CN109476726A - 在治疗HvG病中使用的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了融合蛋白，用于在接受了移植物的患者中治疗HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。所述融合蛋白适用于在HLA‑A*02或SLA‑01*0401阴性的接受体(recipient)患者中抑制含有或表达HLA‑A*02或SLA‑01*0401的移植物的免疫排斥，即，移植前的患者不表达HLA‑A*02或SLA‑01*0401。融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，其在调节性T细胞(Treg)中表达后，在HLA‑A*02或SLA‑01*0401存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物(suppressor)活性。

Description

在治疗HvG病中使用的融合蛋白
本发明涉及融合蛋白，其用于治疗接受了移植物的患者中的HvG病，用于抑制宿主的针对移植物的免疫应答。融合蛋白适用于在HLA-A*02阴性的接受体(recipient)患者中抑制含有或表达作为人HLA-A*02的MHC I类分子的移植物的免疫排斥，即移植前的患者不表达HLA-A*02，或融合蛋白适用于抑制含有或表达作为猪SLA-01*0401(猪白细胞抗原01*0401)的MHC I类分子的移植物的免疫反应。融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401)，其在调节性T细胞(Treg)中表达后分别在HLA-A*02的存在下或在SLA-01*0401的存在下引起调节性T细胞的特异性抑制物活性。本发明的CAR-A*02和CAR-SLA-01*0401的优点是抑制物活性限于移植物并且导致移植物内细胞毒性T细胞的抑制，包括针对分别表达HLA-A*02或SLA-01*0401的移植物的细胞毒性T细胞。移植是一种实体组织。
融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域(scFv)、经修饰的hCD8铰链、hCD8跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导域，它们优选从N端到C端彼此连接，更优选从N端到C端彼此直接连接。
尤其在CAR-SLA-01*0401中，融合蛋白可以含有hΔFc IgG域作为经修饰的hCD8铰链的备选，和/或融合hCD28跨膜域-hCD28/CD3zeta域作为hCD8跨膜域的备选，胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导域。
此外，本发明涉及编码CAR融合蛋白的核酸序列，优选包含在病毒载体中，例如，在5'LTR和3'LTR之间，核酸序列更优选包含在适于转导Treg细胞的病毒颗粒中。其中，优选包含在病毒颗粒中的核酸序列和病毒载体用于治疗宿主抗移植物(HvG)病。根据本发明，HvG病的治疗通常是抑制针对移植的移植物的细胞毒性T细胞活性。
此外，本发明涉及用于引入分别对HLA-A*02或SLA-01*0401特异性的抑制物活性的体外方法，其通过在Treg细胞中表达根据本发明的融合蛋白，例如，通过将编码融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列导入Treg细胞中进行，所述Treg细胞通常不含或不表达HLA-A*02或SLA-01*0401，优选地，Treg细胞对患者是同基因的(homogeneic)，例如从患者的活组织检查中获得并分离。本发明提供了治疗HvG病的方法，其包括对患者施用表达本发明的融合蛋白CAR-A*02或融合蛋白CAR-SLA-01*0401的Treg细胞。
现有技术
MacDonald et al.,The Journal of Clinical Investigation 1-12(2016年3月22日)描述了具有对HLA-A2特异性的scFv域的通用CAR，以及转导用于表达CAR以进行HLA-A2特异性抑制的调节性T细胞。scFv域含有单克隆抗体BB7.2的重链和轻链可变区。除scFv外，CAR还含有CD28跨膜域、CD28信号传导域和CD3ζ信号传导域。
Inaguma et al.,Gene Therapy 575-584(2014)描述了可用于使T淋巴细胞针对表达特定蛋白质的肿瘤细胞的T细胞受体的构建，包括分离当在HLA-A2复合物中结合时对肿瘤特异性蛋白具有特异性的抗体scFv，以及使用scFv作为合成T细胞受体中的域。
Noyan et al.,Cancer Gene Therapy 19,352-357(2012)描述了通过慢病毒转导在造血干细胞和祖细胞中诱导的转基因表达，用于治疗实体瘤。
Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)描述了用于通过逆转录病毒颗粒转导细胞的转座酶的细胞毒性效应。
DiStasi et al.,N Engl J Med 1673-1683(2011)描述了通过引入编码胱天蛋白酶-9二聚体的序列以产生细胞中可诱导凋亡的系统来进行遗传操作。
Long et al.,Diabetes,407-415(2010)描述了用于测量IL-2R的信号传导途径中的STAT5磷酸化的测定法。
Hombach et al.,Gene Therapy 1206-1213(2010)描述了用于使T细胞针对特定抗原的CAR，所述CAR在scFv和跨膜域之间含有经修饰的IgG1Fc间隔物，所述跨膜域与信号传导域附着(CD28-CD3ζ)。
发明目的
本发明的目的是提供用于治疗HvG病的嵌合抗原受体CAR，其适于为Treg细胞提供对MHC I类，特别是对HLA-A*02或对CAR-SLA-01*0401的抑制物活性，其足够强以抑制表达MHC I类，例如HLA-A*02或SLA-01*0401的移植物的细胞毒性排斥，尤其是在HLA-A*02阴性的接受体患者中。
发明详述
本发明通过权利要求的特征实现了该目的，尤其是通过提供融合蛋白进行，所述融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，尤其是含有对人HLA-A*02特异性的scFv域的CAR-A*02或含有对猪SLA-01*0401特异性的scFv域的CAR-SLA-01*0401，所述CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401用于治疗HvG病，例如用于治疗移植物接受体患者中的细胞毒性排斥反应。当CAR-A*02在人Treg细胞中在人HLA-A*02存在下表达时CAR-A*02提供细胞毒性T细胞的抑制。当在人Treg细胞中表达时CAR-A*02和表达CAR-A*02的人Treg细胞是用于治疗HvG病的药物化合物。相应地，当在人Treg细胞中表达时CAR-SLA-01*0401和表达CAR-SLA-01*0401的人Treg细胞是用于治疗HvG病的药物化合物，此时移植的组织是猪来源的并表达SLA-01*0401。在移植接受体的Treg细胞中表达后，CAR-SLA-01*0401具有抑制针对猪来源的移植物的HvG的优点。猪来源的移植物可以是例如胰腺组织，优选是胰岛。
任选地，表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞经遗传操作以也表达FOXP3，优选组成性表达FOXP3，例如通过与导入编码CAR-A*02的核酸序列同时将编码人FOXP3的表达盒导入Treg细胞中。进一步任选地，除了为了表达FOXP3的Treg细胞的遗传操作之外或作为为了表达FOXP3的Treg细胞的遗传操作备选，在表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401之外还可以遗传操作Treg细胞以表达胱天蛋白酶-9个二聚体系统(例如，如DiStasiet al.,N Engl J Med 1673-1683(2011)所述)，用于在转移到患者中后耗尽Treg细胞。
FOXP3分别与融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的表达可以通过在一个统一的融合蛋白中表达P2A与C端融合的FOXP3的融合物，例如直接与CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的C端融合。此类融合物(例如由适于产生编码CAR-P2A-FOXP3融合蛋白的一个统一mRNA的一个表达盒编码)通过其从P2A域水解产生游离FOXP3。P2A-FOXP3的示例性融合物是SEQ ID NO:22，其可以直接与融合蛋白的hCD3ζ域的C端融合。
CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401分别是融合蛋白，所述融合蛋白包含下列各项或由下列各项组成：单链可变片段抗体域(scFv)、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内CD3信号传导域，也称为hCD3ζ(hCD3zeta)域，所述域优选地从N端到C端彼此直接连接。在scFv域中，抗体的可变轻链通过铰链区连接至抗体的可变重链。CAR-A*02的特征在于选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中之一的氨基酸序列的其scFv域，CD8铰链和CD8跨膜域，优选具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，CD28信号传导域，优选具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，和CD3信号传导域，具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。CAR-SLA-01*0401的特征在于选自SEQID NO:16至SEQ ID NO:19中之一的氨基酸序列的其scFv域。由于根据本发明的信号传导域具有人或人源化氨基酸序列，因此这在本文中也用“h”指示。铰链可以由hΔFcIgG域形成，优选地由SEQ ID NO:20形成。可以用CD8跨膜域、hCD28信号传导域和hCD3ζ信号传导域交换hCD28跨膜域、hCD28信号传导域和hCD3ζ信号传导域，优选SEQ ID NO:21的融合物。
CAR-A*02融合蛋白具有的优点在于它对HLA-A*02是高度特异的。CAR-SLA-01*0401融合蛋白具有的优点在于它对SLA-01*0401是高度特异性的。其在Tregs中的表达分别导致在HLA-A*02或SLA-01*0401存在下Treg增殖的增强，并导致增加的Teff(效应T细胞)抑制物活性。
融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401可以在Treg中从表达盒中编码融合蛋白的核酸序列表达。任选地，编码融合蛋白CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的表达盒包含在病毒载体中以导入核酸序列，例如，通过使用含有病毒载体的病毒颗粒进行转导。
