CN109444319B - 一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，涉及北芪菇中活性物质提取和含量测定领域，以北芪菇为原料，以乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化，采用光谱扫描确定的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据标准品吸收峰峰面积积分值与量的线性关系，用外标两点法测定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量，双波长薄层扫描法使目标物质充分溶解于提取剂中，扫描法可基本消除铺板不均产生的误差，扫描基线稳定，不造成目标物质的损失，且操作简单、用时短，具有提取效率高，可定性分析准确性高。

Description

一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法

技术领域

本发明涉及北芪菇中活性物质的提取与含量测定领域，具体为一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法。

背景技术

北芪菇，担子菌门下伞菌目侧耳属平菇，将正北芪、多种中草药、农作物副产品作培养料，采用科学的配方和特殊的工艺多年培育而成的新型侧耳属平菇，是山西浑源富硒地区开发的新型食用菌。根据生物富集作用，北芪菇内含浑源黄芪的药理成分，在生长发育过程中对黄芪苷有一定程度的富集。北芪菇中含有多种人体必需的氨基酸、多糖蛋白、抗生素、牛黄酸、菌糖、多种酶、维生素以及硒元素，是全能营养型的食用菌，其营养成份远超于普通平菇，含有较高的食用价值和药用价值。北芪菇具有较强的生物转化作用，其重要的代谢产物，如蛋白多糖、抗生素、微量牛黄酸有抗肿瘤、抗菌消炎、降低血压和防治脑血管障碍等作用，菌多糖和甘露糖有益于调理胃肠作用，以及含有帮助消化的各种酶等。在补气固表、润肤、脱毒排脓、有强身健体、保护肝脏等有较为显著的作用，尤其是在治愈银霄病和其它瘙痒性皮肤病有特殊的功效。另外，北芪菇是一种能产生新型氨基酸的微生物，其丰富的赖氨酸（1.19g/100g）和硒（0.54ppm/100g）可能与吡咯赖氨酸和L-硒代半胱氨酸或L-硒-甲基硒代半胱氨酸的生物合成存在着密切的关系，有望在抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等方面进行开发。

近年我国对不同植物中的黄芪苷进行了各方面的研究，相继报道了黄芪苷有免疫调节、抗炎，降压，镇静镇痛，保肝护心，清除多种自由基等多方面的药理作用。关于黄芪中黄芪苷的提取及含量测定早有报道，但对产于山西浑源县北芪菇中黄芪苷的含量少有报道，如今北芪菇中黄芪苷的研究备受人们重视，有关黄芪苷的研究变成了科学界的热点。随着社会经济和科学技术的发展，黄芪苷的开发研究和应用范围会更广，开发前景会更好，从而促进医疗事业的发展。

北芪菇中的黄芪苷以黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪甲苷为主。黄芪皂苷在抗氧化、调节免疫功能、保肝、抗病毒和对心脑血管等多方面具有显著作用。有关黄芪皂苷的鉴别通常采用相继报道了水浸提法，碱水提取法，回流法、CO₂超临界流体萃取法等多种方法。黄芪皂苷的含量测定曾尝试采用高效液相一紫外检测器检测，但由于黄芪皂苷在紫外区仅有微弱的吸收，溶剂噪音对结果有较大影响，灵敏度低，测定误差大。

黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，生物活性高，是黄芪的主要药理成份，是黄芪及含黄芪制剂的重要鉴定指标。黄芪甲苷对人体拥有非常高的药理作用，其在器官保护（尤其是肝脏、肺、心肌、肾脏、脑等器官）、免疫调节、抗细胞凋亡、抗炎抗病毒、抗糖尿病、清除自由基、抗衰老等方面具有广泛的药理作用。黄芪甲苷的常见提取方法主要有水浸提法，碱水提取法，醇提法、煎煮法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、索式提取法、超临界CO₂萃取法及加速溶剂萃取法，黄芪甲苷含量测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、荧光、紫外分光光度法等。但是上述方法操作步骤繁琐，测定时间长，例如索氏回流提取需要碱洗及大孔树脂富集过程，洗脱富集复杂，不易操作，同时含量测定过程中由于黄芪甲苷仅在近紫外区（200nm左右）有微弱吸收，属于末端吸收，因为波长越长，噪音就越大，灵敏度也随之降低。

在大多数化学实验室，薄层色谱（TLC）是一种常用、可靠的方法，但传统的可见技术不提供薄层色谱斑点的结构信息。质谱法是一种鉴定这些斑点的强大技术，然而传统的从薄层板上手动刮点、萃取、重组，进而在质谱上注射分析获取质谱图的过程耗时耗力。

因此需要一种能解决测定过程操作繁琐、测定结果不可靠的问题的含量测定方法。

发明内容

为解决北芪菇中黄芪苷的提取和黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ与黄芪甲苷含量测定的操作繁琐、测定结果不可靠的问题，本发明提供了一种易于操作、试验耗时短且提取效率高的北芪菇中黄芪苷含量测定的方法。

本发明是通过如下技术方案来实现的：一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，具体过程为：以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

进一步地，具体过程为：

步骤a，以北芪菇粉为原料，分别加入70%乙醇，料液比为1:25，50℃下振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出时用甲醇将其定容备用；

步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ标准品加于色谱纯的甲醇中，超声条件下充分溶解后制得1mg/mL的标准品溶液，置于2～4℃的冰箱中保存备用；

