CN109475614A

CN109475614A - 生产用于癌症免疫疗法的dna疫苗的方法

Info

Publication number: CN109475614A
Application number: CN201780043297.1A
Authority: CN
Inventors: 海因茨·卢本奥
Original assignee: Si Meng Limited-Liability Co Of Wanke
Current assignee: Nec Orkmnet
Priority date: 2016-07-13
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-03-15
Also published as: JP7098599B2; US20220072112A1; MX2019000415A; JP2022097591A; US11590215B2; RU2019100079A; CA3028549A1; US10821163B2; KR20230079514A; WO2018011289A1; EP3484503A1; US20190183996A1; AU2017295004A1; SG11201811258UA; BR112019000657A2; JP2019521154A; AU2017295004B2; KR20190027834A; IL263568A

Abstract

本发明涉及一种用于生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法，所述方法至少包括以下步骤：(a)用至少一种DNA分子转化沙门氏菌减毒菌株，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(b)表征步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆；以及(c)选择步骤(b)中表征的转化后的细胞克隆中的至少一个，并进一步表征所述至少一个所选择的转化后的细胞克隆。本发明进一步涉及通过根据本发明方法可获得的DNA疫苗。

Description

生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法

技术领域

背景技术

肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的减毒衍生物是将异源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过粘膜免疫途径被递送，即口服或经鼻，与胃肠外施用相比，这提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水平均引发强烈的体液和细胞免疫应答。批量制备成本相对较低，并且活细菌疫苗的制剂非常稳定。通过删除各种基因，包括毒力、调节和代谢基因，可以实现减毒。

减毒肠道沙门氏菌血清型伤寒Ty21a菌株(简称：伤寒沙门氏菌Ty21a)，已经被接受用于人并且以商品名(PaxVax Ltd，UK)分销。这种耐受良好的抗伤寒活体口服疫苗是通过野生型毒力细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2的化学诱变得到的，并且在galE基因中具有功能丧失突变，以及其他不太明确的突变。在现场试验中被证明是有效和安全的之后，它在许多国家被许可为伤寒疫苗。

WO 2014/005683公开了一种用于癌症免疫疗法特别是用于治疗胰腺癌的沙门氏菌减毒菌株，其包含编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子。

WO 2013/091898公开了一种用于培养缺乏半乳糖差向异构酶活性并含有重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变菌株的方法。

个体化的肿瘤学有可能彻底改变癌症患者将来的治疗方式。靶向患者特异性肿瘤抗原和肿瘤基质抗原的可能性正在引起越来越多的关注。个性化癌症免疫疗法途径的先决条件是快速且经济有效地生产满足高药物安全标准的患者特异性癌症疫苗的方法。

因此，非常需要用于癌症疫苗特别是患者特异性癌症疫苗的快速且稳健的制造方法，迄今为止，这尚未实现。

发明目的

鉴于现有技术，本发明的一个目的是提供一种用于制造用于癌症免疫疗法，特别是用于个体化癌症免疫疗法的DNA疫苗的新方法。这种制造方法将为改善癌症患者的治疗选择提供主要优势。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种用于生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法，所述方法至少包括以下步骤：(a)用至少一种DNA分子转化沙门氏菌的减毒菌株，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(b)表征步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆；以及(c)选择步骤(b)中表征的转化后的细胞克隆中的至少一个，并进一步表征所述至少一个所选择的转化后的细胞克隆。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种，更具体地是伤寒沙门氏菌，最具体地是伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体实施方案中，至少一个表达盒是真核表达盒。

在具体实施方案中，所述抗原选自由肿瘤抗原和肿瘤基质抗原组成的组，具体地选自由人肿瘤抗原和人肿瘤基质抗原组成的组，更具体地选自由人野生型肿瘤抗原、与人野生型肿瘤抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质、人野生型肿瘤基质抗原和与人野生型肿瘤基质抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质组成的组。在优选的实施方案中，抗原是肿瘤抗原，更优选是新抗原(neoantigen)。

在具体实施方案中，所述至少一种DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和在CMV启动子控制下的编码所述抗原的真核表达盒，具体地，其中所述DNA分子是DNA质粒，更具体地，其中所述DNA质粒包含如SEQ ID NO 1中所示的核酸序列。

在具体实施方案中，在步骤(a)中，所述沙门氏菌减毒菌株通过电穿孔被所述至少一种DNA分子转化，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒。

在具体实施方案中，步骤(b)包含以下子步骤(bi)到(biv)中的至少一个：(bi)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆随时间的细胞生长；(bii)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(biii)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征所述至少一种分离的DNA分子；(biv)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中所述至少一种抗原或其至少一种片段的表达。

在具体实施方案中，步骤(b)包括所述子步骤(bi)、(bii)、(biii)和(biv)中的一个、两个、三个或所有四个。

在具体实施方案中，步骤(c)包含以下子步骤(ci)到(cvi)中的至少一个：(ci)评估每ml步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆的细胞悬浮液的活细胞数；(cii)评估步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(ciii)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征该至少一种分离的DNA分子；(civ)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中至少一种抗原或其至少一种片段的表达；(cv)测试步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中细菌、真菌和/或病毒污染物的存在；(cvi)验证步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆的细菌菌株同一性。

在具体实施方案中，步骤(c)包括所述子步骤(ci)、(cii)、(ciii)、(civ)、(cv)和(cvi)中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个。

在具体实施方案中，通过在至少一种合适的选择性培养基中或其上培养步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆来在步骤(cv)中测试细菌和/或真菌污染物的存在。

在具体实施方案中，通过在溴百里酚蓝半乳糖琼脂上和/或在克氏铁琼脂上培养步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆和/或通过评估沙门氏菌O5和/或O9表面抗原的存在来在步骤(cvi)中验证细菌菌株同一性。

在第二方面，本发明涉及通过根据本发明的方法可获得的DNA疫苗。

在第三方面，本发明涉及根据本发明的DNA疫苗用于癌症免疫疗法。

本发明的详细描述

通过参考以下本发明的详细描述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。

在第一方面，本发明涉及一种用于生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法，所述方法至少包括以下步骤：(a)用至少一种DNA分子转化沙门氏菌减毒菌株，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(b)表征步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆；以及(c)选择步骤(b)中表征的转化后的细胞克隆中的至少一个，并进一步表征所述至少一个所选择的转化后的细胞克隆。

根据本发明的方法允许快速且经济有效地生产基于沙门氏菌的DNA疫苗。整个过程包括编码抗原的DNA分子的产生、转化到沙门氏菌受体菌株中、候选克隆的表征和选择和进一步表征待对患者施用的最终DNA疫苗，所花费的时间少于四周，具体地少于三周，通常只有16天。患者特异性DNA疫苗可以通过小批量生产方便地生产，这允许平行地同时产生、培养和表征几种转化的沙门氏菌克隆。逐步细胞克隆表征可最大限度地提高产品质量并最大限度地缩短过程周期。生产过程非常稳健，可以生产安全且良好表征的DNA疫苗。

在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指在施用后能够在受试者中诱导免疫应答的药剂。疫苗可以优选地预防、改善或治疗疾病。根据本发明的疫苗包含沙门氏菌，优选伤寒沙门氏菌Ty21a的减毒菌株。根据本发明的疫苗还包含DNA分子的至少一个拷贝，所述DNA分子包含至少一个表达盒，优选真核表达盒，其编码至少一种抗原或其至少一个片段，优选地，选自人肿瘤抗原、人肿瘤抗原的片段、人肿瘤基质抗原和人肿瘤基质抗原的片段。

根据本发明，减毒沙门氏菌菌株充当DNA分子的细菌载体，所述DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的表达盒，用于将所述DNA分子递送到靶细胞中。这种包含编码异源抗原(例如肿瘤抗原、肿瘤基质抗原或其片段)的DNA分子的递送载体被称为DNA疫苗。

基因免疫可能优于常规疫苗接种。靶DNA可以在相当长的一段时间内被检测到，从而充当抗原的贮库。一些质粒中的序列基序，如GpC岛，是免疫刺激性的，并且可以作为由LPS和其他细菌组分引起的免疫刺激促进的佐剂。

活细菌载体原位产生它们自身的免疫调节因子，例如脂多糖(LPS)，其可构成优于其他形式的施用(例如微胶囊化)的优点。此外，天然进入途径的使用证明是有益的，因为许多细菌，如沙门氏菌，通过Peyer氏斑(Peyer’s patch)的M细胞从肠腔流出，最终迁移到淋巴结和脾脏，因此允许将疫苗靶向免疫系统的诱导位点。伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗株迄今已被证明具有极好的安全性。在通过M细胞从肠腔排出后，细菌被吞噬细胞例如巨噬细胞和树突细胞摄取。这些细胞被病原体激活并开始分化，并可能迁移到淋巴结和脾脏。由于它们的减毒突变，伤寒沙门氏菌Ty21菌株的细菌不能在这些吞噬细胞中持续存在，而是在此时间点死亡。重组DNA分子被释放，然后通过特定的转运系统或通过内体渗漏转移到吞噬免疫细胞的胞质溶胶中。最后，重组DNA分子进入细胞核，在那里它们被转录，导致吞噬细胞的胞质溶胶中的抗原表达。针对编码的抗原的特异性细胞毒性T细胞由活化的抗原呈递细胞诱导。

迄今没有数据表明伤寒沙门氏菌Ty21a能够系统地进入血流。因此，活减毒伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗株允许特异性靶向免疫系统，同时表现出优异的安全性。

肠道沙门氏菌的减毒衍生物是将异源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过粘膜免疫途径(即口服或经鼻)被递送，与胃肠外施用相比，这提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室的水平均引发强烈的体液和细胞免疫应答。

在本发明的上下文中，术语“减毒的”是指与不含有减毒突变的亲本细菌菌株相比毒力降低的细菌菌株。减毒细菌菌株优选丧失其毒力但保留其诱导保护性免疫的能力。通过删除多种基因，包括毒力、调节和代谢基因，可以实现减毒。减毒细菌可以是被天然地发现的，或者它们可以在实验室中人工生产，例如通过适应新培养基或细胞培养物，或者它们可以通过重组DNA技术生产。施用约10¹¹CFU的根据本发明的沙门氏菌减毒菌株优选地导致少于5％，更优选少于1％，最优选少于1‰的受试者患沙门氏菌病。

在本发明的上下文中，术语“包含”(comprises)或“包含”(comprising)意指“包括但不限于”。所述术语旨在是开放式的，旨在具体说明任意陈述的特征、元素、整数、步骤或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、元素、整数、步骤、组分或其组群。因此，术语“包含”包括更具限制性的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。在一个实施方案中，在整个申请中，特别是在权利要求中使用的术语“包含”可以由术语“由......组成”代替。

包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒的至少一种DNA分子合适地是重组DNA分子，即工程化DNA构建体，优选由不同来源的DNA片段组成。DNA分子可以是线性核酸，或优选地，通过将编码至少一种抗原或其至少一种片段的开放阅读框引入表达载体质粒中而产生的环状DNA质粒。

在本发明的上下文中，术语“表达盒”是指在控制其表达的调控序列的控制下包含至少一种抗原编码基因或其至少一种片段的核酸单元。包含在沙门氏菌减毒菌株中的表达盒可以优选地介导靶细胞中所包括的编码至少一种抗原或其至少一种片段的开放阅读框的转录。