对于体外产生表达CAR-A*02的Treg细胞，优选使用源自移植物接受体的Treg细胞，所述移植物接受体可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。Treg细胞是CD4+，CD25高和CD127低，并且必须从HLA-A*02阴性患者中分离，例如，通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用FACS或具有特异性抗体的磁珠。对于体外产生表达CAR-SLA-01*0401的Treg细胞，优选使用源自移植物接受体的Treg细胞，其可以是未来的接受体或接受了移植物的接受体。Treg细胞是CD4+，CD25高和CD127低，并且必须分离，例如通过细胞分选从血液样品中分离，例如使用FACS或具有特异性抗体的磁珠。
表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞的优点在于在引入患者之前和分别在引入编码CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列之后，在将这些Treg细胞导入患者中之前不必需体外扩增。例如，在生产这些Treg细胞的过程中，不进行包括在培养基中在刺激剂的存在下培养这些Treg细胞的体外扩增。优选地，在引入编码CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的核酸序列后，将Treg细胞保持培养约24小时以允许表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401，然后进行细胞分选以分离表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞。在该培养物中，培养基中不存在用于扩增的刺激剂，例如没有抗CD3或抗CD28抗体。在该培养物中，培养基含有低剂量的IL-2，例如以50U/mL培养基，以防止Treg细胞死亡。已经发现表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞有效迁移至移植物并且有效抑制针对移植物的细胞毒性应答并且表达CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的Treg细胞具有稳定的抑制活性。
CAR-A*02的scFv域对HLA-A*02是非常特异的，并且迄今未发现交叉反应性或脱毒性。此外，没有发现CAR-A*02的内在活性或自身活化，排除了不依赖于HLA-A*02存在的抑制活性。发现表达CAR-A*02的Treg细胞的抑制活性明显高于幼稚Treg(nTreg)细胞的抑制活性。
可以通过将CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401的编码序列在接触具有HLA-A*02或SLA-01*0401的供体前导入源自供体的Treg细胞，或者在接触HLA-A*02或SLA-01*0401的供体后导入源自供体，例如源自移植后的移植物接受体的Treg细胞中在用于产生在HLA-A*02或SLA-01*0401的存在下具有抑制活性的Treg细胞的方法中使用CAR-A*02或CAR-SLA-01*0401。
通常优选地，融合蛋白在其N端包含用于分泌融合蛋白的前导肽，以促进scFv域的跨膜转运和跨膜(TM)域在细胞膜间的排列。示例性前导序列是SEQ ID NO:24，优选用于CAR-A*02，或SEQ ID NO:25，优选用于CAR-SLA-01*0401。
现在参考附图通过实施例更详细地描述本发明，其中
-图1a示意性显示了适用于Treg细胞的逆转录病毒转导的编码根据本发明的CAR-A*02的核酸构建体，
-图1b显示了在细胞膜中排列的CAR-A*02的示意性模型，
-图1c显示FACS结果，指示细胞表面上CAR-A*02和比较对照CAR的表达，
-图1d显示FACS结果，指示经转导的Treg表达CAR-A*02并特异性结合HLA-A*02，
-图1e显示FACS结果，指示用CAR-A*02转导的Tregs不与HLA-A*01结合，
-图1f显示了表面表达的FACS结果和对照CAR对PE的特异性，
-图2a显示了未转导的Treg细胞和表达CAR-A*02的Treg细胞的CCR7,CD39,CD45RO,CD45RA,CTLA-4的FACS结果，
-图2b显示表达CAR-A*02的Treg细胞和未转导的Treg细胞的STAT5磷酸化的FACS结果，
-图2c显示了代表响应IL-2浓度的STAT5磷酸化的图，
-图3a显示响应刺激细胞的表达CAR-A*02的Treg细胞活化的FACS结果，
-图3b显示了响应特定刺激的表达CAR-A*02或对照CAR的Treg细胞的增殖和CD39表达的FACS结果，
-图3c显示了在不同细胞比率下表达CAR-A*02的Treg细胞抑制T-效应细胞的图，*＝P<0.05，**＝P<0.01，
-图4a显示体内MLR中抑制物活性的结果，
-图4b显示了在Treg细胞中使用CAR-A*02表达的动物移植实验的分析图，以及
-图4c显示了在Treg细胞中使用CAR-A*02表达的动物移植实验的FACS结果，
-图5a示意性显示了适合于Treg细胞的逆转录病毒转导的编码根据本发明的CAR-SLA-01*0401的核酸构建体，其含有与P2A-FOXP3和另外的编码ΔLNGFR作为报告肽的另外的IRES的任选融合，
-图5b显示了在细胞膜中排列的CAR-SLA-01*0401的示意性模型，
-图5c显示了用于CAR-SLA-01*0401表面表达的SC-1细胞的FACS结果，
-图5d显示用于用编码图5a的融合物的核酸构建体转导后表达FOXP3的SC-1细胞的FACS结果，
-图6显示用标记的可溶性scFv染色的人和猪PBMC的FACS结果，
-图7显示了经转导以表达CAR-SLA-01*0401的杂交瘤细胞的FACS结果，分析了NFAT信号传导。
通常，显示的FACS结果代表三个独立实验。
实施例1：编码CAR-A*02的逆转录病毒载体和表达CAR-A*02的细胞
通过使用表达抗HLA-A*02抗体的噬菌体展示文库的对HLA-A*02的亲和选择产生CAR-A*02的scFv域。从输血后已经形成A*02反应性抗体的患者克隆抗HLA-A*02(在EBI可获得的重链核苷酸序列：AF163303；轻链：AF163304)。
因此，与初始克隆的抗HLA-A*02抗体相比，可以分离出对HLA-A*02具有显著增加的亲和力的抗体。
克隆scFv域的编码序列以产生一个融合蛋白的编码序列，其从N端至C端含有可变轻链、接头、可变重链、hCD8铰链域、hCD6跨膜域、hCD28胞内信号传导域和hCD3ζ胞内信号传导域。将编码序列克隆到逆转录病毒载体的5'-LTR和3'-LTR之间，其在CAR-A*02的此编码序列和3'-LTR之间另外含有在充当启动子的IRES(内部核糖体进入位点)元件的控制下作为报告物蛋白的非信号转导表面分子ΔLNGFR(截短的低亲和力神经生长因子)的编码序列。除了其作为表达CAR-A*02的报告物的功能外，此类报告物还可用于分离经转导的细胞，例如通过使用对报告物特异性并与载体，例如与磁珠偶联的抗体的亲和分离。
为了转导，将编码CAR-A*02的核酸序列克隆到γ-逆转录病毒LTR驱动的表达载体中。
使用抗CD271抗体(C40-1457，Becton Dickinson)通过流式细胞术检测报告物ΔLNGFR。
为了引入编码CAR-A*02的核酸序列，在逆转录病毒载体中含有报告物，例如ΔLNGFR，产生含有载体的病毒颗粒，如Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)所描述。在分离认为是nTreg细胞的Treg细胞后，用平板结合的抗CD3抗体(OKT-3,5μg/mL)和完全培养基中的可溶性抗CD28抗体(CD28.2，从BioLegend获得，5μg/mL)刺激这些达48小时。在转导之前，将硫酸鱼精蛋白(4μg/mL，从Sigma获得)加入Treg培养物中。用编码CAR-A*02或对PE特异性的对照CAR的逆转录病毒颗粒在31℃以700xg旋转感染Treg细胞1.5小时。
在用对照CAR的表达载体转导后，SC-1细胞可以通过抗CD271抗体对ΔLNGFR进行免疫染色，并使用抗-IgG-Fab(从Jackson Lab获得)对scFv染色，证明对照CAR的表面表达和对照CAR对PE的识别。尽管SC-1细胞不表达FOXP3或B220，但它们用缀合有PE的抗体染色呈阳性。
用以下抗体组合使用FACS从人PBMC分离人Treg细胞：抗CD8(HIT8a，从BioLegend获得)、抗CD4(RPA-T4，从Becton Dickinson获得)、抗CD25(M-A251，从Becton Dickinson获得)、抗-CD127(hIL-7R-M21，从Becton Dickinson获得)，导致以至少90％的纯度分离CD8-CD4+C25高、CD8-CD4+C25高CD127低Treg。在伦理批准和个人书面知情同意后，自不同HLA分型健康供体通过Ficoll-Paque Plus(从GE Healthcare获得)上的密度梯度离心产生PBMC制备物。
如Galla et al.,Nuc.Ac.Res.39,1721-1731(2009)所述转导Treg细胞。
通常，所有T细胞培养物和所有T细胞相关测定法都在37℃和5％CO2的潮湿培养箱中在完全培养基(RPMI 1640GlutaMax-I(从Gibco获得)，补充有10％胎牛血清(FBS)(从Gibco获得)、1％青霉素和链霉素(从Biochrom获得)、0.05mMβ-巯基乙醇(从Gibco获得)、20mM HEPES(从Gibco获得)、1％丙酮酸钠(从Gibco获得)和500IU/mL IL-2(Proleukin，从Novartis获得)中进行。对于支原体，对所有细胞系测试呈阴性。
图1a显示了CAR-A*02的核酸构建体的排列，包含在IRES元件控制下的报告物ΔLNGFR的编码序列，侧翼有γ-逆转录病毒载体的5'-LTR和3'-LTR。通常，Treg细胞中膜结合蛋白的表达(例如在与CAR-A*02的编码序列连接的IRES的控制下，优选在病毒载体中)可以通过针对膜结合蛋白的亲和分离用于分离经遗传操作的Treg细胞。此类膜结合蛋白的一个例子是ΔLNGFR。
图1b显示了CAR-A*02的模型，所述CAR-A*02具有其跨越细胞膜的跨膜域和外细胞表面上排列的scFv和胞质溶胶内排列的胞内信号传导域。
使用杂交瘤细胞的转导测试细胞表面上融合蛋白的膜锚定表达。简言之，用编码CAR-A*02或阴性对照融合蛋白的逆转录病毒载体转导杂交瘤细胞。通过与各种HLA-A*02阳性或HLA-A*02阴性人PBMC(外周血单个核细胞)接触来刺激经转导的杂交瘤细胞。与经转导的杂交瘤细胞共培养20小时并照射(30Gy)。对于ΔLNGFR的特异性染色，使用抗CD271抗体C40-1457(从Becton Dickinson获得)，对于CAR-A*02的特异性染色，使用单克隆抗体(mAb)抗-IgG-F(ab)(从Jackson Labs获得)。通常使用流式细胞仪FACSCalibur(BectonDickinson)或LSRII(Becton Dickinson)使用FACSDiva软件和FlowJo软件(Tree StarInc.)通过流式细胞术进行分析。对于统计分析，使用GraphPad Prism 5.0版。
图1c显示了初始杂交瘤细胞(未转导的)中经转导的杂交瘤细胞表面上的报告物ΔLNGFR的表达和定位，仅对ΔLNGFR(对照CAR)染色，以及对CAR-A*02(A2-CAR)染色。结果显示报告物ΔLNGFR和CAR-A*02两者均在经转导的杂交瘤细胞的表面上表达。
