CN109487003A

CN109487003A - 甜瓜坏死斑点病毒的rt-lamp检测引物对及检测方法

Info

Publication number: CN109487003A
Application number: CN201811463014.1A
Authority: CN
Inventors: 乔宁; 竺晓平; 刘杰; 张德珍; 代惠洁; 李金堂; 张先平
Original assignee: Shandong Agricultural University; Weifang University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Agricultural University; Weifang University of Science and Technology
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-03-19

Abstract

甜瓜坏死斑点病毒是甜瓜生产上危害较为严重的一种病毒。本发明旨在建立该病毒的逆转录环介导等温扩增检测方法，具有高度特异性，而且没有发现与其他病毒的交叉反应。通过与RT‑PCR扩增结果比较发现RT‑LAMP对MNSV的敏感性比普通RT‑PCR的高10³倍。该法具有高效、快速、灵敏等特点，非常适用于普通实验室和基层单位的病毒检测。

Description

甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对及检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，还涉及甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法。

背景技术

甜瓜又可称为香瓜、哈密瓜等，属葫芦科，一年生蔓性，草本植物。温带至热带地区广泛栽培，中国各地栽培亦分布广泛。甜瓜的重要之处也在于它是中国最早利用为果品的瓜类，《齐民要术》中称之为小瓜。甜瓜栽培历史悠久，品种类别多样，为盛夏的重要果实，有很高的经济价值，其果肉可生食，可制成瓜干、瓜脯、罐头，也可加工成瓜酒、瓜酱、腌甜瓜等。甜瓜在人们的生活中占据着重要地位，但甜瓜的产量和品质却或多或少的受到一些病害的影响，从而使甜瓜种植产业的经济效益有所减损，其中甜瓜病毒病便是影响甜瓜生产较严重的一种病害。

甜瓜坏死斑点病毒(Melonnecrotic spot virus，MNSV)属于番茄从矮病毒科（Tombusviridae）

香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，该病毒已在国内外的报道中被多次提及。甜瓜坏死斑点病毒于1960年在日本首次报道，之后陆续传播到美国、希腊、瑞典、意大利和突尼斯等国，2007年中国首次报道了MNSV的发生。

现在病毒的检测方法主要有血清学及分子生物学检测法，如酶联免疫吸附法（ELISA）、直接组织点免疫检测法（DTBIA）、逆转录PCR（RT-PCR）、实时荧光定量PCR和LAMP检测技术。目前，RT-LAMP方法已证明是诸多病原菌检测较为高效、快捷的一项技术，已广泛应用于人、动物、植物、病原微生物等方面的基因检测，为农业及其他方面的生产、科学研究提供了便捷途径。运用该方法进行病毒检测，不仅节约经济成本，而且能够节省时间及人力。在甜瓜坏死斑点病毒检测技术的建立过程中所展现的创新思维，也可能为其它研究提供灵感与借鉴。但目前尚未有使用RT-LAMP方法对甜瓜坏死斑点病毒进行检测的报道。

发明内容

为了解决以上现有技术中甜瓜坏死斑点病毒RT-LAMP方法的空白，本申请提供了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对。

本发明还建立了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，

外部引物对的核苷酸序列如下：

MNSV-F3：5’-TCGGCTCCGTTTCACCTA-3’，

MNSV-B3：5’-ACTTCCGGTCGACAGCATTA-3’。

内部引物对的核苷酸序列如下：

MNSV-FIP：5’-TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACCGGATCTACTTCCACTGG-3’，

MNSV-BIP：5’-TGCTCATTACGCTGACTCAGCG-CCTCCACGTATTGTCACACG-3’。

检测引物对在进行非治疗目的的甜瓜坏死斑点病毒的检测中的应用。

所述的应用，优选提取待检样品的总RNA，使用含有权利要求1中的检测引物对的反应体系进行扩增反应。

所述的应用，优选反应体系为25 μL体系，含有浓度均为10μM的MNSV-FIP和MNSV-BIP引物各1.6 μL，浓度均为10μM的MNSV-F3和MNSV-B3引物各0.2 μL，12.5 μL 2×RT-LAMP反应缓冲液，1 μL的8 U /μL的 Bst DNA聚合酶，1 μL 200 U /μL的 M-MuLV逆转录酶，1 μL40 U /μL的 RNasin® RNA酶抑制剂，2 μL RNA模板和不含RNase / DNase的ddH₂O。