在本发明的上下文中，术语“转化后的细胞克隆”是指源自沙门氏菌受体菌株转化后获得的单细胞菌落的细胞群。由于细胞来源于从选择培养基琼脂平板上挑选的单个菌落，因此假设所有细胞均来自一个转化后的沙门氏菌单细胞。然而，源自转化后获得的这种单菌落的细胞群可包含污染物，例如其他细菌、真菌或病毒。

在具体的实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种，更具体地，是伤寒沙门氏菌，最具体地，是伤寒沙门氏菌Ty21a。

在具体的实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种。在具体的实施方案中，沙门氏菌减毒菌株是伤寒沙门氏菌Ty21a。减毒的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株是Typhoral 的活性成分，所述Typhoral也称为(由Crucell在瑞士的公司Berna Biotech Ltd.制造)。它是目前唯一获得批准的针对伤寒的活体口服疫苗。所述疫苗已经过广泛测试，并且已证明在患者毒性以及向第三方的传播方面是安全的(Wahdan等人,J.Infectious Diseases 1982,145:292-295)。所述疫苗已在40多个国家获得许可。的营销许可编号为PL15747/0001，日期为1996年12月16日。一剂疫苗含有至少2×10⁹个存活的伤寒沙门氏菌Ty21a菌落形成单位和至少5×10⁹个无活力的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞。

伤寒沙门氏菌Ty21a细菌菌株的生化特性之一是其不能代谢半乳糖。减毒细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，这使其与野生型伤寒沙门氏菌Ty2菌株区分开来。关于其血清学特征，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原(其是细菌外膜的多糖)并且缺乏O5-抗原，而O5-抗原又是鼠伤寒沙门氏菌的特征性成分。所述血清学特征支持将相应测试包括在一组对批量放行的同一性测试中的基本原理。

在具体实施方案中，伤寒沙门氏菌Ty21a受体菌株，即待被包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒的至少一个DNA分子转化的伤寒沙门氏菌Ty21a细胞可以基于市售的Typhoral胶囊生成，无需生物化学修饰。在琼脂平板上过夜培养后，单菌落可以被分离并在100ml TSB培养基中于37℃生长过夜。然后可以将培养物用15％无菌甘油配制、等分(1ml)、标记、冷冻、并在-75℃±5℃下储存作为主细胞库，等待使用。

在具体实施方案中，可以通过在溴百里酚蓝半乳糖琼脂和/或克氏铁琼脂上培养菌株来验证由此获得的伤寒沙门氏菌Ty21a受体菌株的细菌菌株同一性。在用作主细胞库的这种琼脂平板上的伤寒沙门氏菌Ty21a菌落的特征描述于表1中。

在具体实施方案中，噬菌体的检测可以通过在含有适当宿主和待测样品或噬菌体对照悬浮液的软琼脂覆盖层中进行平板接种来进行。为了提高测定的灵敏度，可以包括在先的富集步骤。在所述任选步骤中，将样品与适当的宿主细胞一起孵育4小时。随后，将这些富集培养物中的每一种的一个样品铺板。

在具体实施方案中，制备的受体菌株等分试样的活细胞数为10⁷至10¹¹，更具体地，10⁸至10¹⁰，最具体地，约10⁹CFU/ml。

在具体实施方案中，所述至少一个表达盒是真核表达盒。在本发明的上下文中，术语“真核表达盒”是指允许开放阅读框在真核细胞中表达的表达盒。已经表明诱导适当免疫应答所需的异源抗原的量可能对细菌有毒并导致细胞死亡、过度减毒或异源抗原的表达丧失。使用不在细菌载体中表达但仅在靶细胞中表达的真核表达盒可以克服所述毒性问题，并且表达的蛋白质可以表现出真核糖基化模式。

真核表达盒包含能够控制真核细胞中开放阅读框表达的调节序列，优选启动子和多腺苷酸化信号。优选选择包含在本发明的沙门氏菌减毒菌株所包含的重组DNA分子中的启动子和多腺苷酸化信号，以在待免疫的受试者细胞内发挥功能。合适的启动子尤其是用于生产人类DNA疫苗的启动子的实例包括但不限于来自巨细胞病毒(CMV)(如强CMV立即早期启动子)、猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)(如HIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)和来自劳氏肉瘤病毒(RSV)的启动子以及来自人类基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的启动子。在一个具体实施方案中，真核表达盒含有CMV启动子。在本发明的上下文中，术语“CMV启动子”是指强立即早期巨细胞病毒启动子。

合适的多腺苷酸化信号尤其是用于生产人类DNA疫苗的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于牛生长激素(BGH)多腺苷酸化位点、SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。在一个具体实施方案中，包含在本发明的沙门氏菌减毒菌株所包含的DNA分子中的真核表达盒包含BGH多腺苷酸化位点。

除了表达异源抗原编码基因所需的调节元件，如启动子和多腺苷酸化信号，其他元件也可包括在重组DNA分子中。这些另外的元件包括增强子。增强子可以是，例如，人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒增强子，例如来自CMV、RSV和EBV的增强子。

调节序列和密码子通常是物种依赖性的，因此为了使蛋白质生产最大化，优选地选择对待免疫的物种有效的调节序列和密码子。本领域技术人员可以生产在给定受试者物种中有功能的重组DNA分子。

在具体实施方案中，所述抗原选自由肿瘤抗原和肿瘤基质抗原组成的组。具体地，所述抗原选自由人肿瘤抗原和人肿瘤基质抗原组成的组，更具体地，选自由人野生型肿瘤抗原、与人野生型肿瘤抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质、人野生型肿瘤基质抗原和与人野生型肿瘤基质抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质组成的组。在具体实施方案中，至少一个表达盒编码至少一种抗原的至少一个片段，具体地，肿瘤抗原的至少一个片段和/或肿瘤基质抗原的至少一个片段，更具体地，至少一种人肿瘤抗原和/或至少一种人肿瘤基质抗原的至少一个片段，包括与人野生型肿瘤抗原或人野生型肿瘤基质抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质片段。在具体实施方案中，所述至少一种抗原的至少一种片段包含标准抗原的至少5个连续氨基酸，更具体地，标准抗原的至少6、7、8、9、10、15、20、25个氨基酸。在具体实施方案中，所述至少一种抗原片段包含标准抗原的至少一个表位，更具体地，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、80或100个表位。在具体实施方案中，所述至少一种抗原片段包含1至100、或1至75、或1至50、或1至25个表位，具体地1至10个表位，更具体地1至5个表位。在本发明的上下文中，术语“表位”是指给定抗原的一部分，其参与抗原与抗原结合分子如抗体之间的特异性结合。表位可以是连续的，即由抗原中存在的相邻结构元件形成，或者是不连续的，即由位于抗原的一级序列中(例如在抗原蛋白的氨基酸序列中)的不同位置但是在抗原例如在体液中采用的三维结构中非常接近的结构元件形成。根据本发明的教导，抗原的至少一个片段可以包含标准抗原的任何数量的氨基酸，只要所述抗原的片段是免疫原性的。优选地，如通过ELISA或通过ELISpot测量的，与标准抗原相比，所述至少一种抗原片段的免疫原性降低小于50％，小于40％，小于30％，小于20％，小于10％，小于5％或小于1％。

在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中表达的抗原。通常，这种肿瘤抗原优先由肿瘤细胞表达，即它们不被非恶性细胞表达或仅被弱表达，或仅在某些非恶性组织中表达。相反，肿瘤基质抗原由肿瘤基质表达，例如由肿瘤脉管系统表达。这种肿瘤基质抗原的一个实例是VEGFR-2，其由肿瘤脉管系统高度表达。在具体实施方案中，编码的VEGFR-2抗原具有如SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列或与其具有至少约80％的序列同一性。肿瘤基质抗原的另一个实例是人成纤维细胞活化蛋白(FAP)。肿瘤抗原可以选自通常在大部分给定类型的癌症或一般癌症中表达的已知肿瘤抗原。术语“肿瘤抗原”还包括新抗原，即由肿瘤特异性突变引起的肿瘤特异性抗原。这些新抗原可以是患者特异性的，也可以是发生在许多癌症患者身上的。在具体实施方案中，肿瘤抗原可以选自由以下组成的组：具有如SEQ ID NO 3中所示氨基酸序列的人威尔姆斯氏瘤(Wilms’Tumor)蛋白(WT1)和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 4中所示氨基酸序列的人间皮素(MSLN)和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 5中所示氨基酸序列的人CEA和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 6中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质、具有如SEQ ID NO 7中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质和具有如SEQ ID NO 8中所示氨基酸序列的CMV pp65和与其具有至少约80％序列同一性的蛋白质。

在具体实施方案中，人VEGFR-2具有如SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列，人威尔姆斯氏瘤蛋白(WT1)具有如SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列，人间皮素(MSLN)具有如SEQID NO 4中所示的氨基酸序列，人CEA具有如SEQ ID NO 5中所示的氨基酸序列，并且CMVpp65具有如SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8中所示的氨基酸序列。

肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原也可以是患者特异性肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原，即显示为由一个特定患者的肿瘤细胞或肿瘤基质表达的抗原。患者特异性肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原可以通过在mRNA或蛋白质水平上评估患者肿瘤和/或肿瘤基质的表达谱来鉴定。或者，可以评估患者对肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的预先存在的T细胞免疫应答。在鉴定出患者特异性肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原后，根据本发明的方法允许快速制备适用于癌症免疫疗法的安全的、充分表征的患者特异性DNA疫苗。通常，整个制备过程包括编码抗原的表达质粒的产生、转化到沙门氏菌受体菌株中、候选克隆的表征和选择和进一步表征待对患者施用的最终DNA疫苗，所花费的时间少于四周，具体地少于三周，通常只有16天。

在本发明的上下文中，术语“与给定序列的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原具有至少约80％序列同一性的蛋白质”是指与给定标准蛋白质的氨基酸序列和/或编码氨基酸序列的核酸序列不同的蛋白质。蛋白质可以是天然来源的，例如肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的同源物，或工程化蛋白质。已知密码子的使用在物种之间是不同的。因此，当在靶细胞中表达异源蛋白质时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是有必要的，或至少是有帮助的。用于设计和构建给定蛋白质的衍生物的方法是本领域普通技术人员所熟知的。

与给定的标准氨基酸序列相比，与给定氨基酸序列的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原具有至少约80％序列同一性的蛋白质可含有一个或多个氨基酸的一个或多个突变，包含添加、缺失和/或取代。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或取代的氨基酸可以是连续的氨基酸，或者可以散布在蛋白质的氨基酸序列的长度上，所述蛋白质与给定的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原具有至少约80％的序列同一性。根据本发明的教导，可以添加、删除和/或替代任意数量的氨基酸，只要与标准肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的序列同一性至少约为80％并且突变的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原蛋白是免疫原性的。优选地，如通过ELISA或通过ELISpot测量的，与给定氨基酸序列的标准肿瘤抗原或肿瘤基质抗原相比，与给定氨基酸序列的标准肿瘤抗原或肿瘤基质抗原具有至少约80％序列同一性的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的免疫原性降低小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。用于设计和构建蛋白质同源物以及用于测试这些同源物的免疫原性潜力的方法是本领域普通技术人员所熟知的。在具体实施方案中，与给定氨基酸序列的给定肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的序列同一性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、或最具体地至少约95％。用于确定序列同一性的方法和算法，包括亲本蛋白质和其相对于亲本序列具有缺失、添加和/或取代的衍生物的比较，是本领域普通技术人员所熟知的。在DNA水平上，由于遗传密码的简并性，编码与给定氨基酸序列的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原具有至少约80％序列同一性的蛋白质的核酸序列可以在更大程度上不同。

