CN109481481B - 一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法及其应用，属于医药和保健品领域，针对目前用于治疗非酒精性脂肪肝的药物药效有限的技术问题，本发明提供了一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法，包括如下步骤：将柳叶蜡梅叶粉碎后，按照料液比1:(5‑50)(g/mL)加入体积分数为20％‑80％的乙醇溶液，40‑90℃温度下进行回流提取，得到粗提液；粗提液经真空抽滤，获得的滤液经大孔树脂柱层析后，用体积分数为20％‑80％乙醇溶液洗脱收集洗脱液，浓缩蒸干后得到柳叶蜡梅总黄酮提取物。本发明制备获得的总黄酮提取物可用于制备保肝护肝的药品或保健品。
Description
技术领域
本发明属于医药和保健品领域，具体涉及一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法及其应用。
背景技术
脂肪肝在发达国家为排在第一位的肝病，近年来，脂肪肝在中国的发病率不断升高，现在已经成为仅次于病毒性肝炎的第二位肝病。脂肪肝(fatty liver)是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。脂肪性肝病正严重威胁国人的健康，发病率在不断升高，且发病年龄日趋年轻化。正常人肝组织中含有少量的脂肪，如甘油三酯、磷脂、糖脂和胆固醇等，其重量约为肝重量的3％～5％，如果肝内脂肪蓄积太多，超过肝重量的5％或在组织学上肝细胞50％以上有脂肪变性时，就可称为脂肪肝。脂肪肝分为酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFLD)两大类。
NAFLD的发病率呈逐年升高的趋势，NAFLD是以肝脏脂肪异常积累为特征，进而引起肝脏脂肪变性的一种临床综合征。胰岛素抵抗和遗传易感性与其发病关系密切。NAFLD和高血压、糖尿病、脂代谢异常、胰岛素抵抗和肥胖等因素密切相关。老年患者存在肥胖、代谢异常及年龄比较高的特点，成为NAFLD高危人群。
治疗NAFLD的方法有限，主要包括饮食控制、加强体育锻炼等。对于血脂紊乱者可以使用贝特类、他汀类或普罗布考等降血脂药物；或者使用抗氧化药物如维生素E等。上述药物对NAFLD的治疗效果有限，仅能改善NAFLD患者的某些症状。
发明内容
针对目前用于治疗非酒精性脂肪肝的药物药效有限的技术问题，本发明提供了一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法，包括如下步骤：
1)将柳叶蜡梅叶粉碎后，按照料液比1:(5-50)(g/mL)加入体积分数为20％-80％的乙醇溶液，40-90℃温度下进行回流提取，得到粗提液；
2)粗提液经真空抽滤，获得的滤液经大孔树脂柱层析后，用体积分数为20％-80％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸干后得到柳叶蜡梅总黄酮提取物。
进一步地限定，步骤1)所述柳叶蜡梅叶为新叶、老叶或落叶。
进一步地限定，步骤1)所述柳叶蜡梅叶粉碎后经脱脂处理。
进一步地限定，步骤1)所述的将柳叶蜡梅叶粉碎后，按照料液比1:25(g/ml)加入体积分数为75％的乙醇溶液，80℃温度下进行回流提取，得到粗提液。
进一步地限定，步骤2)获得的滤液浓缩至原体积的1/2-1/20，然后再经过大孔树脂柱层析。
进一步地限定，步骤2)所述的大孔树脂柱为DM-130、D101、HPD100、DM301、AB-8或NKA-9型树脂。
进一步地限定，步骤2)所述浓缩蒸干是指在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥得到总黄酮提取物。
本发明还提供了上述制备方法获得的柳叶蜡梅总黄酮提取物在制备缓解或治疗非酒精性脂肪肝药物或保健品中的应用。
进一步地限定，是以柳叶蜡梅总黄酮提取物为活性成分，配合可用于药物或保健品的辅料制成药物或保健品。
更进一步地限定，所述药物或保健品为固体制剂或液体制剂，所述固体制剂为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊；所述液体制剂为口服液或饮料。
有益效果
本发明以柳叶蜡梅叶为原料，制备获得总黄酮提取物，通过柳叶蜡梅叶总黄酮提取物的体内外药效研究，发现了柳叶蜡梅叶总黄酮提取物在病理因素情况存在的情况下，能够提高肝脏的抗氧化损伤能力，维持稳定的肝脏指数，对肝脏具有保护作用，解决了柳叶蜡梅叶对肝脏保护功效未知的技术难题，本发明制备的总黄酮提取物可用于制备保肝护肝的药物或保健食品或保健食品添加剂，扩展了柳叶蜡梅叶的应用领域，助力了相关产业的发展。
本发明所述柳叶蜡梅总黄酮提取物在缓解非酒精性脂肪性肝病时，可以单独使用，也可以与其他药物或保健食品配合同时使用，或者与其他药物或保健食品一起制成复方制剂使用，都可以达到缓解或治疗非酒精性脂肪性肝病的目的。
附图说明
图1柳叶蜡梅叶总黄酮的总还原能力检测，横坐标为柳叶蜡梅叶总黄酮浓度(ug/mL)，纵坐标为510nm下的吸光值(A)。
图2柳叶蜡梅叶总黄酮的清除羟基自由基能力检测，横坐标为柳叶蜡梅叶总黄酮浓度(ug/mL),纵坐标为对羟基自由基的清除率(％)。
