TR2021017264A2 - Mr1t hücreleri̇ni̇n tetramer bağimsiz kolay i̇zolasyonu ve transgeni̇k car-mr1t-egfrt hücre üreti̇mi̇ i̇çi̇n bi̇r yöntem - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, MR1 (Major histocompatibility complex class I-related) T-hücre izolasyonuna yönelik yeni bir yöntem ile ilgilidir. Buluşa ait yöntem; solid tümör hücre hatlarının MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi ile MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarının elde edilmesi ve daha sonra söz konusu hücre hatlarının PBMC örneği ile ko-kültür edilmesi işlemlerini ihtiva etmektedir. Mevcut buluşa göre olan yöntem ayrıca tercihen, izole edilmesi ve transgenik CAR-MR1T-EGFRt hücre üretim adımlarını ihtiva etmektedir.

Description

TARIFNAME MR1T HÜCRELERININ TETRAMER BAGIMSIZ KOLAY IZOLASYONU VE TRANSGENIK CAR-MR1T-EGFRT HÜCRE ÜRETIMI IÇIN BIR YÖNTEM BULUSUN ILGILI OLDUGU TEKNIK ALAN Mevcut bulus, MR1 (Major histocompatibility complex class l-related) T-hücre izolasyonuna yönelik yeni bir yöntem ile ilgilidir. Bulusa ait yöntem; solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi, bu yolla MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin elde edilmesi ve daha sonra söz konusu hücre hatlarinin PBMC örnegi ile ko-kültür edilmesi adimlarini ihtiva etmektedir. Mevcut bulusa göre olan yöntem ayrica tercihen, izole edilen MR1T hücrelerine CAR geni veya telomeraz geni eklenmesi adimlarini ihtiva etmektedir.

TEKNIGIN BILINEN DURUMU MR1T hücreleri, MR1 (Major histocompatibility complex class l-related) proteini yardimiyla antijenleri taniyip onlarla savasan, geleneksel olmayan T-hücreleridir. Geleneksel olmayan T- hücreleri olarak nitelendirilmelerinin sebebi, klasik T-hücrelerin aksine MHC/HLA (Major Histocompatibility Complex/Human Leukocyte Antigen) olmadan MR1 proteini tarafindan sunulan antijenleri tanimalaridir (Gherardin, N. A., vd. (2018). The dlverse family of MR1- MR1, birçok hücre tipinin yüzeyinde çok düsük seviyelerde eksprese edilen polimorfik olmayan MHC-l benzeri bir proteindir. Bakteriyel enfeksiyonun ardindan, antijen sunan hücreler (APC) antijen baglanmasina bagli gelisen protein stabilizasyonu nedeniyle MR1'in yüzey ekspresyonunu upregüle eder. MR1 birçok türde yüksek oranda korunmustur, örnegin insan ve fare MR1 proteinleri protein düzeyinde >%90 sekans homolojisi paylasmaktadir (Lepore, M., vd. (2017). Functionally diverse human T cells recognize non-microbial antlgens presented by MR1. eLi'fe, 6, 924476).

Kanser immünoterapide halihazirda kullanilan en etkin yöntemlerden biri, transgenik kimerik antijen reseptörü (CAR, Chimeric antigen receptors) eksprese eden otolog ve klasik T-hücre (CAR-T) uygulamasidir. Fakat allojenik CAR-T hücre terapisinde kullanilan geleneksel T- hücreleri yüzeylerinde halihazirda T-hücre reseptörü eksprese ettiginden, antijenleri MHC Sinif 1 ve 2 araciligiyla tanimaktadir. Ancak söz konusu MHC proteini polimorfik (insandan insana degisen) oldugu için doku uyumsuzluguna sebep olabilmektedir. Öte yandan MR1T hücreleri, antijenleri MR1 proteini araciligi ile tanimalari, bu proteinin ise insandan insana degismemesi sebebiyle GVHD (Doku Uyumsuzlugu) olusturmayacagi ön görülmektedir. Bu sebeple, MR1T hücreleri kanser immünoterapide genel kullanim için oldukça uygundur. Birçok çalisma, çesitli MR1T hücrelerinin kanseri elimine etmede basarili oldugunu ortaya koymustur (Wang, Z., vd. (2020). MR1-restricted T cells.' the new dawn of cancer immunotherapy. Bioscience Reports, 40( 1 1); Mori, L., & De Libero, G. (2020). 'Bohemian Rhapsodyfof MR1T cells. Nature immunoiogy, 21(2), 108-110). bir tümör iliskili antijene spesifik olarak baglanabilen bir T-hücre reseptörünü eksprese eden T-hücrenin izole edilmesine yönelik bir yöntemi açiklamaktadir. Yöntem T-hücrelerin bir preparasyonunun saglanmasi, preparasyonun MR1 proteinini eksprese eden kanser hücreleri ile temas ettirilmesi ve adi geçen kanser hücrelerine spesifik olarak reaktif olan bir T-hücrenin izole edilmesi adimlarini ihtiva etmektedir. monomorphic MHC class l related protein MR1” isimli yayin kapsaminda, MR1 araciligiyla çogu insan kanser türünü taniyabilen ve öldürebilen bir MR1 TCR klonu olan MC.7.G5 izole edilmistir. Söz konusu MC.7.G5 klonunun, bakteri metabolomlarinin MAIT hücreleri tarafindan taninmasi için kullanilan TCR profillerinden farkli olarak kanser hücrelerini tanidigi belirtilmektedir (Crowther, M. D., v.d. (2020). Genome-wide CRlSPR-CasQ screening reveais ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class l-relatecl protein MR1.