在具体实施方案中，所述至少一种DNA分子包含作为选择标记的卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和在CMV启动子控制下的编码所述抗原的真核表达盒，具体地，其中所述DNA分子是DNA质粒，更具体地，其中DNA质粒包含SEQ ID NO 1中所示的核酸序列。

在特定的实施方案中，DNA分子是衍生自市售pVAX1^TM表达质粒(Invitrogen,SanDiego,California)的重组DNA分子。pVAX1是用于在真核细胞中表达蛋白质的质粒载体，其特别设计用于通过修饰载体pcDNA3.1来开发DNA疫苗。去除在细菌中复制或在哺乳动物细胞中表达重组蛋白非必需的序列以限制与人基因组可能具有同源性的DNA序列，并最小化染色体整合的可能性。此外，pcDNA3.1中的氨苄青霉素抗性基因被卡那霉素抗性基因取代，因为氨基糖苷类抗生素不太可能引起人类的过敏反应。

pVAX1^TM载体含有以下元件：用于在哺乳动物细胞中高水平表达的人巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子、用于有效转录终止和mRNA多聚腺苷酸化的牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号、以及作为选择标记的卡那霉素抗性基因。

此外，pVAX1^TM含有用于插入目的基因的多克隆位点以及多克隆位点上游的T7启动子/引发位点和下游的BGH反向引发位点，以允许克隆基因的测序和体外翻译。

市售pVAX1^TM表达载体通过用pBR322的低拷贝pMB1复制起点替换高拷贝pUC复制起点进一步修饰。进行低拷贝修饰是为了减少代谢负担并使构建体更稳定。将产生的表达载体骨架命名为pVAX10。重要的是，从使用293T人细胞系的转染实验中获得的数据证明pVAX10上编码的卡那霉素抗性基因不在人细胞中翻译。因此，表达系统符合法规要求。

在具体实施方案中，通过将至少一种抗原cDNA或其至少一种片段克隆到pVAX10载体骨架中来产生待转化到减毒沙门氏菌受体菌株中的至少一种DNA分子，其包含至少一个编码至少一种抗原或其至少一种片段的表达盒。载体骨架可以从质粒pVAX10.VR2-1中分离，其含有用于将人VEFGR-2克隆到pVAX10载体骨架中的cDNA。VEGFR-2cDNA可以从pVAX10.VR2-1切除，并且然后pVAX10载体骨架可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。

在具体实施方案中，cDNA插入物的合成通过双链体外基因合成进行。合成过程的步骤如图3所示。

在具体的实施方案中，在步骤(a)中，所述沙门氏菌减毒菌株通过电穿孔被所述至少一种DNA分子转化，所述DNA分子包含至少一种编码至少一种抗原或其至少一种片段的表达盒。

在具体的实施方案中，基于市售的Typhoral胶囊的伤寒沙门氏菌Ty21a菌株主细胞库(MCB)用作制备批量生产克隆的起始菌株。为了获得用于电穿孔的感受态细胞，将伤寒沙门氏菌Ty21a MCB重悬于500ml冰冷的H₂O中并离心。在冰冷水/10％甘油中再洗涤两次后，将沉淀重悬于2ml 10％甘油(无动物成分)中、等分(50μl)并在干冰上冷冻。在<-70℃下新鲜生产新的感受态细胞批次，此后感受态细胞批次储存最多4周。为了转化，将一等份感受态细胞解冻并在3-5μl编码所需抗原的质粒DNA存在下进行电穿孔。在37℃下在1ml LB(ACF)培养基中短暂孵育一段时间后，将细胞悬浮液在含有卡那霉素(25和50μg/mL)的LB(ACF)琼脂平板上划线。将所述平板在37℃下孵育过夜。

进一步测试至少一个单菌落，通常1至10个菌落，具体地，2至5个菌落，以允许选择至少一个转化的细胞克隆用于批量生产克隆的制备。方便地，使用三个单菌落接种含有卡那霉素(50μg/ml)的3ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)。将培养物在37℃孵育过夜。分离质粒DNA，并将选择的克隆在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中扩增。将培养物与10％(v/v)甘油混合、等分(1ml)并在-70℃下冷冻储存。

在具体实施方案中，在步骤(b)中评估以下分析参数中的至少一个用于选择批量生产克隆：通过OD600、pH和CFU测定的在选择性培养基中培养时随时间的生长动力学；冷冻保存后的质粒稳定性(％PS)；提取质粒DNA并通过质粒限制性分析鉴定其同一性；以及在将质粒DNA瞬时转染到真核细胞系中后抗原表达效力的测定。在具体实施方案中，然后将批量生产克隆用于制备原料药(drug substance,DS)，然后在步骤(c)中进一步表征所述原料药以建立待施用于患者的最终药品(drug product,DP)。

因此，在具体实施方案中，步骤(b)包含以下子步骤(bi)到(biv)中的至少一个：(bi)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆随时间的细胞生长；(bii)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(biii)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征所述至少一种分离的DNA分子；(biv)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中所述至少一种抗原或其至少一种片段的表达。

具体地，步骤(bii)可以在冷冻和随后解冻所述至少一个转化后的细胞克隆后进行。

具体地，步骤(biv)可以通过以下步骤进行：用从沙门氏菌受体菌株转化后获得的单菌落中分离的质粒DNA转染HEK293T细胞并使用适于所编码的抗原的抗体对细胞提取物进行Western印迹分析。

在具体实施方案中，步骤(b)仅包括子步骤(bi)、(bii)和(biii)。

在考虑从生长特征、质粒稳定性、质粒同一性和/或蛋白质表达研究中获得的数据后，选择至少一个转化的细胞克隆作为批量生产克隆。在具体实施方案中，然后将批量生产克隆用于制备原料药(DS)，然后在步骤(c)中进一步表征所述原料药以建立待施用于患者的最终药品(DP)。

药品的制造概述描绘于图1和2中。

原料药(DS)的制造可以方便地如下所述进行：DS通常按照GMP要求制造。将至少一个批量生产克隆转移至含有TSB培养基加25μg/ml卡那霉素的三个50ml烧瓶中(预培养物1)。菌落在30℃下生长9小时±1小时至最大OD₆₀₀<1.0。每个烧瓶的搅拌设定为120rpm。选择具有最高OD值的烧瓶用于进一步培养。将体积为50ml的预培养物1转移至含有1000ml TSB培养基加25μg/ml卡那霉素的烧瓶中(主培养物)。在30℃下孵育9小时±1小时后，在搅拌设定为180rpm下，使细菌生长至0.9至1.5之间的目标OD₆₀₀。发酵完成后，将甘油加入培养物中至终浓度为15％(w/w)。将悬浮液混合，然后等分(1ml)到2ml冷冻瓶中。将小瓶标记并立即在-75℃±5℃冷冻储存。应理解，所描述的处理工作流程仅描述了制造原料药的一种可能方式。当然，工艺参数，例如培养物体积，可以改变。

然后进一步测试原料药以将其稀释至最终药品浓度。已经为二者：原料药和药品制定了放行标准。测试表2和表3中总结的至少一种性质。

因此，在具体实施方案中，步骤(c)包含以下子步骤(ci)到(cvi)中的至少一个：(ci)评估每ml步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆的细胞悬浮液的活细胞数；(cii)评估步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；(ciii)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征所述至少一种分离的DNA分子；(civ)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中至少一种抗原或其至少一种片段的表达；(cv)测试步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中细菌、真菌和/或病毒污染物的存在；(cvi)验证步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆的细菌菌株同一性。

在具体实施方案中，子步骤(cii)在冷冻和随后解冻所述至少一个转化的细胞克隆后进行。

在具体实施方案中，步骤(c)包括所述子步骤(ci)、(cii)、(ciii)、(civ)、(cv)和(cvi)的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个。

在具体实施方案中，步骤(c)包括子步骤(ci)、(cii)、(ciii)、(cv)和(cvi)。

具体地，活细胞的数量可以通过在琼脂平板上铺板连续稀释液来确定。方便地，制备细菌悬浮液低至稀释因子10^-8的连续稀释液并将其涂布在琼脂平板上。适当孵育后，计数菌落。计数应该在菌落清晰可见但不是太大时开始。

可以基于含有沙门氏菌的质粒的卡那霉素抗性来确定质粒稳定性。细菌细胞在含有卡那霉素的TSB上生长表明存在编码卡那霉素抗性基因的质粒。比较在有和没有卡那霉素的TSB板上铺板的相同样品的CFU，可以确定携带质粒的细菌的部分。具体地，制备细菌悬浮液的连续稀释液并铺板到任选含有抗生素卡那霉素的TSB板上。适当孵育后，计数菌落。计数应该在菌落清晰可见但不是太大时开始。如下通过比较有和没有卡那霉素的TSB上的菌落形成单位来计算质粒稳定性：PST＝(有卡那霉素的CFU/没有卡那霉素的CFU)×100。

可以通过比较消化后的从疫苗株分离的质粒的大小模式与大小标记来定义质粒同一性。具体地，从载体中分离重组质粒，并在单独的反应中用至少一种，通常至少两种不同的消化酶/组合物消化适当的时间。停止反应并在琼脂糖凝胶上分析。

可以通过质粒的经典DNA测序进一步确定遗传构建体的同一性。通过测序确定整个质粒的序列，并与质粒的原始序列比对。具体地，从沙门氏菌制备并定量质粒。然后将其在大肠杆菌中重新转化、分离、定量并用于测序反应。

可以通过在质粒转染到真核细胞系后进行表达分析和Western印迹来验证真核细胞中所述至少一种抗原或其至少一种片段的表达。具体地，从载体菌株中分离重组构建体并用于转染合适的真核永久细胞系。由于存在真核启动子，编码序列被表达了。在适当孵育、蛋白质分离和随后的Western印迹后，证明了重组蛋白质的存在并在半定量基础上与标准材料进行比较。

在具体的实施方案中，通过在至少一种合适的选择性培养基中或其上培养步骤(c)中选择的至少一个转化的细胞克隆，在步骤(cv)中测试细菌和/或真菌污染物的存在。具体地，为了确定总好氧细菌、霉菌和真菌的数量，并确认不存在特定病菌大肠杆菌、沙门氏菌种、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌种，可以使用合适的选择性培养基，根据欧洲药典的专著04/2009：1055<伤寒疫苗(活体口服Ty 21a菌株)>测试样品。具体地，所述测试根据欧洲药典Ph.Eur.专著2.6.12和2.16.13进行。

