CN111019906A - 治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，包括以下步骤：提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到T细胞内，制备CAR‑T细胞；对CAR‑T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的CAR‑T细胞，进行提纯；构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；向CAR‑T细胞中导入目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR‑Treg军团；将培养好的CAR‑Treg军团输回患者体内。有益效果：可以抑制细胞免疫，预防急性排斥反应的发生，同时有助于预防固有免疫介导的慢性排斥反应。

Description

治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及用于移植术后对于急慢性排斥反应的预防和治疗领域，具体来说，涉及治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用。
背景技术
目前移植手术愈发成为各脏器终末期疾病的治疗手段，移植手术逐步常规化、大众化。但是慢性排斥反应一直是制约移植物长期存活的限制。
其中，CAR-T疗法是利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞，是一种特异性杀伤肿瘤细胞的方法。与传统免疫疗法相比，CAR-T疗法在体外和临床试验中均已表现出了更好的靶向性和杀伤性，展示了巨大的应用潜力和发展前景。
目前CAR-T技术在移植免疫应用主要有两个方向，1、将病人T细胞分离，诱导制备Treg亚群(抑制性T细胞)回输，目前处于临床实验阶段；2、将Treg细胞通过基于CAR-T技术编辑，使Treg细胞识别抗原能力增强，大量聚集于抗原周围，在局部发挥免疫移植功能。但是，目前临床试验仅处于增加Treg细胞亚群比例和局部浸润比例，对于Treg的功能增强未有较好的临床方案。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用，具备预防固有免疫介导的慢性排斥反应和预防急性排斥反应发生的优点，进而解决背景技术中的问题。
(二)技术方案
为实现上述具备预防固有免疫介导的慢性排斥反应和预防急性排斥反应发生的优点，本发明采用的具体技术方案如下：
根据本发明的一个方面，提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，包括以下步骤：
提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞；
根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞，进行提纯；
采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；
通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团；
将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内。
进一步的，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞具体包括以下步骤：
对所述T细胞进行分离处理，并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增；
使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞，制得CAR-T细胞。
进一步的，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞还包括以下步骤：
获取患者血压样本；
采用离心法对所述血液样本进行离心处理，获取所述血液样本中的单个核细胞；
对所述单个核细胞进行分选获取所述T细胞。
进一步的，所述预设培养条件为：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4。
进一步的，所述采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白具体包括以下步骤：
以待突变的PD1和CTLA4质粒为模板，使用突变引物及Muta-directTM酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变，获取突变质粒DNA；
在所述PCR扩增反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒，并选择突变质粒DNA；
将反应后的所述突变质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中进行转化，获取PD1和CTLA4点突变质粒；
将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中进行逆转录，并进行包装浓缩，获取目的蛋白。
进一步的，所述突变引物的设计原则包括：
使用经过钝化的突变引物，且所述突变引物的长度为30-35bp，以要突变的碱基为中心，两边各加上至少11-12bp的突变引物，并且合成多一条反向互补的突变引物；
根据设定所述突变引物的长度，计算所述突变引物的Tm值，并确保所述Tm值达到78℃。
进一步的，在所述PCR扩增反应完成后需要冰育5min，然后置于室温中。
进一步的，所述通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团具体包括以下步骤：