通过逆转录病毒载体转导从HLA-A2*阴性的人(HLA-A*02阴性供体)分离的Treg细胞(CD4+CD25高CD127低)以表达CAR-A*02和报告物ΔLNGFR。为了染色，使用展示丙型肝炎病毒肽的HLAI四聚体(HLA-A1-CMV五聚体，从ProImmune以pp65获得)。
图1d的FACS结果显示经转导的细胞用HLA A*0201(A*0201，从Beckman coulterImmunomics，San Diego，USA获得)四聚体染色。
图1e的FACS结果显示经转导以表达CAR-A*02和报告物ΔLNGFR的来自HLA-A2*阳性的人(HLA-A*02阳性供体)的Treg细胞不用A*01四聚体染色。
图1的结果显示CAR-A*02在经转导的Treg细胞的表面上表达，并且它特异性识别HLA-A*02四聚体，例如，不识别HLA-A*01四聚体。此外，发现A*02四聚体的特异性染色不依赖于与A*02四聚体结合的肽。
作为阴性对照CAR，在相同表达载体中编码含有对藻红蛋白(PE)特异性的scFv替换对HLA-A*02特异性的scFv，但在其他方面相同的融合蛋白。为了确定对照CAR的表面表达和特异性，根据Noyan et al.,Cancer gene therapy19,352-357(2012)转导SC-1细胞，对鼠白血病病毒缺乏宿主范围限制的胎儿小鼠胚胎细胞(ATCC CRL-1404)。使用用于胞内Foxp3染色的eBioscience Fix/Perm试剂盒，根据制造商的用法说明，通过使用几种缀合有PE的蛋白质和缀合有PE的抗体评估对照CAR对藻红蛋白(PE)的特异性：鼠B220-PE(RA3-6B2，从Caltag获得)，鼠Foxp3-PE和鼠Foxp3-PacBlue(FJK-16s，从eBioscience获得)。
图1f的FACS结果显示阴性对照CAR在细胞表面上表达并且识别PE。
使用从HLA-A*02阴性供体获得的Treg细胞分析表达CAR-A*02的Treg细胞的表型，以防止转导后Treg细胞自身激活CAR-A*02。此种情况接近HLA-A*02阴性接受体中的情况。发现转导确实基本上不影响nTreg表型，在经CAR-A*02转导的Treg细胞和未转导的nTreg细胞中显示相似水平的效应分子CTLA-4和CD39，并且需要相似百分比的CD45RA+幼稚Treg细胞和相似的CCR7表达以将细胞归巢至次级淋巴样器官。对于染色，使用抗体抗CD39(A1，从BioLegend获得)、抗CD45RA(HI100，从Becton Dickinson获得)、抗CD45RO(UCHL1，从BioLegend获得)、抗CCR7(3D12，从Becton Dickinson获得)、抗-CTLA-4(BNI3，从BectonDickinson获得)、抗FoxP3(PCH101，从eBioscience获得)。图2a显示了这些FACS结果。对于用PE特异性对照CAR转导的Treg细胞，发现相同的表型。
对于来自相同实验的用CAR-A*02转导的Treg细胞和非转导的nTreg，以IL-2的不同剂量，使用FACS(如Long et al.,Diabetes,407-415(2010)中描述的方法，使用从BectonDickinson获得的抗pSTAT5抗体(pY694,47/SAT5))测量STAT5磷酸化。图2b中描绘了FACS结果，显示了这两种Treg细胞都已经在培养物中nTreg存活所必需的低剂量IL-2下显示高水平的STAT5磷酸化。与未转导的细胞相比，用CAR-A*02转导的Treg细胞显示更高的基线和略高的最大STAT5磷酸化水平。图2c的图比较了与IL-2剂量相关的STAT5磷酸化水平。没有观察到IL-2信号传导的缺陷。这些结果显示转导Treg细胞以表达CAR-A*02不显著影响STAT5磷酸化，指示这些转导细胞的归巢能力没有受损。
为了分析经CAR-A*02转导的细胞的功能，用CAR-A*02转导稳定表达含有NFAT敏感性IL-2启动子以控制GFP表达的报告物构建体的T细胞杂交瘤。为了在FACS分析中检测CAR表达，检测报告物ΔLNGFR，以GFP(绿色荧光蛋白)的表达检测NFAT刺激。
如图3a所示，发现经CAR-A*02转导的细胞(A2-CAR)在转导后未显示任何NFAT活化，也未显示GFP的相关表达，但NFAT活化和GFP表达通过与充当刺激细胞的HLA-A*02+PBMC共培养但不响应HLA-A*02-PBMC而强烈上调。非转导的(未转导的)T细胞杂交瘤和用ΔLNGFR(对照CAR)转导的细胞未显示对HLA-A*02阳性和HLA-A*02阴性PBMC刺激细胞的反应。此结果指示根据本发明的CAR-A*02具有激活NFAT所必需的信号转导的能力。由于杂交瘤不表达任何内源性T细胞受体(TCR)，观察到的信号转导完全由CAR-A*02的信号传导引起。
当用CAR-A*02转导HLA-A*02阴性供体Treg细胞时，区分通过CAR或通过TCR的信号传导将更加困难，这是因为这些nTreg细胞中的8-12％将具有也识别HLA-A*02的TCR。因此，使用在含有报告物构建体的T细胞杂交瘤中的表达，针对呈现各种MHC I和MHC II等位基因的广泛的人PBMC组测试CAR-A*02。通过流式细胞术分析GFP表达。结果显示，在杂交瘤中表达后，CAR-A*02(HLA-A2CAR)识别所有HLA-A*02阳性供体样品，而没有与HLA-A*02阴性血液样品的任何交叉反应性。为了比较，使用对PE特异性的对照CAR(无关CAR)。结果总结在下表中，其中对于编号的样品(人PBMC)在每行中指示单独的HLA-A和HLA-B，并且X表示GFP表达：
在与血液样品共培养后表达对照CAR的杂交瘤细胞对于任何HLA不表达GFP(-)。这证明了根据本发明的CAR-A*02对HLA-A*02的高特异性，显示出低的或缺乏的非特异性或脱靶活性。
使用HLA-A*02阳性PBMC作为刺激细胞测试当根据本发明的CAR-A*02在人HLA-A*02阴性Treg细胞中表达时激活它的效果。基于CFSE稀释测定法分析表达CAR-A*02的Treg细胞的增殖，对于CFSE稀释测定法，Treg细胞用CFSE(5mM，从Invitrogen获得)标记。对于表达CAR-A*02的HLA-A*02阴性Treg细胞，通过与经辐照的(30Gy)HLA-A*02阳性PBMC(刺激细胞)共培养使用多克隆刺激，所述HLA-A*02阳性PBMC也与5mM APC细胞增殖染料(eFluor 670，从eBioscience获得)以1:4比率接触。对于经转导以表达对照CAR(对PE特异性)的人HLA-A*02阴性Treg细胞，通过针对TCR的抗CD3/抗CD28进行刺激。对于Treg活化测量使用抗CD39抗体(A1，BioLegend)的CD39检测，并且对于增殖检测CFSE。为了比较，进行增殖细胞的CFSE稀释的FACS分析。图3b中描绘了FACS结果，显示了CAR-A*02被HLA-A*02阳性PBMC强烈激活，导致强烈增殖和CD39效应分子的上调。此效果比在表达对照CAR的活化Treg细胞中强得多。表达对照CAR的Treg细胞可能经由其异种特异性TCR激活，因为这在所有nTreg细胞的高达12％上找到。在使用作用于TCR的抗CD3和抗CD28抗体的组合激活后也发现CD39的上调。这些数据指示，表达根据本发明的CAR-A*02的Treg细胞可以经由CAR-A*02或经由TCR同样良好地激活。
假定在转移到患者中后表达根据本发明的CAR-A*02的Treg细胞的高增殖能力支持它们的效应，例如，它们的小生境填充(niche filling)能力。
实施例2：体外CAR-A*02的抑制物活性
通过测定针对HLA-A*02阳性CD1c刺激物细胞的同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制来测试表达实施例1的CAR-A*02的Treg细胞的抑制物活性。应答细胞是CFSE标记的(5mM)分离的CD4+CD25-效应T细胞，其在各种比率的同基因HLA-A1CD4+CD25+CD127低Treg(nTreg)细胞或表达CAR-A*02的同基因Treg细胞存在下与分离的HLA-A*02CD1c+细胞共培养5天。经由CFSE稀释测定法，基于Treg/Teff比率计算同基因效应T细胞增殖的抑制。为了比较，使用来自相同转导实验的未转导的nTreg细胞。
图3c中描绘了结果，显示了与未转导的Treg细胞(nTregs)相比，表达CAR-A*02的Treg细胞(A2-CAR Tregs)有力得多地抑制异种特异性效应T细胞的增殖。表达CAR-A*02的Treg细胞在测试的表达CAR-A*02的Treg/效应T细胞的几乎所有比率都是更有力的抑制物。即使表达CAR-A*02的Treg/效应T细胞的比率(比率Treg/Teff)为1:64，也观察到超过60％的抑制，证明由CAR-A*02融合蛋白赋予的强烈的抑制活性。
为了分析通过CAR-A*02在Treg细胞中的信号传导的后果，通过在非活化的且表达CAR-A*02的Treg细胞中的深度测序制备包含1149个基因的转录物组分析，并且与对非转导的Treg细胞获得的结果比较。表达CAR-A*02的Treg细胞(CD4+CD25高CD127低)用经照射的(30Gy)HLA-A*02+PBMC作为刺激细胞通过共培养36小时活化。作为对照，未转导的Treg细胞未经处理或经由它们的TCR通过组合的抗CD3/抗CD28抗体刺激48小时。刺激后，使用MicroRNeasy试剂盒(从Qiagen获得)分离RNA，在Agilent Technologies 2100生物分析仪上测量总RNA的质量和完整性。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒v2(从Illumina获得)进行mRNA纯化，然后使用ScriptSeq v2RNA Seq文库制备试剂盒(从Epicenter获得)根据制造商的方案从100ng总RNA产生RNA测序文库。使用TruSeq SBS试剂盒v3-HS(50个循环，单端运行)在Illumina HiSeq2500装置上以每个RNA样品的3x 107个读出的平均值对文库进行测序。使用具有默认设置的开源短读段比对器STAR将读出与参考基因组hg19比对。比对后每个基因的读出通过称为Rsubread的R包的feature.count函数完成。对于原始计数数据的log2转换，随后是差异表达基因的数据标准化和统计确定，使用称为edgeR的R包。
发现经CAR-A*02转导的Treg细胞和未转导的Treg细胞具有非常相似的活化和下调转录物模式，支持经由CAR-A*02的信号传导与经由TCR的信号传导导致Treg细胞中的相当的转录概况。与未激活状态相比，CAR-A*02或TCR的激活分别导致转录概况的急剧变化，但这两种激活状态的转录概况彼此相似。对涉及Treg细胞功能及其归巢的特定基因的分析揭示了细微的差异。CAR-A*02活化的Treg细胞表达更高量的IL-4，IL-5和IL-10，但是略低的CTLA4和IL-2R转录物数目。这些降低的转录物水平对CTLA4蛋白表达没有明显的后果(图2a)，也没有IL-2信号传导的明显后果(图2b，2c)。
实施例3：体内CAR-A*02的抑制物活性
作为体内抑制物活性的实例，非重构(non-reconstituted)的人源化非肥胖糖尿病(NOD)-RAG1无效IL2γ无效(NRG)小鼠接受5x 104个来自HLA-A*02阴性供体的CD4+CD25+CD127低人Treg细胞(所述Treg细胞用编码根据实施例1的CAR-A*02的逆转录病毒载体转导)或用实施例1的对照CAR(对PE特异性)转导的相同Treg细胞或未转导的Treg细胞。作为移植组织的实例，用混合的5x105个经照射的同基因HLA-A*01PBMC和同种异体经照射的HLA-A*02PBMC作为体外MLR对小鼠注射到每个耳廓中。