Nature immunoiogy, 21 (2), 178-185).

Yukarida örnekleri verilen, teknigin bilinen durumuna ait MR1T hücresi izolasyonu yöntemleri, hücrelerin uzun süreli ko-kültür ile aktivasyonunu ihtiva etmektedir. Kanser hücreleri tarafindan aktif hale getirilen T-hücreler akis sitometri (flow-cytometry) yöntemi ile aktiflik belirteçlerine göre izole edilmekte, ardindan bu hücrelerin MR1T hücresi oldugunu teyit etmek için kanser hücreleri ile tekrar ko-kültür gerçeklestirilerek hücrenin aktivite durumu kontrol edilmektedir. Iki kez aktivasyona maruz birakilan T hücrelerinde yorulma (exhaustion) görülebilmektedir.

Bunun sonucunda ise kanser immunoterapisi yeterliliginin azalmasi durumu ortaya çikmaktadir.

MR1T hücresi izolasyonunda karsilasilan problemlerden bir digeri de, aktif hale getirilen MR1T hücreleri tarafindan ortama interlökin-2 (iL-2) salgilanmasidir. Salgilanan lL-2 sitokini yakininda bulunan fakat kanser immünoterapi aktivitesi olmayan diger hücrelerin de aktif hale gelmesine sebep olmaktadir. Bunun nedeni ise kullanilan izolasyon markerlarinin (örnegin nedeniyle izole edilen aktif hücrelerin MR1T hücresi olmama ihtimali bulunmaktadir.

Bu bilgiler isiginda görülmektedir ki, son yillarda kanser immünoterapisi alaninda CAR-T hücrelerine ek vei'veya alternatif olarak “MR1T hücre” yaklasimi öne çikmaktadir. Ancak MR1 T hücrelerinin izolasyonu için kullanilan yöntemler, aktivasyon adimi sebebiyle elde edilen MR1T hücrelerinde yorulmaya yol açabilmektedir ve elde edilen hücrelerin MR1T hücresi oldugu kesin olarak tespit edilememektedir. Dolayisiyla ilgili teknik alanda, MR1T hücrelerinin aktive edilmeden izole edilmesine yönelik bir ihtiyaç bulunmaktadir. Sunulacak yeni yöntemler, özellikle kanser immünoterapisi alaninda bir ilerleme saglayacaktir. Mevcut bulus bu amaçla, MR1T hücrelerinin izolasyonu için, hücrelerin aktive edilmeden izolasyonuna imkan veren yeni bir yöntem saglamaktadir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus bir yönüyle, MR1T hücresi izolasyonu için asagidaki adimlari ihtiva eden bir yöntem saglamaktadir: - solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi, - MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin gamma irradiyasyona veya mitomisin C'ye maruz birakilarak inaktive edilmesi, - saglikli bir insan kanindan izole edilen periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneginin sunulmasi, - PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin 20 ila 45 dakika süreyle ko-kültür edilmesi, - süspanse edilen hücrelerin MR1 iliskili tümör spesifik antijen dolu MR1 tetramerleri ile inkübe edilmesi, ve - MR1 tetramerlerine baglanmis olan MR1T hücrelerinin izole edilmesi.

Mevcut bulusa göre olan yöntem kapsaminda söz konusu PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi islemi tercihen 30 dakika süreyle gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem kapsaminda söz konusu PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi islemi tercihen 4 ila 37°C arasinda gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntemde kullanilan solid kanser hücre hatti tercihen A549, MM909.11, ihtiva eden gruptan seçilmektedir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem kapsaminda yer alan solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi islemi tercihen lentiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem kapsaminda söz konusu MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin inaktive edilmesi islemi gamma radrasyonu veya mitomisin C ile gerçeklestirilebilmektedir.