通过细胞扩散的方式将所述目的蛋白导入所述CAR-T细胞中获取目的细胞，并通过与试剂接触激活所述目的细胞；
筛选出导入成功的目的细胞，并将所述目的细胞置于扩增培养液中培养，每周重复刺激1次，连续刺激2周，以获得足够量的所述目的细胞，制备所述细胞制剂，得到所述CAR-Treg军团。
根据本发明的另一方面，还提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的应用，用于上述构建方法构建的嵌合受体重组基因在治疗移植排斥反应中的应用。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用，具备以下有益效果：通过本发明的使用，可使CD4T细胞群体中Treg亚群比例升高，并在需要发挥功能的局部聚集，同时效应分子PD1，CTLA4表达量高于正常Treg细胞，对于固有免疫抑制能力更强。此外，通过Treg比例升高可以抑制细胞免疫，预防急性排斥反应的发生，且通过PD1和CTLA4抑制性分子表达量升高也有助于预防固有免疫介导的慢性排斥反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法的流程图；
图2是根据本发明实施例的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的示意图。
具体实施方式
为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。
根据本发明的实施例，提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法及应用。
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，如图1-2所示，根据本发明实施例的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，包括以下步骤：
步骤S101：提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞；
其中，所述步骤S101具体包括以下步骤：
获取患者血压样本；
采用离心法对所述血液样本进行离心处理，获取所述血液样本中的单个核细胞；
对所述单个核细胞进行分选获取所述T细胞。
对所述T细胞进行分离处理，并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增；
使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞，制得CAR-T细胞。
步骤S102：根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞，进行提纯；
其中，所述预设培养条件为：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4。
步骤S103：采用预设方法构建PD1(K48R)和CTLA4(K203R)点突变质粒，并将所述PD1(K48R)和CTLA4(K203R)点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；
其中，所述步骤S103具体包括以下步骤：
以待突变的PD1(K48R)和CTLA4(K203R)质粒为模板，使用突变引物及Muta-directTM酶进行PCR扩增反应，在所述PCR扩增反应完成后需要冰育5min，然后置于室温中，诱导目的基因突变，获取突变质粒DNA；具体的，所述突变引物的设计原则包括：1)使用经过钝化的突变引物，且所述突变引物的长度为30-35bp，以要突变的碱基为中心，两边各加上至少11-12bp的突变引物，并且合成多一条反向互补的突变引物；2)根据设定所述突变引物的长度，计算所述突变引物的Tm值，并确保所述Tm值达到78℃。
在所述PCR扩增反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒，并选择突变质粒DNA；
将反应后的所述突变质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中进行转化，获取PD1(K48R)和CTLA4(K203R)点突变质粒；
将所述PD1(K48R)和CTLA4(K203R)点突变质粒的序列导入逆转录病毒中进行逆转录，并进行包装浓缩，获取目的蛋白。
具体应用时，PD1和CTLA4是表达在T细胞上的抑制信号，发挥抑制功能，功能确切，目前单细胞分析发现幼稚CD4+T淋巴细胞通过刺激表达PD1共抑制分子可以促进其向Treg亚群的分化。同时作为效应分子，PD1蛋白通过泛素化途径降解，将其48位赖氨酸泛素化位点点突变后泛素化降解减少，PD1表达升高，表达时间延长。通过预测，CTLA4也通过泛素化降解，而且降解位点为203位赖氨酸。
具体如下表所示：表1为实验组(采用本发明中嵌合受体重组基因的移植患者)和对比组(普通移植患者)中Treg细胞在CD4T细胞群中的占比和PD1、CTLA4的表达量：
Figure BDA0002337515900000061
从表1中可以看出，实验组中Treg细胞在CD4T细胞群中的占比高于对比组，且实验组中PD1、CTLA4的表达量也高于对比组。
步骤S104：通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团；
其中，所述步骤S104具体包括以下步骤：
通过细胞扩散的方式将所述目的蛋白导入所述CAR-T细胞中获取目的细胞，并通过与试剂接触激活所述目的细胞；
筛选出导入成功的目的细胞，并将所述目的细胞置于扩增培养液中培养，每周重复刺激1次，连续刺激2周，以获得足够量的所述目的细胞，制备所述细胞制剂，得到所述CAR-Treg军团。