在具体实施方案中，通过在溴百里酚蓝半乳糖(BTB-Gal)琼脂和/或克氏铁琼脂(KIA)上生长步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆和/或通过评估沙门氏菌O5和/或O9-表面抗原的存在，在步骤(cvi)中验证细菌菌株同一性。

生化同一性测试依赖于检测微生物的生物化学性质(主要是半乳糖发酵和硫化物产生)的两种选择性培养基。与其他沙门氏菌物种相比，减毒疫苗株Ty21a不能代谢半乳糖。在BTB-Gal-琼脂上生长导致绿色至黄色的菌落而不改变培养基的颜色。相反，在BTB-Gal上培养野生型沙门氏菌导致培养基强烈的黄色着色，这是由于半乳糖代谢期间的酸产生以及随后pH指示剂(溴百里酚蓝)的颜色变化。当在BTB-Gal上生长时，伤寒沙门氏菌Ty21a可以构建形态学上不同的亚克隆。这种另外的类型的特征在于特征性沙门氏菌菌落之上和之间的小的灰色菌落的减缓生长。

克氏铁琼脂用于区分肠杆菌成员。所述培养基的特征是基于肠杆菌代谢右旋葡萄糖和乳糖以及释放硫化物的能力。通过pH指示剂的颜色从红色到黄色的变化来指示，Ty21a疫苗株可以代谢右旋葡萄糖。然而，伤寒沙门氏菌Ty21a菌株不能将硫酸盐还原为硫化物，而其他沙门氏菌在硫化氢生产过程中使培养基的颜色变黑并释放出导致琼脂内形成气泡的气体。伤寒沙门氏菌Ty21a的生长可导致气体产生，但对于所述菌株不典型。不能代谢任一种糖的生物如铜绿假单胞菌不会改变培养基的颜色。

具体地，细菌菌株同一性可以如下所述进行生物化学验证。使用适当的划线方法将一环(loop)完全解冻的悬浮液转移至BTB-Gal-琼脂平板以获得单菌落。对照生物体铜绿假单胞菌(ATCC 9027)和鼠伤寒沙门氏菌(Moskau)的接种通过将(用于微生物培养的储存系统)的珠子转移到琼脂平板上并随后划线来进行。对于KIA的接种，首先将相同小瓶的环(珠子)划线到斜面的表面上，然后横向插入到末端(butt)。将培养基在37℃下孵育48小时。

可以使用合适的多克隆抗血清或单克隆抗体来区分沙门氏菌属的不同血清型。减毒的重组伤寒沙门氏菌Ty21a菌株含有O9-抗原，它是外膜的多糖。伤寒沙门氏菌携带O9但缺乏O5，而O5又是鼠伤寒沙门氏菌的特征。通过组合对O5和O9抗原的测试，可以很好地区分伤寒沙门氏菌Ty21a菌株与其他细菌，特别是与野生型沙门氏菌菌种。具体地，血清分型可以如下所述进行。将一滴抗血清(O5或O9)转移到室载玻片上。从KIA的下(湿)侧取出一环含有菌落的材料并放置在抗血清旁边。用环将溶液混合。所得悬浮液应略微混浊。通过擦拭室载玻片几次来使悬浮液分散。在黑色背景下2分钟后评估反应。

在第二方面，本发明涉及可通过根据本发明的方法获得的DNA疫苗。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法包括个体化癌症免疫疗法。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法还包括施用一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株，所述另外的沙门氏菌减毒菌株包含DNA分子的至少一个拷贝，所述DNA分子包含编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的表达盒，具体地，其中所述一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌Ty21a，更具体地，其中所述一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株包含编码以下的沙门氏菌减毒菌株：人VEGFR-2和/或人威尔姆斯氏瘤蛋白(WT1)和/或人类间皮素(MSLN)和/或人类CEA和/或人CMV的pp65。

将靶向两种不同的肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的DNA疫苗相结合可具有协同抗肿瘤作用。具体地，同时靶向不同的肿瘤抗原/肿瘤基质抗原可以使肿瘤逃逸的风险最小化。将靶向肿瘤抗原的DNA疫苗与靶向肿瘤基质抗原的DNA疫苗相结合可能证明特别有效，因为肿瘤细胞和肿瘤基质同时受到攻击。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株与所述一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株共同施用。

在本发明的上下文中，术语“共同施用”(“co-administration”或“co-administer”)意指在连续三天内，更具体地，在连续两天内，更具体地，在同一天，更具体地，在12小时内施用两种不同的沙门氏菌减毒菌株。最具体地，在本发明的上下文中，术语“共同施用”是指同时施用两种不同的沙门氏菌减毒菌株。

在具体实施方案中，患者可首先接受基于Ty21a的DNA疫苗，其靶向通常在患者患有的癌症类型中过表达的肿瘤抗原或肿瘤基质抗原。在所述“第一线”治疗期间，可以鉴定患者特异性肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原。为此目的，可以在第一步中评估患者的肿瘤和/或基质抗原表达模式和/或患者对肿瘤和/或基质抗原的预先存在的T细胞免疫应答，例如，通过针对患者特异性肿瘤和/或基质抗原模式的伴随诊断。根据本发明的方法然后允许快速建立安全且充分表征的患者特异性(个体化)DNA疫苗，其在鉴定患者特异性肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原后仅数周即可用作“第二线”或主要治疗。

在具体实施方案中，癌症免疫疗法伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。为了治愈癌症，完全根除癌症干细胞可能是必不可少的。为了获得最大功效，不同治疗方法的组合可能是有益的。

在本发明的上下文中，术语“生物癌症疗法”是指涉及使用活生物体、源自活生物体的物质或此类物质的实验室生产型式的癌症疗法。一些针对癌症的生物疗法旨在刺激身体的免疫系统以对抗癌细胞(所谓的生物癌症免疫疗法)。生物癌症治疗方法包括肿瘤抗原的递送、作为药物的治疗性抗体的递送、免疫刺激性细胞因子的施用和免疫细胞的施用。治疗性抗体包括靶向肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的抗体以及用作检查点抑制剂的抗体，例如但不限于抗PD-1，抗PD-L1和抗-CTLA4。

可以与本发明的沙门氏菌减毒菌株组合使用的化疗药剂可以是，例如：吉西他滨(gemcitabine)、氨磷汀(amifostine)(乙醇)、卡巴他赛(cabazitaxel)、顺铂(cisplatin)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、放线菌素D(dactinomycin)、多西他赛(docetaxel)、氮芥(mechlorethamine)、链脲佐菌素(streptozocin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、卡那嗪(carrnustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，尼莫司汀(nimustine)(ACNU)、多柔比星(doxorubicin)(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxorubicin lipo)(doxil)、亚叶酸(folinic acid)、吉西他滨(gemcitabine)(gemzar)、柔红霉素(daunorubicin)、柔红霉素脂质体(daunorubicin lipo)(daunoxome)、甲基苄肼(procarbazine)、酮康唑(ketokonazole)、丝裂霉素(mitomycin)、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)，长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、博来霉素(bleomycin)，紫杉醇(paclitaxel)(紫杉醇)，多西紫杉醇(docetaxel)(taxotere)，阿地白介素(aldesleukin)、天冬酰胺酶(asparaginase)，白消安(busulfan)，卡铂(carboplatin)、克拉屈滨(cladribine)、喜树碱(camptothecin)、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、达卡巴嗪(dacarbazine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、羟基脲(hydroxyurea)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊达比星(idarubicin)、美司钠(mesna)、干扰素α(interferon alpha)、干扰素β(interferonbeta)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、拓扑替康(topotecan)、亮丙瑞林(leuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、奥沙利铂(oxaliplatin)、普力霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素(plicamycin)、链脲霉素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷(teniposide)、睾内脂(testolactone)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、噻替哌(thiotepa)、乌拉莫司汀(uracil mustard)、长春瑞滨(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及其组合

取决于可能的副作用的发生，包括用抗生素或抗炎剂治疗也可能是有利的。

如果发生类似于组胺、白三烯或细胞因子介导的超敏反应的不利事件，可使用针对发热、过敏反应、血压不稳定、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选择。在不需要的T细胞衍生的自身攻击的情况下，治疗选择源自干细胞移植后应用的急性和慢性移植物对抗宿主病的标准治疗方案。提出环孢菌素和糖皮质激素作为治疗选择。

在不太可能的全身性伤寒沙门氏菌Ty21a型感染的情况下，推荐适当的抗生素治疗，例如使用氟喹诺酮类(fluoroquinolones)，包括环丙沙星(ciprofloxacin)或氧氟沙星(ofloxacin)。胃肠道的细菌感染将用各自的药剂治疗，例如利福昔明(rifaximin)。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株在化学疗法或放射疗法治疗周期之前或期间或在生物癌症治疗之前或期间，或在化学疗法或放射疗法治疗周期或生物癌症疗法之前和期间施用。所述方法可具有以下优点：化学疗法或放射疗法可在癌症免疫力增强的条件下进行。

在具体实施方案中，沙门氏菌减毒菌株在化疗或放射疗法治疗周期后或在生物癌症治疗后施用。

在具体的实施方案中，口服施用沙门氏菌减毒菌株。口服施用比肠胃外施用更简单、更安全、更舒适。相反，静脉内施用活细菌疫苗最初引起与败血症类型的安全风险相关的细菌血症，因此需要仔细观察和监测临床症状，例如细胞因子释放。口服施用本发明的减毒菌株可至少部分地克服所述风险。然而，必须指出的是，本发明的沙门氏菌减毒菌株也可以通过任意其他合适的途径施用。优选地，向受试者施用治疗有效剂量，并且所述剂量取决于具体应用、恶性肿瘤的类型、受试者的体重、年龄、性别和健康状况、施用方式和制剂等。根据需要施用可以是单次或多次。

本发明的沙门氏菌减毒菌株可以以溶液、悬浮液、冻干物或任意其它合适的形式提供。它可以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合提供。还可以包括用于调节pH值的试剂、缓冲剂、用于调节毒性的试剂等。在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”是指当施用于哺乳动物(例如人)时在生理上可耐受的并且通常不会产生不良反应的分子实体和药物组合物的其他成分。术语“药学上可接受的”还可以表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于哺乳动物，更具体地，用于人类的。

本发明的疫苗在相对低的剂量下令人惊讶地有效。在具体的实施方案中，单剂量为约10⁵至约10¹¹菌落形成单位(CFU)，具体地，约10⁶至约10¹⁰菌落形成单位(CFU)，更具体地，约10⁶至约10⁹菌落形成单位(CFU)，更具体地，约10⁶至约10⁸菌落形成单位(CFU)，最具体地，约10⁶至约10⁷菌落形成单位(CFU)。施用低剂量的这种活细菌疫苗可以将排泄风险最小化并从而减少传播给第三方的风险。

在本文中，术语“约”或“近似”意指在给定值或范围的3倍之内，或者在2倍之内，包括在1.5倍之内。

在特定实施方案中，沙门氏菌减毒菌株用于个体化癌症免疫疗法，所述个体化癌症免疫疗法包括测量至少一种肿瘤抗原和/或至少一种肿瘤基质抗原的表达和/或针对患者的至少一种肿瘤抗原和/或至少一种肿瘤基质抗原的免疫前应答的步骤，例如，通过针对患者的特异性肿瘤和/或基质抗原模式的伴随诊断。