Tercihen, mevcut bulusa ait yöntemde yer alan izolasyon islemi FACS sort etme yöntemi ile gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem ayrica izole edilen MR1T hücrelerinin anti-CDS/anti-CD28 mikrobitleriyle veya PHA ile aktive edilmesi adimini ihtiva edebilmektedir. Tercihen, aktive edilen MR1T hücreleri IL-2, IL-T, IL-15, IL-12 ve lL-18 sitokinlerini ihtiva eden gruptan seçilen bir sitokin ile çogaltilmaktadir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem ayrica tercihen izole edilen MR1T hücrelerine solid tümör- spesifik CAR (kimerik antijen reseptörü) geninin entegre edilmesi yoluyla CAR- MR1ThücreIerinin elde edilmesi adimini ihtiva etmektedir. Söz konusu solid tümör tercihen mesane kanseri, meme kanseri, rahim agzi kanseri, endometrium kanseri, böbrek kanseri, dudak ve agiz kanseri, karaciger kanseri, melanom, mezotelyoma küçük hücreli olmayan akciger kanserii melanom olmayan cilt kanseri,yumurtalik kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, sarkom, küçük hücreli akciger kanseri, tiroid kanseri, glioblastoma, nöroblastomave kolorektal kanseri ihtiva eden bir gruptan seçilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntemde yer alan CAR-MR1 T-hücrelerinin elde edilmesi adimininda yer alan söz konusu entegre edilme islemi tercihen lentiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem ayrica elde edilen CAR-MR1 T-EGFRt hücrelerinin EGFR- spesifik monoklonal antikor ile isaretlenmesi adimini ihtiva edebilmektedir.

Mevcut bulus bir diger yönüyle, mevcut bulusa göre olan yöntemle elde edilen bir CAR-MR1T- EGFRt hücresi saglamaktadir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere bulusa göre olan CAR-MRiT-EGFRt hücresini sunmaktadir.

Mevcut bulusa göre olan yöntem ayrica tercihen, izole edilen MR1T hücrelerine SV4O Büyük T Antijeni (TAg) ve insan telomeraz (hTERT) genlerinin entegre edilmesi adimini ihtiva etmektedir. Söz konusu entegre edilme islemi tercihen Ientiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulus bir diger yönüyle, mevcut bulusa göre olan yöntemle elde edilen bir SV40 TAg- hTERT-MR1T hücresi sunmaktadir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere bulusa göre olan SV4O TAg-hTERT-MR1T hücresini saglamaktadir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, izole edilen MR1T hücrelerine Ientiviral aktarim yoluyla CAR geni entegre edilmesiyle CAR-MRlT-EGFRt hücre üretimini göstermektedir.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulus ile, iki defa aktive edilmemis dolayisiyla anti-tümör etkisi yüksek MR1 T hücrelerin izole edilmesi; baska bir deyisle MR1T hücrelerin “exhaustion” sürecine ugramadan izole edilmesi için bir yöntem sunulmasi amaçlanmaktadir. Bu amaçla GFP entegre edilmis, MR1 proteinini overeksprese eden kanser hücreleri kullanilarak PBMC örneklerinden pratik ve verimli bir sekilde MR1T hücresi izole edilmesi için bir yöntem saglanmaktadir.

MR1T hücreleri, polimorfik olmayan MHC-l benzeri bir protein olan MR1 proteini tarafindan sunulan antijenleri taniyip onlarla savasan, geleneksel olmayan T hücreleri olmalari bakimindan son yillarda dikkat çekmektedir. Ancak bu hücrelerin T hücreleri arasindaki insidansi oldukça azdir (%0.1) ve yüksek verimlilikle izole edilebilmeleri önem tasimaktadir.

Halihazirda MR1T hücrelerinin izolasyonu için kullanilan yöntemler, yorulmaya (exhaustion) yol açabilmekte ve elde edilen hücrelerin MR1T hücre oldugunun yüksek bir dogrulukla saptanmasina izin vermemektedir. Bunlara ek olarak, teknigin bilinen durumuna ait yöntemlerde aktive olmus MR1T hücrelerinin klonlamasi alt klonlama yöntemi (Subcloning) ile 96-kuyucuklu plakalarda oyuk basina 1-3 hücre yerlestirilerek yapilabilmektedir. Bu da, MR1T hücrelerinin klinik uygulamalar için gereken sayida çogaltilmasini zorlastirmaktadir. Bu durum mevcut MR1T hücrelerinin izolasyon ve çogaltilmasinda zaman kaybina ve yüksek maliyetlere sebep olmaktadir.