所述的应用，优选2×RT-LAMP反应缓冲液，含有40 mM Tris-HCl(pH 8.8)、20 mMKCl、20 mM (NH₄)₂SO₄、16 mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4 mM dNTP和1.6 M甜菜碱。

所述的应用，优选扩增反应条件为62℃、60分钟。

所述的应用，优选RNA模板浓度检测限为0.75×10^-5μg/μL。

本发明的有益效果：

1）建立了甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测方法，鉴于该法具有灵敏、可靠、快速的特点；

2）RT-LAMP对于检测MNSV是高度特异性的，而其他病毒没有获得扩增产物。检测结果的比较显示，RT-LAMP对MNSV的敏感性比RT-PCR高10³倍，而扩增和检测时间仅为后者的1/3；

3）RT-LAMP技术只需更简单的设备和材料，因此MNSV的RT-LAMP检测技术在实际生产中具有更大的潜在价值，非常适合普通实验室和基层单位的大量样品检测。

附图说明

图1 为MNSV RT-LAMP反应条件的优化，（A）温度对RT-LAMP反应的影响：（M：DL2000；1：60℃；2：61℃；3：62℃；4：63℃）；（B）时间对RT-LAMP反应的影响：（M：DL 2000；1：30分钟；2：45分钟；3：60分钟；4：70分钟）；5：阴性对照。

图2 为MNSV RT-LAMP的特异性检验，（A）琼脂糖凝胶电泳对RT-LAMP的特异性分析；（B）在UV光下加入SYBR Green I后的RT-LAMP可视化效果。M：DL 2000；1：MNSV感染的甜瓜（寿光）；2：MNSV感染的甜瓜（昌乐）；3：CGMMV感染的黄瓜；4：CMV感染的黄瓜；5：CCYV感染的甜瓜；6：阴性对照。

图3 为MNSV RT-LAMP和RT-PCR的比较，（A）使用连续稀释的总RNA通过琼脂糖凝胶电泳对RT-LAMP的灵敏度分析；（B）在UV光下添加SYBR Green I的RT-LAMP可视化效果；（C）相同稀释度的总RNA RT-PCR琼脂糖凝胶检测结果。M：DL 2000；1-8：MNSV感染甜瓜叶片中提取的总RNA模板浓度从0.75×10⁰至0.75×10^-7μg/μL作倍比稀释；9：阴性对照。

图4 为24个田间样品的电泳检测结果，（A）RT-LAMP方法检测结果；（B）RT-PCR方法检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.1 材料来源

采集来自中国山东省寿光市、昌乐县感染甜瓜坏死斑点病毒（MNSV）的甜瓜叶片；已通过RT-PCR验证并储存在实验室中的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）和瓜类褪绿黄化病毒( Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）。

1.2 引物的设计

以MNSV基因组中的保守序列（GenBank登录号EU016217.1）为基础设计了一组RT-LAMP引物，包括外部引物（MNSV-F3和MNSV-B3）和内部引物（MNSV-FIP和MNSV-BIP）。设计的一对特异性引物MNSV-F / MNSV-R用于常规RT-PCR扩增（见表1）。所有引物均由Invitrogen（中国上海）合成。

表1 用于MNSV的RT-PCR和RT-LAMP的引物设计

引物名称	长度	位置	序列(5’-3’)
				MNSV-F	20	1-20	TCTACCTCTGCTAGCGAATC
MNSV-R	18	656-673	GGTGCTACCAGCACCAGA
				MNSV-F3	18	397-414	TCGGCTCCGTTTCACCTA
MNSV-B3	20	601-620	ACTTCCGGTCGACAGCATTA
				MNSV-FIP	42		TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACCGGATCTACTTCCACTGG
MNSV-BIP	42		TGCTCATTACGCTGACTCAGCG-CCTCCACGTATTGTCACACG

1.3植物总RNA的提取

使用Mini BEST通用RNA提取试剂盒（Takara，Dalian，China）提取感染MNSV甜瓜叶片的总RNA，并储存于-80 ℃以进行后续的RT-LAMP和RT-PCR检测分析。