这些实验以盲法方式进行。为了确定抑制物活性，使用弹簧加载的数字测厚仪(thickness gauge)测量耳肿胀。图5a显示了耳肿胀的结果，以注射前和注射后24小时的耳厚度之间的差异计算，每个值与作为内部对照的尚未用Treg细胞注射的动物的另一只耳中观察到的耳肿胀相关。
图5a中描绘了结果，显示与表达对照CAR的Treg细胞(对照CAR Tregs)相比和与未转导的Tregs(CD4+CD25高Tregs)相比，对表达CAR-A*02的Treg细胞(A2-CAR Tregs)的同种异体混合淋巴细胞反应的显著更强的抑制。
在另一个实验中，在免疫重构的NRG小鼠中分析抑制物活性。目前，在此类小鼠中测试移植物排斥是困难的，因为在免疫活性小鼠中，同种异体皮肤移植物在10天内被排斥，而人源化NRG小鼠中的类似排斥在移植后第30天未发生。在此晚期时间点，异种移植物抗宿主应答在免疫重建后已经变得明显。为了避免除GvHD反应之外的其他作用，使用严格的排斥模型，其中同种异体移植的细胞到通过注射的移植后的第5天被完全排斥。使用注射的同种异体移植细胞具有额外的优点，即由于免疫应答在脾中开始，将Treg细胞归巢至移植组织不应起主要作用，因此避免了人源化小鼠中受扰乱的归巢的可能效应。
作为Treg细胞，使用用根据实施例1的CAR-A*02转导的CD4+CD25+CD127低人Treg细胞，或用实施例1的对照CAR(对PE特异性)转导的相同Treg细胞，或未转导的Treg细胞。在通过在来自下颌骨静脉的外周血样品中表达人CD8和人CD4重建后14小时，通过FACS监测免疫重建。从实验中排除没有可察觉的人CD8和CD4T细胞重建的动物。免疫重建后第14天，给小鼠静脉内注射5x 105个用CFSE标记的同基因PBMC和5x 105个用APC增殖染料标记的HLA-A*02PBMC作为同种异体阳性靶细胞。同时，不同的动物接受5x 104的不同Treg细胞，其是表达CAR-A*02(加A2-CAR Tregs)或对照CAR(加对照CAR Tregs)或未转导(加nTregs)的Treg。注射后5天，处死小鼠并分析血液和脾细胞的同种异体靶物和同基因供体细胞，并与未接受Treg细胞的动物(无添加的Tregs)中获得的那些进行比较。同基因和同种异体细胞的标记允许评估动物中同种异体靶细胞的相对杀伤，因为这两种细胞群均以1:1的细胞比率注射。
图5c中描绘了代表性的FACS结果，显示在免疫活性小鼠中，移植后120小时不再检测到同种异体靶细胞，这对应于非人源化小鼠中同种异体组织的快速排斥。注射表达对照CAR的Treg或未转导的Treg在预防同种异体靶细胞的杀伤方面具有小的效应，表达CAR-A*02的Treg细胞的转移完全阻止了同种异体靶细胞的排斥。
实施例4：CAR-SLA-01*0401的表达
含有对猪SLA-01*0401具有特异性的scFv的融合蛋白CAR-SLA-01*0401从根据图5a的核酸构建体表达，所述核酸构建体从5'至3'编码彼此相邻的用于分泌的前导肽(SEQID NO:25)、对MHC I类特异性的scFv、作为优选铰链的hΔFc IgG域、作为跨膜域的hCD28TM域、hCD28、hCD3ζ、P2A、FOXP3、IRES和作为报告物的ΔLNGFR。其中，将P2A排列成使得表达后，FOXP3被切除并且可以移位到核中。scFv和铰链形成胞外(EC)部分，TM域形成跨膜部分，并且hCD28和hCD3ζ以及任选的P2A和FOXP3形成胞内(IC)部分。此外，报告物ΔLNGFR是胞内的。从相同的核酸构建体表达报告物，指示其存在，但作为单独的蛋白质存在。
图5b在模型中显示了CAR-SLA-01*0401的排列，所述CAR-SLA-01*0401具有其跨越细胞膜的跨膜域和在外细胞表面上排列的scFv和在细胞质内排列的胞内信号传导域。
用核酸构建体分开转导Sc1细胞，所述核酸构建体编码根据图5a的融合蛋白：前导物、scFv、SEQ ID NO:20的hΔFc IgG域、hCD28TM域、与其融合的hCD28信号传导域和与其融合的hCD3ζ，序列为SEQ ID NO:21(the hCD28TM domain fused to the hCD28signallingdomain and fused to hCD3ζof SEQ ID NO:21)、任选的SEQ ID NO:22的P2A-hFOXP3。SEQID NO:23的报告物ΔLNGFR由IRES(内部核糖体进入位点)转录。scFv是选自SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:19中的一种，对猪SLA-01*0401具有特异性。
用于染色供比较用的非转导细胞(未转导)和表达含有SEQ ID NO:17的scFv E4(SLA-01*0401E4)、SEQ ID NO:19的scFv H7(SLA-01*0401H7)或SEQ ID NO:16的scFv C5(SLA-01*0401C5)的CAR-SLA-01*0401的经转导的细胞的FACS结果在具有对报告物ΔLNGFR的染色和用抗IgG-Fab的染色的图5c中显示以及在具有对FOXP3染色和用抗IgG-Fab染色的图5d中。结果显示由hΔFcIgG域形成的铰链的表面表达和报告物的同时表达以及FOXP3的同时表达，证明融合蛋白位于细胞膜上，其中胞外域在外部而信号传导域在内部。
使用E4(SEQ ID NO:17)、H7(SEQ ID NO:19)、C5(SEQ ID NO:16)和F11(SEQ IDNO:18)的可溶性scFv抗体测试CAR-SLA-01*0401与人细胞的交叉反应性。可溶性scFv含有序列中未给出的另外的C端His6-标签。
图6显示了与标记的scFv温育后，人PBMC和猪PBMC的FACS结果。结果显示没有scFv与人PBMC的交叉反应性和用每种scFv对猪PBMC的标记。
为了分析CAR-SLA-01*0401转导细胞的功能，用CAR-SLA-01*0401转导稳定表达含有NFAT敏感性IL-2启动子以控制GFP表达的报告物构建体的T细胞杂交瘤。为了在FACS分析中检测CAR表达，检测报告物ΔLNGFR，以GFP(绿色荧光蛋白)的表达检测NFAT刺激。
如图7所示，发现含有scFv域E4、H7、F11或C5的经CAR-SLA-01*0401转导的细胞在转导后未显示任何NFAT活化或相关的GFP表达，但是通过与充当刺激细胞的猪PBMC共培养强烈上调NFAT活化和GFP表达(但不响应人PBMC)。该结果显示了根据本发明的CAR-SLA-01*0401具有在猪细胞存在下激活NFAT所必需的信号转导的能力。由于杂交瘤不表达任何内源T细胞受体(TCR)，观察到的信号转导完全由CAR-SLA-01*0401的信号传导引起。
实施例5：体内CAR-SLA-01*0401的抑制物活性
作为固体同种异体移植物组织的实例，将猪胰岛细胞移植到作为接受体的小鼠中。在临床前模型中研究同种异体或异种胰岛功能的最常用方法是在胰岛移植入高血糖人源化小鼠后监测血糖水平。目前，用链佐星(streptozozocin，STZ)处理动物，通过破坏产生胰岛素的胰岛细胞使小鼠变为高血糖。对那些高血糖小鼠在肾被膜下移植分离的成年猪胰岛，以替换破坏的鼠胰岛细胞。移植后14天，在具有另外的和没有另外的(对照组)经转导以表达CAR-SLA-01*0401的猪Treg细胞的情况下，用人PBMC(对于猪胰岛异种)重建动物。通过实验动物的血糖水平监测胰岛功能和细胞存活力。将那些数据与来自实验最后阶段的外植肾的免疫荧光数据进行比较，以探索CAR Tregs在胰岛细胞簇中的积累。
序列表
<110> 汉诺威医学院
布伦瑞克工业大学
<120> 在治疗HvG病中使用的融合蛋白
<130> M1067PCT
<150> EP16177208.2
<151> 2016-06-30
<160> 25
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (KAZ15-C1)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..251
<223> 可变轻链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Ser Arg Gly Ser Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ser Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Gly Asn Ala Val Asn
165 170 175
Trp Tyr Gln His Phe Pro Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Ser
180 185 190
Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ala Trp Asp Asp Ser Leu Arg Gly Tyr
225 230 235 240
Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 2
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (KAZ15-F3)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..249
<223> 可变轻链
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Glu Glu Leu Leu Ala Leu Phe Gly Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg
145 150 155 160
Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser
180 185 190
Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly
195 200 205
Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Arg Asp Glu Ala
210 215 220
Asp Tyr Tyr Cys His Val Trp Asp Ala Lys Thr Asn His Gln Val Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Gln
245
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-A5)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..251
<223> 可变轻链
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Gln Ser Arg Trp Leu Gln Ser Gly Asp Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr
145 150 155 160
Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Arg Val
165 170 175
Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr
180 185 190
Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Val
225 230 235 240
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..119
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1313-B8)
<220>
<221> 链
<222> 120..137
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 138..246
<223> 可变轻链
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Thr Gly Thr Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu
115 120 125
Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro
130 135 140
Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser
145 150 155 160
Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Gly Val Lys Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val Ile Tyr Arg Asp Tyr Gln Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser
195 200 205
Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Lys Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Val Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Gln Leu Thr Val Leu
245
<210> 5
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-B11)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..251
<223> 可变轻链
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Glu Arg Trp Leu His Leu Ser Gly Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val
130 135 140
Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Ala
145 150 155 160
Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Ser Asn Thr Val Asn
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ser
180 185 190
Asn His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Phe Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr
225 230 235 240
Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 6
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..116
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-C5)
<220>
<221> 链
<222> 117..134
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 135..244
<223> 可变轻链
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly His Tyr Gly Asp Tyr Val Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu
115 120 125
Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
130 135 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser
145 150 155 160
Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
165 170 175
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
195 200 205
Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 7
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..118
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-D4)
<220>
<221> 链
<222> 119..136
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 137..246
<223> 可变轻链
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ser Ser Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Val Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu
115 120 125
Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala
130 135 140
Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly
145 150 155 160
Thr Gly Ser Asp Val Gly Gly Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His
165 170 175
His Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Ile Ile Tyr Asp Val Asn Tyr Trp
180 185 190
Pro Ser Gly Val Ser His Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr
195 200 205
Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Thr Gly Asp Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 8
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-D8)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..248
<223> 可变轻链
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Glu Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Pro Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Gln
130 135 140
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
145 150 155 160
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala
180 185 190
Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Arg Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 9
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..122
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-E4)
<220>
<221> 链
<222> 123..140
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 141..250
<223> 可变轻链
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Thr Asn
20 25 30
Ser Gly Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Ser Thr Asp Tyr Ala
50 55 60
Leu Ser Leu Gln Ser Arg Val Thr Ile Lys Ser Asp Arg Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asp Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Ile
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asn Trp Asn Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Pro Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro
115 120 125
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu
180 185 190
Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Ser Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Asn Tyr Val
225 230 235 240
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 10
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..122
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-E12)
<220>
<221> 链