Dolayisiyla, MR1T hücrelerinin etkili ve verimli bir sekilde izole edilmesi için yeni yöntemlerin gelistirilmesi kanser immünoterapisi alaninda büyük önem tasimaktadir. Mevcut bulus sahipleri, iki kere aktivasyona maruz birakilan T hücrelerinde yorulma (exhaustion) ve kanser immunoterapisi yeterliliginin azalmasi durumuna çözüm olarak hücreleri aktive etmeden izole edebilecek bir yöntem gelistirmislerdir.

Buna göre mevcut bulus bir yönüyle, MR1T hücresi izolasyonu için yeni bir yöntem saglamaktadir. Söz konusu yöntem asagidaki adimlari ihtiva etmektedir: - solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi, - MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin gamma irradiyasyon veya mitomisin C ile inaktive edilmesi, - saglikli bir insan kanindan izole edilen periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneginin sunulmasi, - PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin 20 ila 45 dakika süreyle ko-kültür edilmesi, - süspanse edilen hücrelerin MR1 iliskili tümör spesifik antijen dolu MR1 tetramerleri ile inkübe edilmesi, ve - MR1 tetramerlerine baglanmis olan MR1T hücrelerinin izole edilmesi.

Görülecegi üzere mevcut bulusa ait yöntem, MR1 ve GFP proteinlerini yüksek miktarda eksprese eden (overexpress) solid tümör hücre hatlarinin saglikli insan kanindan izole edilen PBMC (periferik kan mononükleer hücre) ile ko-kültür edilmesi ve daha sonra süspanse edilen hücrelerin MR1 iliskili tümör spesifik antijen dolu MR1 tetramerleri ile inkübe edilmesi prensibine dayanmaktadir. Burada GFP, solid tümör hücre hatlarinin floresan yesil isima yaymalarini saglamaktadir. GFP protein ekspresyonu ile isaretlenmis olan söz konusu hücreler daha sonra kolayca izole edilebilmektedir.

Peptid-MHC (pMHC) multimerleri, antijene özgü T hücrelerinin saptanmasi ve izolasyonu için ragmen, bu etkilesim, tek bir molekül üzerine birden fazla pMHC dahil edilmesinin sagladigi hücrelerinin dogrudan ex vi'vo olarak saptanmasina ve fenotiplenmesine izin vermek için periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) içindeki ayni kökenli T-hücrelerine kararli bir sekilde baglanabilir (Lepore, M., Vd. (2017). Functionai'i'y diverse human Tceli's recogni'ze non- Peptide-MHC Multimer Protocoi's for Detecti'on and Iso/atfen ofAutoimmune T-Cei'i's. Frontiers Mevcut bulusa göre olan yöntem, PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin kisa süreli bir ko-kültürünü ihtiva etmesi bakimindan avantajlidir. 20 ila 45 dakikalik ko-kültür (inkübasyon) süresi içerisinde hücrelerin aktive olmasi mümkün olmadigindan, diger hücrelerde aktivasyon ve kontaminasyon riski olusmamakta, bu sayede yalnizca MR1T hücresi izolasyonu gerçeklestirilmis olmaktadir. Söz konusu inkübasyon süresi söz konusu PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi islemi 30 dakika sürdürülmektedir.

Tercihen, söz konusu PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi islemi 4 ila 37°C arasinda gerçeklestirilmektedir. PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi islemi örnegin 4°C`de, 25°C*de veya 37°C'de gerçeklestirilebilir.

Mevcut bulusa ait yöntemde kullanilan solid tümör hücre hatti tercihen A549, MM909.11, ihtiva eden gruptan seçilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntemde yer alan solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi islemi tercihen Ientiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntemde yer alan MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin inaktive edilmesi islemi gamma radyasyonu veya mitomisin C kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntemin son adiminda yer alan izolasyon islemi, tercihen FACS sort etme yöntemi ile gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulusa ait yöntem ayrica tercihen, izole edilen MR1T hücrelerinin anti-CD3/anti-CD28 mikrobitleriyle veya PHA ile aktive edilmesi adimini ihtiva etmektedir. Mevcut bulusa ait yöntem ayrica tercihen, aktive edilen MR1T hücrelerinin IL-2, IL-T, IL-15, IL-12 ve IL-18 sitokinlerini ihtiva eden gruptan seçilen bir sitokin ile çogaltilmasi adimini ihtiva etmektedir.