1.4 反应条件的初步建立

RT-LAMP反应在25 μL体系进行，含有浓度均为10μM的MNSV-FIP和MNSV-BIP引物各1.6μL，浓度均为10μM的MNSV-F3和MNSV-B3引物各0.2 μL，12.5 μL 2×RT-LAMP反应缓冲液[40mM Tris-HCl(pH 8.8)，20 mM KCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，16 mM MgSO₄，0.2％Triton X-100，2.4 mM dNTP和1.6 M甜菜碱（Sigma-Aldrich，St.Louis MO），1 μL Bst DNA聚合酶（8 U /μL，New England Biolabs，MA，USA），1 μL M-MuLV逆转录酶（200 U /μL，Promega，USA），1 μLRNasin® RNA酶抑制剂（40 U /μL，Promega，USA），2 μL RNA模板（阴性对照为无RNA酶的水）和不含RNase / DNase的ddH₂O。

RT-LAMP反应在61℃下进行60分钟，并在80℃下加热10分钟以终止反应，吸取5 μL产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳；在15 μL反应物中加入0.2 μL SYBR Green I（10 x，Invitrogen，USA），于365 nm的紫外光下肉眼观察产物的颜色变化。在不同的反应温度（60℃，61℃，62℃和63℃）下反应1小时并且在62℃下设置不同的反应时间（30，45，60和70分钟），以确定最佳反应条件。

从感染MNSV的甜瓜叶片中提取植物总RNA，采用不同的反应时间和温度进行RT-LAMP反应，以期得到最佳反应条件。琼脂糖凝胶电泳结果显示在60℃-63℃下均可得到许多大小不同的梯状条带（图1中A），鉴于条带在62°C时最亮，60分钟和70分钟时都可观察到有高浓度的弥散状产物（图1中B），因此选取62℃和60分钟为最佳反应条件。

1.5 RT-LAMP的特异性分析

从CGMMV和CMV感染的黄瓜叶片以及CCYV感染的甜瓜叶片组织中提取植物总RNA，分别以上述三种病毒和MNSV的RNA为模板，在最佳反应条件下进行RT-LAMP检测。

为了验证RT-LAMP对MNSV的特异性，使用CGMMV和CMV感染的黄瓜叶片和CCYV感染的甜瓜叶片，分别在62℃下进行RT-LAMP反应60分钟。电泳结果显示仅被MNSV感染的样品有弥散状条带，而被其他病毒感染的样品无任何条带（图2中A）。同时，将0.2 μL的SYBR GreenI加入到反应产物中，仅在MNSV感染的样品管中可见绿色，在其他样品管中未观察到颜色变化（图2中B）。

1.6 RT-LAMP和RT-PCR检测技术的灵敏度分析

为验证RT-LAMP检测的灵敏度，将总RNA的浓度以10倍系列稀释用作RT-LAMP和RT-PCR的模板。

使用Prime Script II第一链cDNA合成试剂盒（Takara，Dalian，China），按照说明手册使用反向引物（MNSV-R）进行逆转录，将得到的cDNA 2.5 μL 、引物MNSV-F和MNSV-R（10μM）各1 μL以及2× Taq PCR Master Mix（天根，北京）混合至总体积25 μL。于94℃ 5分钟；94℃ 30秒、55 ℃ 30秒和72℃ 30秒进行30个循环，最后在72℃延伸10分钟。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来检测RT-LAMP和RT-PCR的产物。

比较RT-LAMP和RT-PCR的检测限，将感染MNSV的甜瓜叶片总RNA模板浓度进行10倍系列稀释（0.75×10⁰至0.75×10^-7μg/μL）。当模板浓度为0.75×10^-5μg/μL时，通过凝胶电泳和SYBR Green I染色能够观察到RT-LAMP反应（图3中A和3中B）；对于普通的RT-PCR方法，在模板浓度为0.75×10^-2μg/μL时，通过凝胶电泳可以观察到预期的673bp目的片段；当模板浓度为0.75×10^-3μg/μL时，RT-PCR已经检测不到病毒（图3中C）。因此，结果表明RT-LAMP比RT-PCR灵敏高10³倍。

1.7 田间样品的RT-LAMP检测

从山东省不同温室采集疑似感染MNSV的甜瓜叶片24份，分别提取植物总RNA，所有样品在优化的反应条件下用RT-LAMP和RT-PCR分别进行反应，其产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