<222> 123..140
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 141..249
<223> 可变轻链
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Ser Arg Trp Glu Pro Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro
115 120 125
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Pro Val Leu
130 135 140
Thr Gln Ser Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Val
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Gly Lys Ser Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Ala Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Ser His Asp Thr Asp
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr
195 200 205
Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Ala Ser Leu Gly Gly Ser Trp Leu Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 11
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..122
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-F6)
<220>
<221> 链
<222> 123..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..252
<223> 可变轻链
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Trp Leu Arg Ser Ala Ser Ser Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro
115 120 125
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ala Gly Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ala Tyr Asp Val His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Gly
180 185 190
Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser
225 230 235 240
Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 12
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 链
<222> 1..123
<223> 可变重链
<220>
<223> scFv (SH1319-G3)
<220>
<221> 链
<222> 124..141
<223> 接头
<220>
<221> 链
<222> 142..251
<223> 可变轻链
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Asp Ser Ser Ala Tyr Gln Gly Arg Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala
115 120 125
Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Leu Pro Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Pro Val His
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Val Tyr Arg
180 185 190
Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys
195 200 205
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp
210 215 220
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Val Ser Leu Ser Gly Val
225 230 235 240
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245 250
<210> 13
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8铰链域和跨膜域
<400> 13
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
50 55 60
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
65 70 75 80
Arg
<210> 14
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28信号传导域
<400> 14
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
1 5 10 15
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
35 40
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zeta信号传导域
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Ser
<210> 16
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (C5)
<400> 16
Ile Lys Glu Glu Lys Leu Thr Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln
20 25 30
Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Ile Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
35 40 45
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly His Gly Phe His
50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
65 70 75 80
Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
85 90 95
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val Phe Leu Gln Met
100 105 110
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
115 120 125
Leu Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
130 135 140
Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe
145 150 155 160
Ser Glu Ala Arg Val Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
165 170 175
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly
180 185 190
Ala Val Thr Ser Gly Tyr Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
195 200 205
Gln Ala Pro Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Lys His Ser Trp
210 215 220
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu
225 230 235 240
Thr Leu Ser Gly Val Arg Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu
245 250 255
Leu Tyr Tyr Gly Gly Ala Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
260 265 270
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
275 280 285
Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
290 295 300
Leu Ser
305
<210> 17
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (E4)
<400> 17
Ile Lys Glu Glu Lys Leu Thr Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala
1 5 10 15
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Met Gln
20 25 30
Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys
35 40 45
Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
50 55 60
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile
65 70 75 80
Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg
85 90 95
Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu
100 105 110
Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val
115 120 125
Gly Pro Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