附图说明

图1：药品生产概述

图2：药品生产流程图

图3：表达质粒合成

图4：VXM04克隆生长动力学-OD₆₀₀

图5：VXM04克隆生长动力学-CFU/ml

图6：VXM04克隆生长动力学-培养基中的pH

图7：VXM08克隆生长动力学-OD₆₀₀

图8：VXM08克隆生长动力学-CFU/ml

图9：VXM08克隆生长动力学-培养基中的pH

图10：VXM01克隆生长动力学-OD₆₀₀

图11：VXM01克隆生长动力学-CFU/ml

图12：VXM01克隆生长动力学-培养基中的pH

实施例

实施例1：编码抗原/抗原片段的cDNA的合成

通过双链体外基因合成进行cDNA插入物的合成。合成了编码五种不同肿瘤抗原和一种肿瘤基质抗原的cDNA。合成的cDNA列于表4中。

将待合成的cDNA序列细分为40-50个碱基的单个寡核苷酸。设计的寡核苷酸重叠并对应于两条DNA链。通过化学合成制备这些寡核苷酸。将体外合成的正向和反向寡核苷酸在Eppendorf管中合并，并通过与T4多聚核苷酸激酶和ATP一起孵育而5'磷酸化。磷酸化的正向和反向寡核苷酸在95℃变性。通过逐步冷却(1°/min)混合物使互补的寡核苷酸退火。在退火过程后，使用热稳定的Taq DNA连接酶连接对齐的寡核苷酸。在热循环仪中重复变性和退火过程若干次，以解决错配的碱基对，并在片段的整个长度上实现互补链的完全匹配。为了增加连接片段的产量，在完成连接步骤后使用在片段的向外位置退火的引物进行PCR。通过制备型琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。

实施例2：将抗原cDNA克隆到表达质粒中

通过NheI/XhoI将实施例1中合成的cDNA克隆到质粒pVAX10中。

将由此产生的重组质粒转化到大肠杆菌中，分离并测序。确定合成质粒的完整序列并与相应的标准序列比对。序列验证的结果总结于表5。

在hMSLN的质粒位置1392(腺嘌呤而不是鸟嘌呤)(对应于cDNA中第657位)的开放阅读框中检测到一个错配突变。这种沉默突变(摆动位置)不会导致MSLN的共有氨基酸改变。因此，突变序列被接受用于转化伤寒沙门氏菌Ty21a和产生批量生产克隆。对于所有其他质粒，克隆的序列显示与标准序列100％的序列同一性。

实施例3：用编码质粒的抗原转化伤寒沙门氏菌Ty21a

用实施例2中获得的5种重组质粒转化伤寒沙门氏菌Ty21a。为此目的，从琼脂平板上挑取单个伤寒沙门氏菌Ty21a菌落，并在37℃下在100mL TSB培养基中生长过夜。然后将培养物用15％无菌甘油配制、等分(1ml)、标记、冷冻、并在-75℃±5℃下储存作为主细胞库，等待使用。制备两种分离株，命名为VAX.Ty21-1和VAX.Ty21-2，用于进一步使用。

通过使分离株在溴百里酚蓝半乳糖琼脂和/或克氏铁琼脂上生长来验证制备的分离株的细菌菌株同一性。所获得的用作主细胞库的细胞菌落的特征描述于表6中。

将分离株VAX.Ty21-1用作用于用实施例2中产生的重组质粒转化的受体菌株。将分离株VAX.Ty21-1的冷冻甘油原液在LB琼脂平板(ACF大豆蛋白胨)上划线。挑取一个单菌落，并在37℃下在3ml LB培养基(ACF大豆蛋白胨)中培养过夜。所述培养物用于接种2×300ml LB培养基，将其在37℃下进一步孵育直至OD600达到0.5。为了获得用于电穿孔的感受态细胞，通过在4℃下离心收获培养物。将沉淀重悬于500ml冰冷的H2O中并再次离心。在冰冷水/10％甘油中再洗涤两次后，将沉淀重悬于2ml 10％甘油(无动物成分)中、等分(50μl)并在干冰上冷冻。

为了转化，将每个重组质粒的一等份感受态细胞解冻，并各自用3-5μl重组质粒DNA进行电穿孔。在37℃下在1ml LB(ACF)培养基中短暂孵育一段时间后，将细胞悬浮液在含有卡那霉素(25和50μg/ml)的LB(ACF)琼脂平板上划线。将平板在37℃下孵育过夜。

然后选择每个转化反应的三个单菌落并用于接种含有卡那霉素(50μg/ml)的3mlLB培养基(ACF大豆蛋白胨)。将培养物在37℃孵育过夜。分离质粒DNA，通过限制性分析确认质粒同一性。

将选择的克隆在含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中扩增。将培养物与10％(v/v)甘油混合，等分(1ml)并在-70℃下冷冻储存。分离重组Ty21a克隆的质粒并进行完整测序。确认每个所选克隆的质粒与标准序列的100％序列同一性，除了hMSLN克隆鉴定出了一个沉默突变(参见表5)。

所产生的转化后的克隆列于表7中。

实施例4：转化后的细胞克隆的表征和批量生产克隆选择

评估以下分析参数以选择VXM01、VXM04和VXM08批量生产克隆用于建立相应原料药。

-通过OD₆₀₀、pH和CFU确定的在选择性培养基中培养时随时间的生长动力学

-低温保存后的质粒稳定性(％PS)

-提取质粒DNA并通过质粒限制性分析确认同一性

-在将质粒DNA瞬时转染到真核细胞系中后测定抗原表达效力

测定表7中列出的VXM01、VXM04和VXM08转化克隆的生长特征。用于生长扩增测试的所有六个VXM01克隆(VAX.11-01、VAX.11-02、VAX.21-01、VAX.21-02、VAX.21-03)生长良好，但只有克隆VAX.11-02生长到与衍生其的Ty21a分离株相同的水平。VXM04克隆VXM04_K06424、VXM04_K06425和VXM04_K06426的生长特征示于图4、图5和图6中。所有三个克隆在培养基中显示出相当的生长速率，对克隆VXM04_K06426具有轻微的生长优势。关于VXM08候选物(VXM08h_K08.1.1、VXM08h_K08.2.2和VXM08h_K08.4.4)，所有克隆均显示出相当的生长特征，但克隆VXM08h_K08.1.1优于其他两个克隆。

六个VXM01克隆的测试显示VAX.11-02的质粒稳定性最高，然后是VAX.11-03和VAX.21-02。在冷冻前后，三种VXM04克隆在质粒稳定性方面没有明显差异。对三个VXM08克隆的测试显示VXM08h_K08.4.4的质粒稳定性最高，然后是VXM08h_K08.1.1和VXM08h_K08.2.2。

从六个VXM01克隆中的每一个分离的质粒DNA的限制性分析揭示了限制性片段的预期模式。可以从三个克隆中分离出相当量的质粒DNA。

从三个VXM04克隆中的每一个分离的质粒DNA的限制性分析揭示了限制性片段的预期模式。可以从三个克隆中分离出相当量的质粒DNA。

从三个VXM08克隆中的每一个分离的质粒DNA的限制性分析揭示了限制性片段的预期模式。可以从三个克隆中分离出相当量的质粒DNA。

用分离自六个VXM01克隆的质粒DNA转染HEK293T细胞并对细胞提取物进行Western印迹分析后，根据对Western印迹凝胶中条带的目测检查，所有六个克隆都表达VEGFR-2蛋白，VAX.11-02、VAX.11-03和VAX.21-02显示最高水平，并且VAX.11-02表现出更高表达水平的趋势。

用分离自三个VXM04克隆的质粒DNA转染HEK293T细胞并对细胞提取物进行Western印迹分析后，在每个提取物中鉴定出表观分子量为约65kDa、40kDa和28kDa的三条条带。基于染色强度，当从克隆6316分离的质粒DNA被转染时，表达最高。

用分离自三个VXM08克隆的质粒DNA转染HEK293T细胞并对细胞提取物进行Western印迹分析后，所有3个克隆都表达糖基化的人CEACAM5蛋白，根据对Western印迹凝胶中条带的目测检查，克隆VXM08h_K08.1.2显示最高水平。

基于从生长特征、质粒稳定性和蛋白质表达研究获得的数据，选择VAX.11-02作为VXM01批量生产克隆用于制备原料药。

在考虑从生长特征、质粒稳定性和蛋白质表达研究获得的数据后，选择克隆VXM04_K06426作为VXM04批量生产克隆用于制备原料药。

基于从生长特征、质粒稳定性研究获得的数据，选择克隆VXM08h_K08.4.4作为VXM08批量生产克隆用于制备原料药。

实施例5：原料药的制备和放行测试

按照GMP要求制造VXM01、VXM04和VXM08原料药，各自从所选择的批量生产克隆的单个菌落开始。将每个批量生产克隆的几个细胞悬浮液稀释液涂布在含有25μg/ml卡那霉素的TSB琼脂平板上(预培养物1)。将平板在37℃下孵育20-30小时。完成培养时间后，各自选择三个单菌落并转移到三个含有TSB培养基加25μg/ml卡那霉素的50ml烧瓶中(预培养物2)。菌落在30℃下生长9小时±1小时至最大OD600<1.0。每个烧瓶的搅拌设定为120rpm。选择具有最高OD值的烧瓶用于进一步培养。将体积为50ml的预培养物2转移至含有1000mLTSB培养基加25μg/mL卡那霉素(主培养物)的烧瓶中。在30℃下孵育9小时±1小时后，在搅拌设定为180rpm下，使细菌生长至0.9至1.5之间的目标OD600。发酵完成后，将甘油加入培养物中至终浓度为15％(w/w)。将悬浮液混合，然后等分(1ml)到2ml冷冻瓶中。将小瓶标记并立即在-75℃±5℃冷冻储存。

然后进一步测试由此制备的原料药VXM01、VXM04和VXM08以建立相应的最终药品(放行标准)。药物的放行特征基于表3中列出的验收标准。

5.1生化概要

对于Ty21a和原料药VXM01、VXM04和VXM08的直接涂板，应用适当的划线方法将一环完全解冻的悬浮液转移至BTB-Gal-琼脂平板以获得单菌落。对照生物体铜绿假单胞菌(ATCC 9027)和鼠伤寒沙门氏菌(Moskau)的接种通过将(用于微生物培养的储存系统)的珠子转移到琼脂平板上并随后划线来进行。对于KIA的接种，首先将相同小瓶的环(珠子)划线到斜面的表面上，然后加入到针踵中。将培养基在37℃下孵育48小时。

所得菌落显示出预期的菌落形态。所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08在溴百里酚蓝半乳糖琼脂上在存在1.25％半乳糖时显示出菌落生长。菌落是浅蓝色透明和/或绿色至黄色，并且不会导致培养基的颜色变化。

5.2血清分型

将一滴抗血清(O5或O9)转移到室载玻片上。从KIA的下(湿)侧取出每个待测原料药的一环细胞材料并放置在抗血清旁边。将溶液与环混合。所得悬浮液应略微混浊。通过擦拭室载玻片几次来使悬浮液分散。在黑色背景下2分钟后评估反应。