图3柳叶蜡梅叶总黄酮的清除超氧阴离子能力检测，横坐标为柳叶蜡梅叶总黄酮浓度(ug/mL),纵坐标为对超氧阴离子的清除率(％)。
图4柳叶蜡梅叶总黄酮对高脂模型小鼠肝匀浆中MDA含量的影响，横坐标为不同组别，纵坐标为MDA浓度(nmol/mg)。
图5柳叶蜡梅叶总黄酮对高脂模型小鼠肝匀浆中SOD活性的影响，横坐标为不同组别，纵坐标为SOD浓度(nmol/mg)。
具体实施方式
本发明所述的大孔树脂的方法如下：
大孔树脂的预处理：树脂先用体积分数95％乙醇浸泡24h充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再以蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用质量分数5％HCl溶液浸泡3h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用质量分数5％NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性。
纯化工艺：取预处理好的大孔树脂装柱，将浓缩后的粗提液上样1-4个BV(柱体积，控制流速1-4BV/h，收集滤液，再将滤液重复上样一次；上样完毕后，用1-10个BV蒸馏水洗除杂质，流速1-4BV/h；最后，用体积分数为20-80％乙醇溶液洗脱，流速为1-4BV/h，收集洗脱液，浓缩蒸干后得到柳叶蜡梅总黄酮提取物。所述浓缩蒸干是指在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥(-20℃～-50℃,12h-48h)得到总黄酮提取物。
下面具体描述本发明所述的柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备以及其功能活性。
实施例1.柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备。
1)将柳叶腊梅新叶粉碎，过200目细筛，根据柳叶蜡梅叶粉重，按照料液比1:2(g/mL)加入石油醚，浸提12h，过滤除去浸提液，称取石油醚脱脂后的柳叶蜡梅叶粉末若干克，按照料液比1:5(g/mL)加入体积分数为20％的乙醇溶液，设定提取温度为60℃，进行回流提取得到粗提液。
2)粗提液经真空抽滤后合并滤液，减压浓缩至原体积的1/8，将浓缩液经过D101型大孔树脂柱(天津海光)进行层析处理，具体方法为：大孔树脂的预处理：树脂先用体积分数95％乙醇浸泡24h充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再以蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用质量分数5％HCl溶液浸泡3h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用质量分数5％NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性。
纯化工艺：取40mL预处理好的大孔树脂装柱(2.0cm X 40.0cm)，将浓缩后的粗提液上样1个BV(柱体积，1BV即40ml)，控制流速4BV/h，收集滤液，再将滤液重复上样一次；上样完毕后，用10个BV蒸馏水洗除杂质，流速2BV/h；最后，用体积分数为40％乙醇溶液洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥(-20℃，12h)得到总黄酮提取物。
以芦丁作为标准品来测定提取物的黄酮总量，所述黄酮的测定方法参考曾永长,梁少瑜,邢学峰,俞励平,罗佳波.白花蛇舌草总黄酮的大孔树脂纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(18):26-29.中“2.2总黄酮测定”所述的方法进行，提取率为3.12％。
实施例2.柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备。
1)将柳叶腊梅新叶粉碎，过200目细筛，根据柳叶蜡梅叶粉重按照料液比1:2(g/ml)加入石油醚，浸提12h，过滤除去浸提液，称取石油醚脱脂后的柳叶蜡梅叶粉末若干克，按照料液比1:25(g/mL)加入体积分数为75％的乙醇溶液，设定提取温度为80℃，进行回流提取得到粗提液。
2)粗提液经真空抽滤后合并滤液，减压浓缩至原体积的1/10，将浓缩液经过DM-130型大孔树脂柱(天津海光)进行层析处理，具体方法为：大孔树脂的预处理：树脂先用体积分数95％乙醇浸泡24h充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再以蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用质量分数5％HCl溶液浸泡3h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用质量分数5％NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性。