130 135 140
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys
145 150 155 160
Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ala Val Leu Thr
165 170 175
Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser
180 185 190
Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
195 200 205
Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn
210 215 220
Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Phe
225 230 235 240
Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu
245 250 255
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Thr Ser Leu Ser Gly Ser Lys
260 265 270
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala
275 280 285
Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser
290 295 300
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser
305 310 315
<210> 18
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (F11)
<400> 18
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Val
65 70 75 80
His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu His Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Leu Ala Arg Val Val Ile Thr
115 120 125
Pro Gly Gly Met His Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Ser Ala Phe Ala Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu
145 150 155 160
Ala Arg Val Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser
165 170 175
Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Thr Val
180 185 190
Thr Gly Ala Ser Ser Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val
195 200 205
Pro Arg Pro Leu Ile Tyr Gly Thr Thr Asn Lys His Ser Trp Thr Pro
210 215 220
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Val
225 230 235 240
Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gln Pro Tyr Trp Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
260 265 270
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
275 280 285
Pro Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
290 295 300
Asp Leu Ser
305
<210> 19
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv (H7)
<400> 19
Lys Glu Glu Lys Leu Thr Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu
20 25 30
Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
35 40 45
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp
50 55 60
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
85 90 95
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
100 105 110
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Ala
115 120 125
Tyr Asn Trp Asn Asp Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Lys Leu Glu Glu
145 150 155 160
Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln Gly Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
180 185 190
Ser Arg Ser Asn Ile Gly Pro Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Gln Leu
195 200 205
Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Arg Asn Tyr Gln Arg Pro
210 215 220
Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
225 230 235 240
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr
245 250 255
Cys Ala Ser Trp Asp Asp Thr Leu Gly Ala Val Val Phe Gly Gly Gly
260 265 270
Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile
290 295 300
Ser Glu Glu Asp Leu Ser
305 310
<210> 20
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hΔFC IgG域
<400> 20
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu
275 280
<210> 21
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD28跨膜域 - hCD3zeta信号传导域
<400> 21
Asp Pro Lys Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys
1 5 10 15
Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
20 25 30
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
35 40 45
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Ala Arg
50 55 60
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
65 70 75 80
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
85 90 95
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
100 105 110
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
130 135 140
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
145 150 155 160
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
165 170 175
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180
<210> 22
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合P2A hFOXP3
<400> 22
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Ser Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala
20 25 30
Pro Ser Leu Ala Leu Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg
35 40 45
Ala Ala Pro Lys Ala Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly
50 55 60
Thr Phe Gln Gly Arg Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu Asn Pro Met Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro
85 90 95
Leu Val Met Val Ala Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His
100 105 110
Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser
115 120 125
Thr Val Asp Ala His Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu
130 135 140
Glu Ser Pro Ala Met Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly
145 150 155 160