所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08均符合预期的O9阳性和O5阴性血清型。

5.3限制性分析

从原料药VXM01、VXM04和VXM08中分离重组质粒，并在单独的反应中用两种不同的消化酶/组合物消化适当的时间。停止反应并在琼脂糖凝胶上分析。用于限制性分析的核酸内切酶列于表8中。

从原料药VXM01、VXM04和VXM08分离的所有三种重组质粒均显示出预期的限制性模式。

5.3质粒的序列分析

定量从原料药VXM01、VXM04和VXM08分离的重组质粒。在大肠杆菌中重新转化后，再次分离、定量和测序重组质粒。

确认了三种重组质粒与其各自标准序列的100％序列同一性。

5.4表达分析

使用商业DNA提取和纯化试剂盒从原料药VXM01、VXM04和VXM08分离重组质粒，并测定DNA含量。转染前一天，将7.5×10⁵个293T细胞接种在6孔板的每个孔中以在测定时产生90-95％的汇合。为了转染，将由分离的质粒DNA和Lipofectamine 2000^TM组成的转染复合物加入细胞中并孵育约24小时。孵育后，将细胞重新悬浮，用PBS洗涤一次并裂解。通过离心将细胞碎片沉淀。收集上清液并测定蛋白质含量。将样品储存在≤-70℃直至进行Western印迹分析。证明了重组蛋白的存在，并在半定量基础上与适当的标准材料进行了比较。

抗原VEGFR-2、MSLN和CEA的表达水平与所选的标准物质相当。

5.6活细胞数确定

制备原料药VXM01、VXM04和VXM08的细菌悬浮液低至稀释因子10^-8的连续稀释液，并将其铺板在琼脂平板上。适当孵育后，计数菌落。计数应该在菌落清晰可见但不是太大时开始。

测定的活细胞数列于表9中。

5.7质粒稳定性

制备原料药VXM01、VXM04和VXM08(用于活细胞计数测试的相同小瓶)的细菌悬浮液的连续稀释液，并铺板到含有抗生素卡那霉素的TSB平板上。适当孵育后，计数菌落。计数应该在菌落清晰可见但不是太大时开始。如下通过比较有和没有卡那霉素的TSB上的菌落形成单位来计算质粒稳定性：

PST＝(有卡那霉素的CFU/没有卡那霉素的CFU)×100

所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08均符合表3中规定的预设质粒稳定性接受标准。所有三种重组质粒的测定的质粒稳定性都为至少75％。

5.8微生物杂质

为了确定总好氧细菌、霉菌和真菌的数量，并确认不存在特定病菌大肠杆菌、沙门氏菌种、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和梭菌种，根据欧洲药典Ph.Eur.专著2.6.12和2.16.13测试原料药VXM01、VXM04和VXM08。

所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08均符合表3中规定的预设微生物杂质接受标准。在所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08中，总好氧微生物计数(TAMC)不超过10²CFU/ml，总酵母和霉菌计数(TYMC)不超过2CFU/ml并且铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、梭菌种以及其他沙门氏菌菌株在1ml细胞悬浮液中未检测到。

5.9噬菌体检测

用于检测噬菌体的测试程序采用在含有适当宿主和待测样品或噬菌体对照悬浮液的软琼脂覆盖层中的平板接种。为了提高测定的灵敏度，可以包括在先的富集步骤。在所述步骤中，将样品与合适的宿主细胞一起孵育4小时。随后，将这些富集培养物中的每一种的一个样品铺板。

所有三种原料药VXM01、VXM04和VXM08均符合表3中规定的噬菌体接受标准的预设纯度。在富集步骤后，在100μl细胞悬浮液中未检测到噬菌体。

序列表

SEQ ID NO 1：表达质粒

SEQ ID NO 2：氨基酸序列VEGFR-2

SEQ ID NO 3：氨基酸序列WT1

SEQ ID NO 4：氨基酸序列MSLN

SEQ ID NO 5：氨基酸序列CEA

SEQ ID NO 6：氨基酸序列CMV pp65

SEQ ID NO 7：氨基酸序列CMV pp65

SEQ ID NO 8：氨基酸序列CMV pp65

SEQ ID NO 9：cDNA VEGFR-2

SEQ ID NO 10：cDNA WT1

SEQ ID NO 11：cDNA MSLN

SEQ ID NO 12：cDNA CEA

SEQ ID NO 13：cDNA CMVpp65

SEQ ID NO 14：cDNA CMVpp65

SEQ ID NO 15：cDNA CMVpp65

序列表

<110> 万科斯蒙股份有限公司

<120> 生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法

<130> 112582P855PC

<150> EP16001550.9

<151> 2016-07-13

<160> 15

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 3500

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达质粒

<400> 1

tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60

atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660

taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720

cccaagctgg ctagcctcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 780

gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 840

gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 900

agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 960

gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 1020

tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 1080

cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 1140

gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 1200

caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 1260

tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 1320

tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 1380

ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 1440

gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 1500

ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 1560

ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 1620

aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 1680

aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 1740

gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 1800

gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 1860

ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 1920

ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 1980

cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2040

tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2100

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 2160

cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 2220

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 2280

accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 2340

cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 2400

cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 2460

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 2520

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 2580

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 2640

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 2700

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 2760

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 2820

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 2880

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 2940

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3000

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3060

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3120

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3180

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3240

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3300

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3360

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3420

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 3480

ctcaagaaga tcctttgatc 3500

<210> 2

<211> 1356

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

195 200 205

Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr

210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu

260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu

290 295 300

Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr

370 375 380

Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe

740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu

755 760 765

Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile

770 775 780

Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly

785 790 795 800

Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His

805 810 815

Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp

820 825 830

Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val

835 840 845

Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr

850 855 860

Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg

865 870 875 880

Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu

885 890 895

Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu

900 905 910

Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu

915 920 925

Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg

930 935 940

Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys

945 950 955 960

Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly

965 970 975

Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro

980 985 990

Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr

995 1000 1005

Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys

1010 1015 1020

Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn

1025 1030 1035 1040

Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp

1045 1050 1055

Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met

1060 1065 1070

Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val

1075 1080 1085

Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser

1090 1095 1100

Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr

1125 1130 1135

Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr

1140 1145 1150

Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala

1155 1160 1165

Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu

1170 1175 1180

Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser

1185 1190 1195 1200

Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn

1205 1210 1215

Thr Ala Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg

1220 1225 1230

Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu

1235 1240 1245

Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu

1250 1255 1260

Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu Ser Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser

1285 1290 1295

Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp

1300 1305 1310

Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu Ala Glu Leu Leu Lys

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<213> 智人（Homo sapiens）

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

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275 280 285

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

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Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

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Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

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<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

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545 550 555 560

Gly

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<212> PRT

<213> 巨细胞病毒（Cytomegalovirus）

<400> 8

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Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr

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Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Gly Ile His Val

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165 170 175

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180 185 190

Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met

195 200 205

Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val

210 215 220

Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu

225 230 235 240

Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met

245 250 255

Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe

260 265 270

Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser

275 280 285

His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu

290 295 300

Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu

305 310 315 320

Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr

325 330 335

Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp

340 345 350

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355 360 365

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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485 490 495

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<211> 4071

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 人VEGFR-2

<400> 9

atgcagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60

tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120

cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180

tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240

gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300

tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360

tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420

aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480

ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540

agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600

gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 660

tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 720

aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 780

gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 840

tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 900

gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 960

tttgtcaggg tccatgaaaa accttttgtt gcttttggaa gtggcatgga atctctggtg 1020

gaagccacgg tgggggagcg tgtcagaatc cctgcgaagt accttggtta cccaccccca 1080

gaaataaaat ggtataaaaa tggaataccc cttgagtcca atcacacaat taaagcgggg 1140

catgtactga cgattatgga agtgagtgaa agagacacag gaaattacac tgtcatcctt 1200

accaatccca tttcaaagga gaagcagagc catgtggtct ctctggttgt gtatgtccca 1260

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caaacgctga catgtacggt ctatgccatt cctcccccgc atcacatcca ctggtattgg 1380