Kimerik antijen reseptörleri (CAR'Iar), tümör reddine aracilik etmek için T-hücrelerini yeniden yönlendiren ve yeniden programlayan sentetik reseptörlerdir. Bugüne kadar kullanilan en basarili CAR'Iar, kemorefrakter veya nükseden B-hücresi maligniteleri olan hastalarda tam remisyon olasiligi sunan CD19'u hedetleyenlerdir. CAR'Iar tipik olarak bir hastanin T- hücrelerine y-retroviral vektörleri veya diger rastgele entegre vektörler kullanilarak dönüstürülür. Bu da klonal çogaltma, onkojenik transformasyon, transgen ekspresyonu ve transkripsiyonel susturma ile sonuçlanabilir.

MR1T hücrelerinin kanser dokusu üzerinde infiltre edilmesini saglayan antijenlerin biyokimyasal özellekileri henüz bilinmediginden özellikle solid tümörlerde MR1T hücrelerinin MR1-antijen kompleksine göstertecegi anti tümör etkinliginin tümör spesifik olup olmadigi bilinmemektedir MR1T hücreleri antii kanser etkinligi gösterebilir fakat MR1T antijenleri kanser türüne spesifik olmayabilir. Hedeflenen kanser türüne karsi spesifiteyi artimak amaciyla mevcut bulus ile, izole edilen MR1T hücrelerinin spesifitesi CAR geni ekleyerek artirilmaktadir.

Böylelikle solid tümörlere spesifik CAR-MRiT-EGFRt hücreleri üretilerek; mevcut CAR-T uygulamalarina ek olarak yeni, GVHD (doku uyumsuzlugu) olusturmayan, solid tümörlere karsi daha etkin bir kanser immünoterapi uygulama yönteminin sunulmasi hedeflenmektedir.

Dolayisiyla mevcut bulusa ait yöntem, tercihen ayrica izole edilen MR1T hücrelerine solid tümör-spesifik CAR (kimerik antijen reseptörü) geninin entegre edilmesi yoluyla CAR-MR1T- EGFRt hücrelerinin elde edilmesi adimini ihtiva etmektedir. Bu yolla elde edilen CAR-MR1T- EGFRt hücrelerinin seçili tümör tipine daha hizli ulasmasi ve etkili yanit olusturmasi beklenmektedir. Bahsi geçen solid tümör; mesane kanseri, meme kanseri, rahim agzi kanseri, endometrium kanseri, böbrek kanseri, dudak ve agiz kanseri, karaciger kanseri, melanom, mezotelyoma küçük hücreli olmayan akciger kanseri, melanom olmayan cilt kanseri, yumurtalik kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, sarkom, küçük hücreli akciger kanseri, tiroid kanseri, glioblastoma, nöroblastomave kolorektal kanseri ihtiva eden bir gruptan seçilmektedir.

Yukarida açiklandigi gibi, kati tümörlerin ürettigi Tümör Iliskili Antijenleri (TAA) hedefleyen CAR”Iar teknikte siklikla kullanilmakta ve yüksek spesifite ile basari orani saglamaktadir.

Dolayisiyla mevcut bulusa ait yöntemde kullanilan söz konusu CAR geni tercihen TAA-spesifik CAR geni tasarimlaridir.

Bulusa ait yöntemde, solid tümör-spesifik CAR geni izole edilen MR1T hücrelerine tercihen Bulusa ait yöntemle elde edilen CAR-MRtT-EGFRt hücreleri tercihen ayrica EGFR-spesifik monoklonal antikor ile isaretlenmektedir. Söz konusu antikor, bulusa ait CAR-MR1T-EGFRt hücrelerinin izolasyonuna imkan saglamasi bakimindan avantajlidir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, bulusa ait yöntemle elde edilen CAR-MR1T-EGFRt hücrelerini saglamaktadir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere bulusa göre olan CAR-MR1T-EGFRt hücresini sunmaktadir.

Hücresel yaslanmanin telomerlerin kisalmasindan kaynaklandigi bilinmektedir. Insan ve sigir hücrelerinde telomer kisalmasi ve replikatif yaslanma, telomerazin ters transkriptaz bileseninin (TERT) ektopik ekspresyonu ile önlenebilmektedir. Uzun ömürlü memelilerden gelen hücrelerin neoplastik dönüsüme karsi direnç sergiledigi mekanizmalar tam olarak açikliga kavusturulmamis olsa da, bir aday mekanizma bu türlerin hücrelerinde neoplastik transformasyon için replikatif yaslanmanin önlenmesinin gerekliligidir. Bu kavram, normal insan hücrelerini tam bir tümörijenik duruma dönüstürmek için gereken genetik modifikasyonlara iliskin deneylerin sonuçlariyla desteklenmektedir. Normal hücrelerin, SV4O TAg onkojenik RasGlZV ve hTERT kodlayan üç retrovirüs tarafindan art arda transdüksiyonu, tamamen tümörijenik olan hücrelerin üretildigini göstermistir. hTERT olmadan sadece SV4O TAg ve Ras kodlayan retrovirüslerle transdüksiyon yapildiginda, hücreler tümör üretememistir.