Val Phe Ser Leu Lys Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val
165 170 175
Ala Ser Leu Glu Trp Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe
180 185 190
Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro
195 200 205
Gln Ser Ser Tyr Pro Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly
210 215 220
Cys Glu Lys Val Phe Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln
225 230 235 240
Ala Asp His Leu Leu Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln
245 250 255
Arg Glu Met Val Gln Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu
260 265 270
Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr
275 280 285
Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val
290 295 300
Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg
305 310 315 320
Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser
325 330 335
His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe
340 345 350
Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg
355 360 365
Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile
370 375 380
Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala
385 390 395 400
Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe
405 410 415
Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu
420 425 430
Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro
435 440 445
Thr Pro Gly Pro
450
<210> 23
<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ΔLNGFR (受体)
<400> 23
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Asn Arg Gly Ile Leu
275 280
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌性前导肽
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro
20
<210> 25
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌性前导肽
<400> 25
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Val His Ser
20 25

Claims (21)

1.融合蛋白，所述融合蛋白包含单链可变片段抗体域(scFv)、铰链、跨膜域、胞内hCD28信号传导域和胞内hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导域，形成对HLA-A*02具有特异性的嵌合抗原受体(CAR-A*02)或者对SLA-01*0401具有特异性的嵌合抗原受体(CAR-SLA-01*0401)，用于治疗患者中的HvG病，所述融合蛋白的特征在于所述单链可变片段抗体域(scFv)具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:19。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于所述铰链和所述跨膜域具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导域具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于所述铰链是具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的hΔFc IgG域。
4.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述铰链和作为CD8跨膜域的所述跨膜域具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列，所述hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述hCD3ζ域具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列，或者包含hCD3ζ信号传导域的hCD28信号传导域具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它在CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节T(Treg)细胞中表达。
6.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述患者为HLA-A*02阴性，并且所述患者含有或意图含有HLA-A*02阳性的实体组织移植物。
7.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于所述患者是人并且含有或意图含有SLA-01*0401阳性的实体组织移植物。
8.根据权利要求7的融合蛋白，其特征在于所述组织移植物包含猪胰岛细胞。
9.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从N端至C端包含下列各项或由下列各项组成：一个具有选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12组成的组的氨基酸序列的scFv域、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的铰链和跨膜域、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的hCD28信号传导域、和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的hCD3ζ(hCD3zeta)信号传导域。
10.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从N端至C端包含下列各项或由下列各项组成：一个具有选自由SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:19组成的组的氨基酸序列的scFv域、具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的作为铰链的hΔFc IgG域、hCD28跨膜域和hCD28/hCD3信号传导域，具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
11.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从编码任选具有另外的N端分泌前导肽的所述融合蛋白的核酸序列表达。
12.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于它从编码所述融合蛋白的核酸序列表达，所述融合蛋白具有另外的N端分泌前导肽和具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的另外的C端P2A-hFOXP3。
13.根据权利要求11-12中之一的融合蛋白，其特征在于所述前导肽具有选自SEQ IDNO:24和SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
14.根据前述权利要求中之一的融合蛋白，其特征在于在HLA-A*02阳性实体组织存在下或在SLA-01*0401阳性实体组织的存在下向CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节性T(Treg)细胞提供抑制物活性。
15.根据权利要求13的融合蛋白，其特征在于提供归巢至CD4+CD25+CD127低HLA-A*02阴性人调节T(Treg)细胞中的次级淋巴样器官的能力。
16.在HLA-A*02阳性实体组织的存在下或在SLA-01*0401阳性实体组织的存在下提供具有抑制物活性的人调节性T(Treg)细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从血液样品分离CD4+CD25+CD127低人调节T(Treg)细胞以产生分离的Treg细胞，
b.将编码并表达根据权利要求1-15中之一的融合蛋白的核酸序列导入分离的Treg细胞中以产生表达所述融合蛋白的Treg细胞，
其中不在体外培养中扩增表达所述融合蛋白的所述Treg细胞。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于分离所述人调节性T细胞是分离HLA-A*02阴性人调节性T细胞。
18.在SLA-01*0401阳性实体组织存在下提供具有抑制物活性的人调节性T(Treg)细胞的方法，其包括以下步骤：
a.从血液样品中分离CD4+CD25+CD127低人调节性T(Treg)细胞以产生分离的Treg细胞，
b.将编码并表达根据权利要求1-15中之一的融合蛋白的核酸序列导入分离的Treg细胞中以产生表达所述融合蛋白的Treg细胞，
其中不在体外培养中扩增表达所述融合蛋白的所述Treg细胞。
19.根据权利要求16-18中之一的方法，其特征在于所述核酸序列包含在逆转录病毒载体中，所述逆转录病毒载体包装在逆转录病毒颗粒中并通过转导导入所述分离的Treg细胞中。
20.根据权利要求16-19中之一的方法，其特征在于在步骤b之后，将所述Treg细胞保持培养24小时，然后分离表达所述融合蛋白的Treg细胞。
21.根据权利要求20的方法，其特征在于所述Treg细胞在含有低剂量IL-2的培养基中保持培养，所述培养基不含刺激Treg细胞扩增的试剂。
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