cagttggagg aagagtgcgc caacgagccc agccaagctg tctcagtgac aaacccatac 1440

ccttgtgaag aatggagaag tgtggaggac ttccagggag gaaataaaat tgaagttaat 1500

aaaaatcaat ttgctctaat tgaaggaaaa aacaaaactg taagtaccct tgttatccaa 1560

gcggcaaatg tgtcagcttt gtacaaatgt gaagcggtca acaaagtcgg gagaggagag 1620

agggtgatct ccttccacgt gaccaggggt cctgaaatta ctttgcaacc tgacatgcag 1680

cccactgagc aggagagcgt gtctttgtgg tgcactgcag acagatctac gtttgagaac 1740

ctcacatggt acaagcttgg cccacagcct ctgccaatcc atgtgggaga gttgcccaca 1800

cctgtttgca agaacttgga tactctttgg aaattgaatg ccaccatgtt ctctaatagc 1860

acaaatgaca ttttgatcat ggagcttaag aatgcatcct tgcaggacca aggagactat 1920

gtctgccttg ctcaagacag gaagaccaag aaaagacatt gcgtggtcag gcagctcaca 1980

gtcctagagc gtgtggcacc cacgatcaca ggaaacctgg agaatcagac gacaagtatt 2040

ggggaaagca tcgaagtctc atgcacggca tctgggaatc cccctccaca gatcatgtgg 2100

tttaaagata atgagaccct tgtagaagac tcaggcattg tattgaagga tgggaaccgg 2160

aacctcacta tccgcagagt gaggaaggag gacgaaggcc tctacacctg ccaggcatgc 2220

agtgttcttg gctgtgcaaa agtggaggca tttttcataa tagaaggtgc ccaggaaaag 2280

acgaacttgg aaatcattat tctagtaggc acggcggtga ttgccatgtt cttctggcta 2340

cttcttgtca tcatcctacg gaccgttaag cgggccaatg gaggggaact gaagacaggc 2400

tacttgtcca tcgtcatgga tccagatgaa ctcccattgg atgaacattg tgaacgactg 2460

ccttatgatg ccagcaaatg ggaattcccc agagaccggc tgaagctagg taagcctctt 2520

ggccgtggtg cctttggcca agtgattgaa gcagatgcct ttggaattga caagacagca 2580

acttgcagga cagtagcagt caaaatgttg aaagaaggag caacacacag tgagcatcga 2640

gctctcatgt ctgaactcaa gatcctcatt catattggtc accatctcaa tgtggtcaac 2700

cttctaggtg cctgtaccaa gccaggaggg ccactcatgg tgattgtgga attctgcaaa 2760

tttggaaacc tgtccactta cctgaggagc aagagaaatg aatttgtccc ctacaagacc 2820

aaaggggcac gattccgtca agggaaagac tacgttggag caatccctgt ggatctgaaa 2880

cggcgcttgg acagcatcac cagtagccag agctcagcca gctctggatt tgtggaggag 2940

aagtccctca gtgatgtaga agaagaggaa gctcctgaag atctgtataa ggacttcctg 3000

accttggagc atctcatctg ttacagcttc caagtggcta agggcatgga gttcttggca 3060

tcgcgaaagt gtatccacag ggacctggcg gcacgaaata tcctcttatc ggagaagaac 3120

gtggttaaaa tctgtgactt tggcttggcc cgggatattt ataaagatcc agattatgtc 3180

agaaaaggag atgctcgcct ccctttgaaa tggatggccc cagaaacaat ttttgacaga 3240

gtgtacacaa tccagagtga cgtctggtct tttggtgttt tgctgtggga aatattttcc 3300

ttaggtgctt ctccatatcc tggggtaaag attgatgaag aattttgtag gcgattgaaa 3360

gaaggaacta gaatgagggc ccctgattat actacaccag aaatgtacca gaccatgctg 3420

gactgctggc acggggagcc cagtcagaga cccacgtttt cagagttggt ggaacatttg 3480

ggaaatctct tgcaagctaa tgctcagcag gatggcaaag actacattgt tcttccgata 3540

tcagagactt tgagcatgga agaggattct ggactctctc tgcctacctc acctgtttcc 3600

tgtatggagg aggaggaagt atgtgacccc aaattccatt atgacaacac agcaggaatc 3660

agtcagtatc tgcagaacag taagcgaaag agccggcctg tgagtgtaaa aacatttgaa 3720

gatatcccgt tagaagaacc agaagtaaaa gtaatcccag atgacaacca gacggacagt 3780

ggtatggttc ttgcctcaga agagctgaaa actttggaag acagaaccaa attatctcca 3840

tcttttggtg gaatggtgcc cagcaaaagc agggagtctg tggcatctga aggctcaaac 3900

cagacaagcg gctaccagtc cggatatcac tccgatgaca cagacaccac cgtgtactcc 3960

agtgaggaag cagaactttt aaagctgata gagattggag tgcaaaccgg tagcacagcc 4020

cagattctcc agcctgactc ggggaccaca ctgagctctc ctcctgttta a 4071

<210> 10

<211> 1116

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 人截短的WT1

<400> 10

atggacttcc tcttgctgca ggacccggct tccacgtgtg tcccggagcc ggcgtctcag 60

cacacgctcc gctccgggcc tgggtgccta cagcagccag agcagcaggg agtccgggac 120

ccgggcggca tctgggccaa gttaggcgcc gccgaggcca gcgctgaacg tctccagggc 180

cggaggagcc gcggggcgtc cgggtctgag ccgcagcaaa tgggctccga cgtgcgggac 240

ctgaacgcgc tgctgcccgc cgtcccctcc ctgggtggcg gcggcggctg tgccctgcct 300

gtgagcggcg cggcgcagtg ggcgccggtg ctggactttg cgcccccggg cgcttcggct 360

tacgggtcgt tgggcggccc cgcgccgcca ccggctccgc cgccaccccc gccgccgccg 420

cctcactcct tcatcaaaca ggagccgagc tggggcggcg cggagccgca cgaggagcag 480

tgcctgagcg ccttcactgt ccacttttcc ggccagttca ctggcacagc cggagcctgt 540

cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt catccggcca ggccaggatg 600

tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctggagagcc agcccgctat tcgcaatcag 660

ggttacagca cggtcacctt cgacgggacg cccagctacg gtcacacgcc ctcgcaccat 720

gcggcgcagt tccccaacca ctcattcaag catgaggatc ccatgggcca gcagggctcg 780

ctgggtgagc agcagtactc ggtgccgccc ccggtctatg gctgccacac ccccaccgac 840

agctgcaccg gcagccaggc tttgctgctg aggacgccct acagcagtga caatttatac 900

caaatgacat cccagcttga atgcatgacc tggaatcaga tgaacttagg agccacctta 960

aagggagttg ctgctgggag ctccagctca gtgaaatgga cagaagggca gagcaaccac 1020

agcacagggt acgagagcga taaccacaca acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga 1080

atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt cagtga 1116

<210> 11

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 人MSLN

<400> 11

atggccttgc caacggctcg acccctgttg gggtcctgtg ggacccccgc cctcggcagc 60

ctcctgttcc tgctcttcag cctcggatgg gtgcagccct ccaggaccct ggctggagag 120

acagggcagg aggctgcgcc cctggacgga gtcctggcca acccacctaa catttccagc 180

ctctcccctc gccaactcct tggcttcccg tgtgcggagg tgtccggcct gagcacggag 240

cgtgtccggg agctggctgt ggccttggca cagaagaatg tcaagctctc aacagagcag 300

ctgcgctgtc tggctcaccg gctctctgag ccccccgagg acctggacgc cctcccattg 360

gacctgctgc tattcctcaa cccagatgcg ttctcggggc cccaggcctg cacccgtttc 420

ttctcccgca tcacgaaggc caatgtggac ctgctcccga ggggggctcc cgagcgacag 480

cggctgctgc ctgcggctct ggcctgctgg ggtgtgcggg ggtctctgct gagcgaggct 540

gatgtgcggg ctctgggagg cctggcttgc gacctgcctg ggcgctttgt ggccgagtcg 600

gccgaagtgc tgctaccccg gctggtgagc tgcccgggac ccctggacca ggaccaacag 660

gaggcagcca gggcggctct gcagggcggg ggacccccct acggcccccc gtcgacatgg 720

tctgtctcca cgatggacgc tctgcggggc ctgctgcccg tgctgggcca gcccatcatc 780

cgcagcatcc cgcagggcat cgtggccgcg tggcggcaac gctcctctcg ggacccatcc 840

tggcggcagc ctgaacggac catcctccgg ccgcggttcc ggcgggaagt ggagaagaca 900

gcctgtcctt caggcaagaa ggcccgcgag atagacgaga gcctcatctt ctacaagaag 960

tgggagctgg aagcctgcgt ggatgcggcc ctgctggcca cccagatgga ccgcgtgaac 1020

gccatcccct tcacctacga gcagctggac gtcctaaagc ataaactgga tgagctctac 1080

ccacaaggtt accccgagtc tgtgatccag cacctgggct acctcttcct caagatgagc 1140

cctgaggaca ttcgcaagtg gaatgtgacg tccctggaga ccctgaaggc tttgcttgaa 1200

gtcaacaaag ggcacgaaat gagtcctcag gctcctcggc ggcccctccc acaggtggcc 1260

accctgatcg accgctttgt gaagggaagg ggccagctag acaaagacac cctagacacc 1320

ctgaccgcct tctaccctgg gtacctgtgc tccctcagcc ccgaggagct gagctccgtg 1380

ccccccagca gcatctgggc ggtcaggccc caggacctgg acacgtgtga cccaaggcag 1440

ctggacgtcc tctatcccaa ggcccgcctt gctttccaga acatgaacgg gtccgaatac 1500

ttcgtgaaga tccagtcctt cctgggtggg gcccccacgg aggatttgaa ggcgctcagt 1560

cagcagaatg tgagcatgga cttggccacg ttcatgaagc tgcggacgga tgcggtgctg 1620

ccgttgactg tggctgaggt gcagaaactt ctgggacccc acgtggaggg cctgaaggcg 1680

gaggagcggc accgcccggt gcgggactgg atcctacggc agcggcagga cgacctggac 1740

acgctggggc tggggctaca gggcggcatc cccaacggct acctggtcct agacctcagc 1800

atgcaagagg ccctctcggg gacgccctgc ctcctaggac ctggacctgt tctcaccgtc 1860

ctggcactgc tcctagcctc caccctggcc tga 1893

<210> 12

<211> 2109

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 人CEA

<400> 12

atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60

acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tattgaatcc 120

acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag 180

catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata 240

ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggcccg catacagtgg tcgagagata 300

atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac 360

accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta 420

tacccggagc tgcccaagcc ctccatctcc agcaacaact ccaaacccgt ggaggacaag 480

gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540

aacaatcaga gcctcccggt cagtcccagg ctgcagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600

actctattca atgtcacaag aaatgacaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca 660

gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggccc ggatgccccc 720

accatttccc ctctaaacac atcttacaga tcaggggaaa atctgaacct ctcctgccac 780

gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840

acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900

gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgca 960

gagccaccca aacccttcat caccagcaac aactccaacc ccgtggagga tgaggatgct 1020

gtagccttaa cctgtgaacc tgagattcag aacacaacct acctgtggtg ggtaaataat 1080

cagagcctcc cggtcagtcc caggctgcag ctgtccaatg acaacaggac cctcactcta 1140

ctcagtgtca caaggaatga tgtaggaccc tatgagtgtg gaatccagaa caaattaagt 1200

gttgaccaca gcgacccagt catcctgaat gtcctctatg gcccagacga ccccaccatt 1260

tccccctcat acacctatta ccgtccaggg gtgaacctca gcctctcctg ccatgcagcc 1320

tctaacccac ctgcacagta ttcttggctg attgatggga acatccagca acacacacaa 1380

gagctcttta tctccaacat cactgagaag aacagcggac tctatacctg ccaggccaat 1440

aactcagcca gtggccacag caggactaca gtcaagacaa tcacagtctc tgcggagctg 1500

cccaagccct ccatctccag caacaactcc aaacccgtgg aggacaagga tgctgtggcc 1560

ttcacctgtg aacctgaggc tcagaacaca acctacctgt ggtgggtaaa tggtcagagc 1620

ctcccagtca gtcccaggct gcagctgtcc aatggcaaca ggaccctcac tctattcaat 1680

gtcacaagaa atgacgcaag agcctatgta tgtggaatcc agaactcagt gagtgcaaac 1740

cgcagtgacc cagtcaccct ggatgtcctc tatgggccgg acacccccat catttccccc 1800

ccagactcgt cttacctttc gggagcgaac ctcaacctct cctgccactc ggcctctaac 1860

ccatccccgc agtattcttg gcgtatcaat gggataccgc agcaacacac acaagttctc 1920

tttatcgcca aaatcacgcc aaataataac gggacctatg cctgttttgt ctctaacttg 1980

gctactggcc gcaataattc catagtcaag agcatcacag tctctgcatc tggaacttct 2040

cctggtctct cagctggggc cactgtcggc atcatgattg gagtgctggt tggggttgct 2100

ctgatatag 2109

<210> 13

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA CMV pp65

<400> 13

atggaatcca gggggaggag gtgtccggag atgatctcag tcctcggacc gattagcggt 60

cacgtgctca aagcggtctt cagcagagga gacactccgg tgctgccgca cgaaacaagg 120

ctccttcaga cggggataca cgtgcgtgtg agtcagccca gcctgatcct cgtgtctcaa 180

tacacccctg acagcactcc ctgtcacaga ggggacaacc aactccaggt ccagcacacc 240

tacttcactg ggagcgaggt cgagaacgtc agcgtgaacg tgcacaaccc cacgggaaga 300

tcaatctgcc ctagccagga gcccatgagc atctacgtgt acgccctccc gctcaagatg 360

ctcaacatcc cctccatcaa cgtccaccac tatccctccg ctgccgaacg taaacaccga 420

cacttgccag ttgcggacgc cgtgatacac gcttcaggga agcagatgtg gcaagccagg 480

cttactgtga gtggactcgc ctggactagg caacagaacc agtggaagga gcccgacgtg 540

tactacacca gcgccttcgt gttccccaca aaagacgtcg cgctgcgaca tgtggtgtgc 600

gctcacgaac tggtgtgcag catggagaac acgcgagcga ccaagatgca ggtgatcggt 660

gaccagtacg tcaaggtgta cctggagagc ttctgcgagg atgtcccgtc cggaaagctg 720

ttcatgcacg tgaccctggg cagtgacgtt gaggaagacc tgaccatgac gcgtaacccg 780

cagcctttca tgagaccgca cgagaggaac ggattcaccg tcctgtgccc gaagaacatg 840

atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctcgacg tcgccttcac ctctcacgaa 900