Dolayisiyla insan hücrelerinin tümörijenik dönüsümü için hTERT'nin gerekli olduguna dair kanitlara ragmen, hTERT'nin ektopik ekspresyonunun, onkoproteinlerie is birligi yapmadan tek basina hücrelerin normal özelliklerini degistirmedigi gözlenmistir. Bu durum ilk olarak hücre kültüründe gösterilmistir. hTERT eksprese eden hücreler normal hücre döngüsü kontrol noktalarini korumakta ve karyotipik instabilite göstermemektedirler. Bu tür hücrelerin görünüste normal davranisi, “telomerizasyon” teriminin ortaya çikmasina neden olmustur.

Ayrica, telomerize hücrelerin bir konakçi hayvana transplantasyon sonrasinda da tamamen normal özellikleri korudugu gösterilmistir (Darimont, C., vd. (2002). SV4OT antigen and telomerase are required to obtain immortalized human adult bone cells without loss of the differentiated phenotype. Cell growth 8. differentiation .' the moiecular biology journal of the Cooperatlon of hTERT, SV40T antigen and oncogenlc Ras in tumorigenesis: a cell transplantation model using bovine adrenocorticai cells. Neopiasia (New York, N. Y. ), 4(6), 493-500). izole edilen MRiT hücreleri primer hücresi olup, kisa süreli yasam döngüsüne sahiptir. Mevcut bulus kapsaminda izole edilen MR1T hücrelerinin sinirsiz sayida çogaltilmasi, kanser tedavisinde kullanimi konusunda avantaj saglayacaktir. Ayrica zaman alici ve masrafli izolasyon süreçleri minimize edilecektir. Dolayisiyla mevcut bulusa ait yöntem kapsaminda söz konusu hücrelere tercihen telomeraz geni (hTERT) ve SV4O TAg (Simian virüs 40, büyük T antijeni) antijen geni entegre edilmektedir. Böylece sinirsiz sayida çogaltilabilecek transgenik, universal, kullanima hazir (Off-the-Shelf) MR1T hücrelerinin sunulmasi hedeflenmektedir. Söz konusu entegre etme islemi tercihen lentiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, bulusa ait yöntemle elde edilen SV4O TAg-hTERT-MR1T hücrelerini saglamaktadir.

Mevcut bulus diger bir yönüyle, kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere bulusa göre olan SV40 TAg-hTERT-MR1T hücresini sunmaktadir.

Mevcut bulusa göre olan MR1 T hücre izolasyonu yöntemi, asagidaki Örnekler'de detayli olarak açiklanmaktad ir. ÖRNEKLER 1. MR1 T Hücre izolasyonu Kanser immünoterapi uygulamalarinda kullanilmak üzere, saglikli bir insan kanindan MR1T hücrelerini izole edebilmek için gelistirilen yeni yöntem kapsaminda; öncelikle solid tümör (Green Fluorescent Protein) genlerinin transferi gerçeklestirildi. Böylelikle MR1 reseptörlerinin söz konusu tümör hücrelerinin yüzeyinde overeksprese edilmesi ve solid tümör hücre hatlarinin floresan yesil isima yayan GFP protein ekspresyonu ile isaretlenmesi saglandi (>%99). Sonuç olarak, solid tümör hücre hatlari yüksek seviyede MR1 proteini ifade eden (overeksprese) GFP+ kanser hücre hatlarina dönüstürüldü. Bu transgenik hücreler gamma irradyasyona ( kimyasalina tabi tutularak çogalmalari inaktive edildi. inaktive edilmis (çogalamayan) MR1+ GFP+ kanser hücre hatlari, saglikli insan kanindan izole edilen allojenik PBMC hücreleri ile inkübe edildi. Ardindan. izole edilen süspanse hücreler MR1 iliskili tümör spesifik antijen dolu MR1 tetramerleri ile inkübe edildi. 4, 25 veya 37°C'de 30 dakika inkübasyonun ardindan, GFP+ hücreler FACS sort etme yöntemi ile izole edildi. Daha sonra anti-CD3/anti-CD28 mikrobitleriyle veya PHA ile aktif 2. Elde Edilen MR1T Hücrelerine CAR Gem' Eklenmesi Çalismalarin bu asamasinda, izole edilen MR1T hücrelerine solid tümör hedefli CAR (Chimeric antigen receptors) reseptör geni lentiviral aktarim yoluyla entegre edilerek CAR-MR1T-EGFRt hücreleri üretildi. Saglikli bir insan kanindan izole edilen MR1T hücrelerine lentiviral gen aktarim yoluyla solid tümör (mesane kanseri, meme kanseri, rahim agzi kanseri, endometrium kanseri, böbrek kanseri, dudak ve agiz kanseri, karaciger kanseri, melanom, mezotelyoma küçük hücreli olmayan akciger kanseri, melanom olmayan cilt kanseri, yumurtalik kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, sarkom, küçük hücreli akciger kanseri, tiroid kanseri, glioblastoma, nöroblastoma veya kolorektal kanseri) spesifik CAR geni entegre edildi (Sekil 1).