通过两种方法检测24个疑似感染MNSV的RNA样品来比较RT-LAMP与RT-PCR的可靠性。结果显示，RT-LAMP能够检测出24个样本中有21个为阳性（图4中A），检出率为87％；而通过RT-PCR只检测出18个样本为阳性（图4中B），检出率为75％。RT-LAMP检测出的3个阳性样品而RT-PCR检测为阴性。另外，所有RT-PCR检测为阳性的样品RT-LAMP检测也呈阳性。

最近的研究表明，甜瓜坏死斑点病毒可以侵染许多国家的大部分葫芦科植物，从而对各国水果和蔬菜产业构成巨大威胁。因此，开发一种方便快捷的MNSV检测方法是极有必要的。与RT-PCR、qRT-PCR和ELISA相比，RT-LAMP在现场应用更为快速，简单，故本方案建立了一种MNSV的RT-LAMP检测方法。RT-LAMP用于MNSV的最佳条件为62℃加热或水浴60分钟。在UV光下加入SYBR Green I后观察扩增产物，RT-LAMP对于检测MNSV是高度特异性的，而没有其他病毒获得扩增产物。检测结果的比较显示，RT-LAMP对MNSV的敏感性比RT-PCR高10³倍，而扩增和检测时间仅为后者的1/3。

为了优化RT-LAMP的反应条件，在之前关于植物病毒的RT-LAMP检测报道中测试了不同的Mg²⁺浓度，结果显示8 mM Mg²⁺在大多数情况下能够满足实验要求，因此一些病毒的RT-LAMP直接使用该浓度进行检测而没有进行优化。然而，4 mM和7 mM Mg²⁺也被报道用于优化的RT-LAMP检测，这可能与病毒的类型和特异性有关。在本方案中，直接使用8 mM Mg^{2 +}并获得了良好的结果。

由于LAMP或RT-LAMP与Mg^{2 +}形成的焦磷酸镁沉淀物可能引起反应溶液变浑浊，因此可以在日光下通过肉眼直接观察，但是结果会受到自然光的强度、反应管的透明度和其他因素的影响。因此大多数RT-LAMP仍通过琼脂糖凝胶电泳或UV光观察来确定，并且本方案也应用相同的判定方式。

总之，本方案开发的一步RT-LAMP检测技术是一种非常有价值的方法，具有大规模应用的潜能，尤其适用于现场对植物病毒的检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.甜瓜坏死斑点病毒的RT-LAMP检测引物对，其特征在于：

外部引物对的核苷酸序列如下：

MNSV-F3：5’- TCGGCTCCGTTTCACCTA -3’，

MNSV-B3：5’- ACTTCCGGTCGACAGCATTA -3’；

内部引物对的核苷酸序列如下：

MNSV-FIP：5’- TGGGGAGGGGGTCTTGTGAATC-ACCGGATCTACTTCCACTGG-3’，

MNSV-BIP：5’- TGCTCATTACGCTGACTCAGCG-CCTCCACGTATTGTCACACG -3’。

2.一种权利要求1中的检测引物对在进行非治疗目的的甜瓜坏死斑点病毒的检测应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于提取待检样品的总RNA，使用含有权利要求1中的检测引物对的反应体系进行扩增反应。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于反应体系为25 μL体系，含有浓度均为10 μM的MNSV-FIP和MNSV-BIP引物各1.6 μL，浓度均为10 μM的MNSV-F3和MNSV-B3引物各0.2 μL，12.5 μL 2×RT-LAMP反应缓冲液，1 μL的8 U /μL的 Bst DNA聚合酶，1 μL 200 U /μL的M-MuLV逆转录酶，1 μL 40 U /μL的 RNasin® RNA酶抑制剂，2 μL RNA模板和不含RNase /DNase的ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于2×RT-LAMP反应缓冲液，含有40 mM Tris-HCl(pH 8.8)、20 mM KCl、20 mM(NH₄)₂SO₄、16 mM MgSO₄、0.2％Triton X-100、2.4 mM dNTP和1.6 M甜菜碱。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于扩增反应条件为62℃、60分钟。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于RNA模板浓度检测限为0.75×10^-5μg/μL。