当将接有微囊藻毒素适配体DNA的氧化锌分别与0.1nM的MC-RR, 0.1nM的MC-YR和0.1nM的叶绿素作用后，参见图3a、图3b和图3c，从荧光信号强度来看，MC-RR,MC-YR和叶绿素三者都没有出现明显荧光信号强度变化；但当往这三者的混合物中加入MC-LR后出现了荧光信号强度的变化，参见图3d，证明只有微囊藻毒素(MC-LR)能与他的适配体DNA相互作用后产生信号强度变化。

相应地，本发明还提供了采用上述实施例中的制备方法制备得到的基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器，以及其在微囊藻毒素检测中的应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器的制备方法，其特征在于，包括步骤：将带末端氨基和荧光双官能团的微囊藻毒素适配体DNA对氧化锌纳米线进行表面化学反应修饰，使得微囊藻毒素适配体DNA通过化学共价的方式固定在氧化锌纳米线表面；

其中，所述氧化锌纳米线是采用无催化剂化学气相沉积法制备得到的，其步骤为：

以质量比为3：1称取氧化锌和金刚石粉末均匀平铺于石英舟槽内，得到混合粉体；

将混合粉体和经过刻蚀处理的硅/二氧化硅基底置于管式炉内加热升温至450度，并停留3-5分钟，然后再次升温至960度，恒温3-6分钟，且当升温至600度时，通入氧气；

其中，加热过程中，当温度为450度以下时，保持管式炉内气压在10千帕以下；当温度从450度升温至960过程中，气压逐渐升至11KPa-30KPa，并保持恒压直至氧化锌纳米线生长完成；

所述氧化锌纳米线的直径为100-200nm，长度为50-100um。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用偶联剂法对氧化锌纳米线经表面化学反应修饰，以硅烷试剂或磷酸脂作为偶联剂。

3.如权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，以硅烷试剂作为偶联剂，采用微囊藻毒素适应体DNA对氧化锌纳米线进行表面化学反应共价修饰的步骤，具体包括步骤：

将生长在硅/二氧化硅基底上的氧化锌纳米线进行空气等离子体处理，使用功率10w的等离子体清洗机处理30分钟；

将清洗后的氧化锌纳米线与带末端环氧乙烷的硅烷试剂在无水甲苯中反应3小时，反应温度为60度；

采用无水甲苯以及丙酮清洗除去多余的反应物，得到带环氧乙基的氧化锌纳米线；

将带环氧乙基的氧化锌纳米线与带末端氨基和荧光分子的微囊藻毒素适配体DNA以1：10的摩尔浓度比在磷酸缓冲体系中作用5小时，从而通过氨基与环氧乙基的亲核作用将微囊藻毒素适配体DNA键接到氧化锌纳米线表面。

4.一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器，其特征在于，所述微囊藻毒素传感器是采用如权利要求1至3中任意一项所述的制备方法制备得到。

5.一种基于氧化锌纳米线的微囊藻毒素传感器在微囊藻毒素检测中的应用，其特征在于，包括步骤：将如权利要求1至3中任意一项所述的制备方法预先制备得到的带荧光基团的氧化锌纳米线与含有MC-LR的水体作用，其作用条件为：

与含有5mM MgCl2的50mM Tris-buffer溶液在震荡下作用1小时，使得氧化锌纳米线表面的微囊藻毒素适配体DNA末端的荧光基团被包埋。

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