Buna göre, TAA spesifik CAR'i (TAA-CD kodlayan Ientiviral vektör, sentezlendi. Lentivirüs üretim için gerekli olan zarf pCMV-VSV-G plazmidi ve psPAX2 plazmidi temin edildi. Genetik modifikasyon amaçli kullanilacak CAR kodlayici plazmit ile coli' DH5a susuna entegre edilip plazmitler çogaltildi. Izole edilmis zarf, paketleme ve CAR- EGFRt plazmitleri, FuGene transfeksiyon reaktifi ile muamele edildi ve daha sonra konakçi hücreler olan HEK293T kullanilarak Ientivirüs üretimi gerçeklestirildi. Paketlenmis rekombinant toplandi. Üretilen CAR-EGFRt Ientivirüsler, konak hücre proteinlerinden saflastirilmasi ve virüs konsantrasyonunun artirilmasi (20X-100X) amaciyla, üretici talimatlarina uygun olarak TFF (Tangential flow filtration) filtrasyon ve konsantrasyon isleminden geçirildi. Lentivirüs titre testinin ve sterilite, saflik ve replikatif kompetent Lentivirüs (RCL) dahil diger kalite kontrol testlerinin tamamlanmasindan sonra virüsler -80°C'de saklandi.

Saglikli üç insan donörden alinan kan örneklerinden periferik mononükleer hücrelerin (PBMC izolasyonu için, söz konusu örnekler Ficoll ile birlestirildi ve density-gradient santrifüj yöntemi ile PBMC'Ier izole edildi. CD4+ICD8+ MR1T-hücreleri, TAA yüklü tetramerleri kullanilarak izole edildi. Anti-CD3/anti-CD28 mikroboncuklari (Dynabead) veya tümör Iizati ile ko-inkübe edilen MR1T+ kanser hücre hatlari ile ilk MR1T-hücresi aktivasyonu yapildi ve Ientivirüs transdüksiyon islemi, Vectofusin 1 (10 ug/mL, Miltenyi), protamin sülfat (40 ug/mL, Sigma) ile olusturulan virüslerle gerçeklestirildi. Hücreler, T-hücre besi yerinde (SOIU/ml IL-2, 10 ng/ml IL- 7, 5 ngi'ml IL-15, %3 Human AB Serumu ve %1 pen/strep) 14 gün kültür edildi.

EGFR-spesifik monoklonal antikor, olusturulan CAR-MRlT-EGFRt hücrelerinin isaretlenmesi ve izolasyonunda kullanildi. Söz konus antikor ile ayrica ile gerekli görüldügünde CAR-MR1T- EGFRt hücrelerinin programli hücre ölümüne yönlendirilmesi saglanmaktadir. Kesilmis EGFRt isaretlenmesi için florokrom bagli anti-EGFR (Örnegin A kullanilarak flow cytometry yöntemi ile analizi gerçeklestirildi. CAR-MR1T-EGFRt hücrelerinin izolasyonu için, Biotin bagli anti-EGFR antikorlari ile isaretlenmeyi takiben Streptavidin-bead kullanilarak izolasyon gerçeklestirildi. Hastaya tranzfüze edilen CAR-MRlT-EGFRt hücrelerinin, gerekli görüldügünde ortamdan kaldirilmasi amaciyla EGFR-spesifik monoklonal antikor yoluyla hücrelerin programli hücre ölümü saglandi. 3. Elde Edilen MR1T Hücrelerine Telomeraz Gem' Eklenmesi Mevcut bulusa ait yöntemle izole edilen allojenik MR1T hücreleri ölümsüzlestirilerek, sinirsiz çogalabilen MR1T hücre suslari üretildi. Izole edilen allojenik MR1T hücrelerine Ientiviral aktarim yöntemi ile Büyük T antijen (SV40 TAg, Large T antigen - Simian virus 40; UniProtKB - P entegre edildi. Bu yolla elde edilen SV40 TAg-hTERT-MRlT hücrelerine, kanser hücre özelligi (ölümsüzlük, immortality) kazandirilmis oldu. Gamma irradyasyona ( tabi tutulan inaktive edilmis MR1T hücreleri, kanser immünoterapi uygulamalarinda kullanilabilmektedir.