纯化工艺：取40mL预处理好的大孔树脂装柱(2.0cm X 40.0cm)，将浓缩后的粗提液上样2个BV(柱体积，2BV即80ml)，控制流速2BV/h，收集滤液，再将滤液重复上样一次；上样完毕后，用3个BV蒸馏水洗除杂质，流速2BV/h；最后，用体积分数为40％乙醇溶液洗脱，流速为2BV/h，收集洗脱液，在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥(-40℃，24h)得到总黄酮提取物。
以芦丁作为标准品来测定提取物的黄酮总量，所述黄酮的测定方法参考曾永长,梁少瑜,邢学峰,俞励平,罗佳波.白花蛇舌草总黄酮的大孔树脂纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(18):26-29.中“2.2总黄酮测定”所述的方法进行，提取率为4.03％。
实施例3.柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备。
1)将柳叶腊梅新叶粉碎，过200目细筛，根据柳叶蜡梅叶粉重按照料液比1:2(g/ml)加入石油醚，浸提12h，过滤除去浸提液，称取石油醚脱脂后的柳叶蜡梅叶粉末若干克，按照料液比1:50(g/mL)加入80％乙醇溶液，设定提取温度为90℃，进行回流提取得到粗提液。
2)粗提液经真空抽滤后合并滤液，减压浓缩至原体积的1/2，将浓缩液经过HPD100型大孔树脂柱(天津海光)进行层析处理，具体方法为：大孔树脂的预处理：树脂先用体积分数95％乙醇浸泡24h充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再以蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用质量分数5％HCl溶液浸泡3h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用质量分数5％NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性。
纯化工艺：取40mL预处理好的大孔树脂装柱(2.0cm X 40.0cm)，将浓缩后的粗提液上样3个BV(柱体积，3BV即120ml)，控制流速3BV/h，收集滤液，再将滤液重复上样一次；上样完毕后，用3个BV蒸馏水洗除杂质，流速1BV/h；最后，用体积分数20％乙醇溶液洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液，在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥(-50℃，12h)得到总黄酮提取物。
以芦丁作为标准品来测定提取物的黄酮总量，所述黄酮的测定方法参考曾永长,梁少瑜,邢学峰,俞励平,罗佳波.白花蛇舌草总黄酮的大孔树脂纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(18):26-29.中“2.2总黄酮测定”所述的方法进行，提取率为2.24％。
实施例4.柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备。
1)将柳叶腊梅新叶粉碎，过200目细筛，根据柳叶蜡梅叶粉重按照料液比1:2(g/ml)加入石油醚，浸提12h，过滤除去浸提液，称取石油醚脱脂后的柳叶蜡梅叶粉末若干克，按照料液比1:25(m/v)加入75％乙醇溶液，设定提取温度为80℃，进行回流提取得到粗提液。
2)粗提液经真空抽滤后合并滤液，减压浓缩至原体积的1/20，将浓缩液经过AB-8型大孔树脂柱(天津海光)进行层析处理，具体方法为：大孔树脂的预处理：树脂先用体积分数95％乙醇浸泡24h充分溶胀后，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再以蒸馏水洗至无醇味。洗尽醇后用质量分数5％HCl溶液浸泡3h，然后用蒸馏水洗至中性；最后用质量分数5％NaOH溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性。
纯化工艺：取40mL预处理好的大孔树脂装柱(2.0cm X 40.0cm)，将浓缩后的粗提液上样4个BV(柱体积，4BV即160ml)，控制流速1BV/h，收集滤液，再将滤液重复上样一次；上样完毕后，用1个BV蒸馏水洗除杂质，流速4BV/h；最后，用体积分数80％乙醇溶液洗脱，流速为4BV/h，收集洗脱液，在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥(-40℃，48h)得到总黄酮提取物。
以芦丁作为标准品来测定提取物的黄酮总量，所述黄酮的测定方法参考曾永长,梁少瑜,邢学峰,俞励平,罗佳波.白花蛇舌草总黄酮的大孔树脂纯化工艺[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(18):26-29.中“2.2总黄酮测定”所述的方法进行，提取率为2.78％。
下面以实施例2制备的柳叶蜡梅叶总黄酮提取物为例，考察柳叶蜡梅叶总黄酮提取物的功能活性。
一、柳叶蜡梅叶总黄酮提取物的体外抗氧化能力
以柳叶腊梅叶总黄酮为原料来进行体外抗氧化活性的研究，采用铁氰化钾还原法对总还原力(图1)的进行测定；对于清除羟基自由基的清除率(图2)测定采用邻二氮菲法；对于清除超氧阴离子的清除率(图3)测定采用邻苯三酚自氧化法。三种体外抗氧化能力测定的具体方法参考郭占京,王勤,黄宏妙,程世贤,周丽霞,尧昊秋.马缨丹挥发油体外抗氧化活性研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(11):235-237.中“2方法”所述方法测定。