cacttcgggc tgctgtgtcc gaagagcatt ccgggtctga gcatctcagg caacctgctg 960

atgaacgggc agcagatctt cctggaagtg caggccataa gggagaccgt ggaactgagg 1020

cagtacgatc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctcttgct gcaaaggggt 1080

ccacagtata gcgaacaccc caccttcacc tcccagtacc gtatccaggg caagctggag 1140

taccgacaca cttgggatag gcacgacgag ggtgccgctc aaggtgacga cgatgtttgg 1200

actagcggct ctgatagcga cgaagagctg gtgaccactg agcgcaaaac tccaagagtt 1260

acgggcggcg gcgcaatggc tggcgcctct acttccgcgg gaaggaaaag gaaaagcgcg 1320

tctagcgcaa ctgcatgcac tgccggtgtg atgacaaggg ggagactgaa ggccgagagt 1380

acagtggctc cggaagagga taccgacgag gactctgaca acgagatcca caaccccgca 1440

gtgtttacgt ggccaccttg gcaagccggc atccttgcta gaaacctggt gcccatggtg 1500

gccacagtcc aaggccagaa cctgaagtac caggagttct tctgggacgc caacgacatc 1560

taccgtatct tcgccgaact tgaaggcgtc tggcagccgg cggctcaacc caaaaggaga 1620

cgtcacagac aggacgcgct tcccggaccc tgtattgcct ctacccccaa gaaacaccgg 1680

ggc 1683

<210> 14

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 突变的 CMV pp65

<400> 14

atggaatcca gggggaggag gtgtccggag atgatctcag tcctcggacc gattagcggt 60

cacgtgctca aagcggtctt cagcagagga gacactccgg tgctgccgca cgaaacaagg 120

ctccttcaga cggggataca cgtgcgtgtg agtcagccca gcctgatcct cgtgtctcaa 180

tacacccctg acagcactcc ctgtcacaga ggggacaacc aactccaggt ccagcacacc 240

tacttcactg ggagcgaggt cgagaacgtc agcgtgaacg tgcacaaccc cacgggaaga 300

tcaatctgcc ctagccagga gcccatgagc atctacgtgt acgccctccc gctcaagatg 360

ctcaacatcc cctccatcaa cgtccaccac tatccctccg ctgccgaacg taaacaccga 420

cacttgccag ttgcggacgc cgtgatacac gcttcaggga agcagatgtg gcaagccagg 480

cttactgtga gtggactcgc ctggactagg caacagaacc agtggaagga gcccgacgtg 540

tactacacca gcgccttcgt gttccccaca aaagacgtcg cgctgcgaca tgtggtgtgc 600

gctcacgaac tggtgtgcag catggagaac acgcgagcga ccaagatgca ggtgatcggt 660

gaccagtacg tcaaggtgta cctggagagc ttctgcgagg atgtcccgtc cggaaagctg 720

ttcatgcacg tgaccctggg cagtgacgtt gaggaagacc tgaccatgac gcgtaacccg 780

cagcctttca tgagaccgca cgagaggaac ggattcaccg tcctgtgccc gaagaacatg 840

atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctcgacg tcgccttcac ctctcacgaa 900

cacttcgggc tgctgtgtcc gaagagcatt ccgggtctga gcatctcagg caacctgctg 960

atgaacgggc agcagatctt cctggaagtg caggccataa gggagaccgt ggaactgagg 1020

cagtacgatc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctcttgct gcaaaggggt 1080

ccacagtata gcgaacaccc caccttcacc tcccagtacc gtatccaggg caagctggag 1140

taccgacaca cttgggatag gcacgacgag ggtgccgctc aaggtgacga cgatgtttgg 1200

actagcggct ctgatagcga cgaagagctg gtgaccactg agcgcaaaac tccaagagtt 1260

acgggcggcg gcgcaatggc tggcgcctct acttccgcgg gaaggaacag gaaaagcgcg 1320

tctagcgcaa ctgcatgcac tgccggtgtg atgacaaggg ggagactgaa ggccgagagt 1380

acagtggctc cggaagagga taccgacgag gactctgaca acgagatcca caaccccgca 1440

gtgtttacgt ggccaccttg gcaagccggc atccttgcta gaaacctggt gcccatggtg 1500

gccacagtcc aaggccagaa cctgaagtac caggagttct tctgggacgc caacgacatc 1560

taccgtatct tcgccgaact tgaaggcgtc tggcagccgg cggctcaacc caaaaggaga 1620

cgtcacagac aggacgcgct tcccggaccc tgtattgcct ctacccccaa gaaacaccgg 1680

ggc 1683

<210> 15

<211> 1608

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cDNA 截短的突变的 CMV pp65

<400> 15

atggaatcca gggggaggag gtgtccggag atgatctcag tcctcggacc gattagcggt 60

cacgtgctca aagcggtctt cagcagagga gacactccgg tgctgccgca cgaaacaagg 120

ctccttcaga cggggataca cgtgcgtgtg agtcagccca gcctgatcct cgtgtctcaa 180

tacacccctg acagcactcc ctgtcacaga ggggacaacc aactccaggt ccagcacacc 240

tacttcactg ggagcgaggt cgagaacgtc agcgtgaacg tgcacaaccc cacgggaaga 300

tcaatctgcc ctagccagga gcccatgagc atctacgtgt acgccctccc gctcaagatg 360

ctcaacatcc cctccatcaa cgtccaccac tatccctccg ctgccgaacg taaacaccga 420

cacttgccag ttgcggacgc cgtgatacac gcttcaggga agcagatgtg gcaagccagg 480

cttactgtga gtggactcgc ctggactagg caacagaacc agtggaagga gcccgacgtg 540

tactacacca gcgccttcgt gttccccaca aaagacgtcg cgctgcgaca tgtggtgtgc 600

gctcacgaac tggtgtgcag catggagaac acgcgagcga ccaagatgca ggtgatcggt 660

gaccagtacg tcaaggtgta cctggagagc ttctgcgagg atgtcccgtc cggaaagctg 720

ttcatgcacg tgaccctggg cagtgacgtt gaggaagacc tgaccatgac gcgtaacccg 780

cagcctttca tgagaccgca cgagaggaac ggattcaccg tcctgtgccc gaagaacatg 840

atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctcgacg tcgccttcac ctctcacgaa 900

cacttcgggc tgctgtgtcc gaagagcatt ccgggtctga gcatctcagg caacctgctg 960

atgaacgggc agcagatctt cctggaagtg caggccataa gggagaccgt ggaactgagg 1020

cagtacgatc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctcttgct gcaaaggggt 1080

ccacagtata gcgaacaccc caccttcacc tcccagtacc gtatccaggg caagctggag 1140

taccgacaca cttgggatag gcacgacgag ggtgccgctc aaggtgacga cgatgtttgg 1200

actagcggct ctgatagcga cgaagagctg gtgaccactg agcgcaaaac tccaagagtt 1260

acgggcggcg gcgcaatggc tggcgcctct acttccgcgg gaaggaacag gaaaagcgcg 1320

tctagcgcaa ctgcatgcac tgccggtgtg atgacaaggg ggagactgaa ggccgagagt 1380

acagtggctc cggaagagga taccgacgag gactctgaca acgagatcca caaccccgca 1440

gtgtttacgt ggccaccttg gcaagccggc atccttgcta gaaacctggt gcccatggtg 1500

gccacagtcc aaggccagaa cctgaagtac caggagttct tctgggacgc caacgacatc 1560

taccgtatct tcgccgaact tgaaggcgtc tggcagccgg cggctcaa 1608

Claims

1.用于生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法，其至少包括以下步骤：

a)用至少一种DNA分子转化沙门氏菌减毒菌株，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；

b)表征步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆；

c)选择步骤(b)中表征的转化后的细胞克隆中的至少一个，并进一步表征所述至少一个所选择的转化后的细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述沙门氏菌减毒菌株是肠道沙门氏菌物种，具体地，是伤寒沙门氏菌，更具体地，是伤寒沙门氏菌Ty21a。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一个表达盒是真核表达盒。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗原选自由肿瘤抗原和肿瘤基质抗原组成的组，具体地，选自由人肿瘤抗原和人肿瘤基质抗原组成的组，更具体地，选自由人野生型肿瘤抗原、与人野生型肿瘤抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质、人野生型肿瘤基质抗原和与人野生型肿瘤基质抗原具有至少80％序列同一性的蛋白质组成的组。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一种DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMB1ori和在CMV启动子控制下的编码所述抗原的真核表达盒，具体地，其中所述DNA分子是DNA质粒，更具体地，其中所述DNA质粒包含如SEQ ID NO 1中所示的核酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤(a)中所述沙门氏菌减毒菌株通过电穿孔被所述至少一种DNA分子转化，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(b)包含以下子步骤的至少一个：

bi)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆随时间的细胞生长；

bii)评估步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；

biii)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征所述至少一种分离的DNA分子；

biv)从步骤(a)中获得的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中所述至少一种抗原或其至少一种片段的表达。

8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(b)包括所述子步骤(bi)、(bii)、(biii)和(biv)中的一个、两个、三个或所有四个。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(c)包含以下子步骤的至少一个：

ci)评估每ml步骤(c)中选择的至少一种转化后的细胞克隆的细胞悬浮液的活细胞数；

cii)评估步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中的至少一种DNA分子的稳定性，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒；

ciii)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，并通过限制性分析和/或测序表征该至少一种分离的DNA分子；

civ)从步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中分离至少一种DNA分子，所述至少一种DNA分子包含编码至少一种抗原或其至少一种片段的至少一个表达盒，将所述至少一种分离的DNA分子转染到至少一个真核细胞中并评估所述至少一个真核细胞中至少一种抗原或其至少一种片段的表达；

cv)测试步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆中细菌、真菌和/或病毒污染物的存在；

cvi)验证步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆的细菌菌株同一性。

10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(c)包括所述子步骤(ci)、(cii)、(ciii)、(civ)、(cv)和(cvi)中的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中在步骤(cv)中，通过在至少一种合适的选择性培养基中或其上培养步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆来测试细菌和/或真菌污染物的存在。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中在步骤(cvi)中，通过在溴百里酚蓝半乳糖琼脂上和/或在克氏铁琼脂上培养步骤(c)中选择的至少一个转化后的细胞克隆和/或通过评估沙门氏菌O5和/或O9表面抗原的存在来验证细菌菌株同一性。

13.根据权利要求1至12中任一项的所述方法可获得的DNA疫苗。

14.根据权利要求13所述的DNA疫苗用于癌症免疫疗法。

15.根据权利要求13所述的DNA疫苗，其中所述癌症免疫疗法包括个体化癌症免疫疗法。