Yukaridaki bilgiler isiginda görülmektedir ki mevcut bulus ile sunulan yöntem; kanser immünoterapisi alaninda kullanimi bulunan MR1T hücrelerin pratik ve etkili sekilde izole edilebilmesine, bu hücrelerin solid kanser-spesifik hale getirilmesine ve sinirsiz çogalabilen MR1T hücrelerinin elde edilmesine imkan saglamasi bakimlarindan avantajlidir.

Claims (1)

1. ISTEMLER MR1T hücresi izolasyonu için bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: - solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi, - MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin gamma irradiye veya mitomisin C ile inaktive edilmesi, - saglikli bir insan kanindan izole edilen periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneginin sunulmasi, - PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin 20 ila 45 dakika süreyle ko-kültür edilmesi, - süspanse edilen hücrelerin MR1 iliskili tümör spesifik antijen dolu MR1 tetramerleri ile inkübe edilmesi, ve - MR1 tetramerlerine baglanmis olan MR1T hücrelerinin izole edilmesi. istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu PBMC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi isleminin 30 dakika süreyle gerçeklestirilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu PBIVIC örnegi ile MR1+ GFP+ gamma irradiye inaktif solid tümör hücre hatlarinin ko-kültür edilmesi isleminin 4 ila 37°C arasinda gerçeklestirilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu solid tümör hücre hattinin A549, A2780 hücre hatlarini ihtiva eden bir gruptan seçilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu solid tümör hücre hatlarinin MR1 ve GFP genlerini ihtiva eden bir vektör ile transfekte edilmesi isleminin lentiviral aktarim yoluyla gerçeklestirilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin inaktive edilmesi isleminin gamma radyasyonu ile gerçeklestirilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu MR1+ GFP+ solid tümör hücre hatlarinin inaktive edilmesi isleminin mitomisin C ile gerçeklestirilmesidir. Istem 1'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu izolasyon isleminin FACS sort etme yöntemi ile gerçeklestirilmesidir. istem 1ie göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin ayrica izole edilen MR1T hücrelerinin anti-CDS/anti-CD28 mikrobitleriyle veya PHA ile aktive edilmesi adimini ihtiva etmesidir. istem 9'a göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin ayrica aktive edilen MR1T hücrelerinin IL-2, IL-T, IL-15, IL-12 ve IL-18 sitokinlerini ihtiva eden bir gruptan seçilen bir sitokin ile çogaltilmasi adimini ihtiva etmesidir. Istem 1”e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin ayrica izole edilen MR1T hücrelerine solid tümör-spesifik CAR (kimerik antijen reseptörü) geninin entegre edilmesi yoluyla CAR-MR1T-EGFRt hücrelerinin elde edilmesi adimini ihtiva etmesidir. istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu solid tümörün mesane kanseri, meme kanseri, rahim agzi kanseri, endometrium kanseri, böbrek kanseri, dudak ve agiz kanseri, karaciger kanseri, melanom, mezotelyoma küçük hücreli olmayan akciger kanseri, melanom olmayan cilt kanseri, , yumurtalik kanseri, pankreas kanseri, prostat kanseri, sarkom, küçük hücreli akciger kanseri, tiroid kanseri, glioblastoma, nöroblastomave kolorektal kanseri ihtiva eden bir gruptan seçilmesidir. istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu CAR geninin TAA-spesifik CAR geni olmasidir. istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu entegre edilme isleminin Istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin ayrica elde edilen CAR-MR1T-EGFRt hücrelerinin EGFR-spesifik monoklonal antikor ile isaretlenmesi adimini ihtiva etmesidir. Istem 11 ila 15'th herhangi birine göre sunulan yöntemle elde edilen CAR-MR1T-EGFRt hücresi. Kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere istem 16'ya göre sunulan CAR-MR1T- EGFRt hücresi. Istem 1”e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin ayrica izole edilen MR1T hücrelerine SV40 TAg ve insan telomeraz (hTERT) genlerinin entegre edilmesi adimini ihtiva etmesidir. Istem 18”e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu entegre edilme isleminin Istem 18 veya 19'e göre sunulan yöntemle elde edilen SV40 TAg-hTERT-MR1T hücresi. Kanser immünoterapisinde kullanilmak üzere istem 20'ye göre sunulan SV40 TAg- hTERT-MR1T hücresi.