由图1可以看出样品的总还原能力与浓度呈现正相关性，总黄酮的总还原力随其浓度的增大而增大。
由图2可看出，总黄酮的羟基自由基清除能力随着浓度的增加而增加，在质量浓度位于50ug/mL左右时清除率达到最大值。
图3结果表明，随着质量浓度的上升对于超氧阴离子的清除率呈现递增趋势。说明柳叶蜡梅总黄酮具有抗氧化活性，可以预测柳叶蜡梅总黄酮在生物体内也具有较强的抗氧化作用。
二、考察柳叶蜡梅叶总黄酮对高脂饲料诱发脂肪肝的防治效果
实验对象：小鼠，6-8周龄，雌雄各半，购自金华市药检所下属实验动物中心。
将小鼠随机分成柳叶蜡梅总黄酮高、中、低剂量组(每次剂量分别为200，100，50mg/kg)、水飞蓟素组(阳性对照组)100mg/kg、模型对照组、空白对照组。每组分为雌雄两组，每小组6只小鼠进行适应性饲养。适应性饲养结束后每日喂养高脂饲料进行造模四周。造模成功后在保持高脂饲料喂养的同时，各实验组每隔1天灌胃1次药物，持续4周，其余组灌胃生理盐水。末次给药后断颈处死小鼠，摘取肝脏，根据肝脏重量加入9倍重量的生理盐水，将肝脏制备成质量分数10％肝匀浆，离心后取上清液于-20℃保存。按照试剂盒说明方法对上清液的MDA含量和SOD活性进行测定。
肝脏指数＝(肝脏湿质量/体质量)×100％；末Lee’s指数＝(体质量×1000)^(1/3)/体长。
由图4可知，与空白对照组相比，模型组小鼠肝组织中MDA含量显著性升高，表示造模成功。与模型组相比，各个剂量实验组的MDA含量均有一定程度降低，且随着剂量的增加降低程度愈明显。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，MDA通过生物膜中的多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，因此检测MDA含量可了解膜脂过氧化的程度。本结果提示柳叶蜡梅叶总黄酮一定程度上防止了肝脏脂质的过度氧化，能够保护肝细胞线粒体功能，抑制细胞内氧化应激，进一步保护了肝脏的正常功能。
实验结果(图5)表明，各给药组和阳性对照组的SOD酶活性都比模型组要高。这说明，无论是阳性药还是柳叶蜡梅总黄酮都能够避免肝脏内SOD酶的活性受到抑制，维持SOD酶的功能，及时清除体内的超氧离子，对脂肪肝和肝损伤有一定的防治作用，使受损的小鼠肝脏的氧化应激状况有所改善，且高剂量组作用较明显。
表1高脂模型小鼠末Lee’s数值和肝脏指数统计
通过表1可知模型小鼠与对照组相比，模型组的Lee’s指数和肝脏指数都有显著升高。Lee’s指数反映的小鼠的肥胖程度；肝脏指数高则表明肝脏有一定病变导致肝脏体积和重量的相对比重增加。在柳叶蜡梅总黄酮的作用下，各给药组小鼠及阳性对照组的肥胖程度和肝脏指数均有一定程度降低，且呈剂量依赖性。说明本发明制备获得的柳叶蜡梅总黄酮对肥胖及脂肪肝有一定的疗效，能够保护高脂饮食导致的肝损伤，抑制肝细胞凋亡及脂质累积。
通过上述实验结果，本发明方法制备的柳叶蜡梅总黄酮提取物可作为活性成分，辅以保健食品领域可接受的辅料制成用于保肝护肝的保健食品。或者，以柳叶蜡梅总黄酮提取物作为活性成分，辅以药学上可接受的辅料制成保肝护肝的药物，缓解或治疗非酒精性脂肪肝。药物或保健品可为固体制剂，如颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂或胶囊；或液体制剂如口服液或饮料。
Claims (4)
1.一种柳叶蜡梅总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将柳叶蜡梅叶粉碎后，按照1:2g/mL的料液比，加入石油醚，浸提12h，过滤除去浸提液，再按照料液比1:25g/mL加入体积分数为75%的乙醇溶液，80℃温度下进行回流提取，得到粗提液；
2）粗提液经真空抽滤，获得滤液，将滤液浓缩至原体积的1/2-1/20后，经大孔树脂柱层析后，用体积分数为20%-80%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，在80℃下进行减压浓缩成浸膏状，后经冷冻干燥得到柳叶蜡梅总黄酮提取物；
所述制备方法获得的柳叶蜡梅总黄酮提取物用于制备缓解或治疗非酒精性脂肪肝药物；所述药物以柳叶蜡梅总黄酮提取物为活性成分，配合可用于药物的辅料制成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）所述柳叶蜡梅叶为新叶、老叶或落叶。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的大孔树脂柱为DM-130、D101、HPD100、DM301、AB-8或NKA-9型树脂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述药物为颗粒剂、片剂、滴丸剂、粉针剂、胶囊或口服液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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