步骤S105：将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内，使得所述CAR-Treg聚集于移植物局部，长期发挥抑制功能。
根据本发明的另一实施例，还提供了治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的应用，用于上述构建方法构建的嵌合受体重组基因在治疗移植排斥反应中的应用。
工作原理：通过将人体的T细胞分离出来，并采用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到T细胞中，同时让他们表达点突变的抑制性分子，使得T细胞会转化为Treg，行使抑制功能，同时抑制分子PD1、CTLA4表达高(降解减少)。再将Treg细胞回输人体，此时，CAR会引导T细胞聚集在移植器官局部(因为是异体)，同时这部分细胞高表达抑制性信号PD1、CTLA4，使得抑制了杀伤性T细胞功能，达到保护移植物的效果。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过本发明的使用，可使CD4T细胞群体中Treg亚群比例升高，并在需要发挥功能的局部聚集，同时效应分子PD1，CTLA4表达量高于正常Treg细胞，对于固有免疫抑制能力更强。此外，通过Treg比例升高可以抑制细胞免疫，预防急性排斥反应的发生，且通过PD1和CTLA4抑制性分子(checkpoint分子)表达量升高也有助于预防固有免疫介导的慢性排斥反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞；
根据预设培养条件对所述CAR-T细胞进行体外培养，并筛选出编辑成功的所述CAR-T细胞，进行提纯；
采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白；
通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团；
将培养好的所述CAR-Treg军团输回患者体内。
2.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞具体包括以下步骤：
对所述T细胞进行分离处理，并将分离的CD3、CD8和T细胞激活后培养扩增；
使用携带CAR的重组慢病毒感染处理后的所述T细胞，制得CAR-T细胞。
3.根据权利要求2所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述提取患者体内的T细胞，并根据供体特异性HLA分子利用基因编辑技术将CAR嵌合抗体编辑到所述T细胞内，制备CAR-T细胞还包括以下步骤：
获取患者血压样本；
采用离心法对所述血液样本进行离心处理，获取所述血液样本中的单个核细胞；
对所述单个核细胞进行分选获取所述T细胞。
4.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述预设培养条件为：恒温37℃，CO2浓度5％，相对饱和湿度95％，细胞培养基PH值7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述采用预设方法构建PD1和CTLA4点突变质粒，并将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中，进行包装浓缩，制备目的蛋白具体包括以下步骤：
以待突变的PD1和CTLA4质粒为模板，使用突变引物及Muta-directTM酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变，获取突变质粒DNA；
在所述PCR扩增反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒，并选择突变质粒DNA；
将反应后的所述突变质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中进行转化，获取PD1和CTLA4点突变质粒；
将所述PD1和CTLA4点突变质粒的序列导入逆转录病毒中进行逆转录，并进行包装浓缩，获取目的蛋白。
6.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述突变引物的设计原则包括：
使用经过钝化的突变引物，且所述突变引物的长度为30-35bp，以要突变的碱基为中心，两边各加上至少11-12bp的突变引物，并且合成多一条反向互补的突变引物；
根据设定所述突变引物的长度，计算所述突变引物的Tm值，并确保所述Tm值达到78℃。
7.根据权利要求5所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，在所述PCR扩增反应完成后需要冰育5min，然后置于室温中。
8.根据权利要求1所述的治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的构建方法，其特征在于，所述通过预设方法向所述CAR-T细胞中导入所述目的蛋白并激活，再筛选出导入成功的目的细胞，进行刺激、扩增制备细胞制剂，得到CAR-Treg军团具体包括以下步骤：
通过细胞扩散的方式将所述目的蛋白导入所述CAR-T细胞中获取目的细胞，并通过与试剂接触激活所述目的细胞；
筛选出导入成功的目的细胞，并将所述目的细胞置于扩增培养液中培养，每周重复刺激1次，连续刺激2周，以获得足够量的所述目的细胞，制备所述细胞制剂，得到所述CAR-Treg军团。
9.治疗移植排斥反应的嵌合受体重组基因的应用，用于根据权利要求1构建的嵌合受体重组基因在治疗移植排斥反应中的应用。
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