步骤c，将层析板加热活化，用微量进样器分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及标准品溶液25μL，依次点样供试液3-4μL，标准品溶液2μL、3μL、6μL，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开前沿距层析板顶端1cm处时，取出层析板晾干，均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加热至显色清晰为止，用玻璃板覆盖，四周胶布固定，紫外365nm下检视，薄层色谱成像系统拍照，并标记；

步骤d，将层析板放入薄层色谱扫描仪中，确定背景及各个黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ斑点的横、纵坐标，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

与现有技术相比较本发明的有益效果在于：微波联合超声波提取比单一的超声波、微波提取效率更高。该方法不仅能使细胞内的目标物质充分溶解于提取剂中，不造成目标物质的损失，而且操作简单、用时短，大大的提高了提取效率，广泛的适用于各种物质的提取。

薄层色谱相对于纸色谱法、高效液相色谱、高效气相色谱和高速逆流色谱法，展开速率快，一般仅需15～20分钟，混合物易分离，分辨力比纸层析高10～100倍，保持了操作方便、设备简单、显色容易等优点。同时既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。

双波长扫描完全消除由于薄层厚度局部不均所引起的基线波动。锯齿形扫描消除了由被展开斑点不规则形状所引起的测量误差。工作曲线线性化保证了工作曲线呈一直线，提高了分析准确度。背景校正功能消除薄板背景污染的影响，可将背景作为基线储存起来，以得到校正过的吸收光谱。狭缝调节保证有适于电泳凝胶扫描的高位差分辨率。双波长扫描可检测各种峰参数，保证有极高的峰检测能力。基线可记录在斑点轮廓图上。具定量计算功能，可直接打印出浓度。自动变换扫描通道可以快速地连续不断地测量试样，参数用备用电池保险，操作十分简易，光源切换反射镜系统，可简便地快捷地从吸收测量转换到荧光测量。检测灵敏度高。每一样品可在几分钟或十几分钟内扫描完毕，测定速度快。应用范围广。可用紫外光、可见光及荧光检测，误差仅在±2%~5%左右。可分辨相距20xm的斑点，分辨率高。

本发明还可对供试品的进行定性分析，将供试品斑点与黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品斑点对比，确定供试品斑点确为黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，确定斑点时间小于1分钟，避免前处理中出现错误而导致黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量测定的失败，简化质谱获取过程，节省步骤，提高准确性，从而进一步确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量。TLC/MS，结合Advion expression的紧凑型质谱仪(CMS)被称作TLC/CMS。样品可以不经过前处理快速在复杂混合物中鉴定出产品，连接CAMAGTLC-MS接口与Advion expression CMS使TLC板分析更加灵敏，简单和明确的鉴定和定量其化合物。

附图说明

图1为本发明的含量测定的流程图。

图2为本发明的北芪菇供试品与标准品TLC成像图，图中1为黄芪皂苷Ⅰ标准品，2为黄芪皂苷Ⅱ标准品，3为黄芪皂苷Ⅲ标准品，4为黄芪甲苷标准品。

图3为本发明的正北芪供试品与标准品TLC成像图，图中5为黄芪皂苷Ⅰ标准品，6为黄芪皂苷Ⅱ标准品，7为黄芪皂苷Ⅲ标准品，8为黄芪甲苷标准品。

图4为黄芪甲苷测定中黄芪甲苷标准品TLC光谱扫描图。

图5为黄芪甲苷测定中北芪菇供试品TLC光谱扫描图。

图6为黄芪甲苷测定中正北芪供试品TLC光谱扫描图。

图7为黄芪甲苷标准曲线。

图8为黄芪皂苷Ⅰ测定中黄芪皂苷Ⅰ标准品TLC光谱扫描图。

图9为黄芪皂苷Ⅰ测定中北芪菇供试品TLC光谱扫描图。

图10为黄芪皂苷Ⅰ测定中正北芪供试品TLC光谱扫描图。

图11为黄芪皂苷Ⅰ标准曲线。

图12为黄芪皂苷Ⅱ、测定中黄芪皂苷Ⅰ标准品TLC光谱扫描图。

图13为黄芪皂苷Ⅱ测定中北芪菇供试品TLC光谱扫描图。

图14为黄芪皂苷Ⅱ测定中正北芪供试品TLC光谱扫描图。

图15为黄芪皂苷Ⅱ标准曲线。

图16为黄芪皂苷Ⅲ测定中黄芪皂苷Ⅰ标准品TLC光谱扫描图。

图17为黄芪皂苷Ⅲ测定中北芪菇供试品TLC光谱扫描图。

图18为黄芪皂苷Ⅲ测定中正北芪供试品TLC光谱扫描图。

图19为黄芪皂苷Ⅲ标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

本发明以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

请参阅图1所示，具体过程为：

步骤a，以北芪菇粉为原料，分别加入70%乙醇，料液比为1:25，50℃下振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出时用甲醇将其定容备用；

步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ标准品加于色谱纯的甲醇中，超声条件下充分溶解后制得1mg/mL的标准品溶液，置于2～4℃的冰箱中保存备用；

步骤c，将层析板加热活化，用微量进样器分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及标准品溶液25μL，依次点样供试液3-4μL，标准品溶液2μL、3μL、6μL，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开前沿距层析板顶端1cm处时，取出层析板晾干，均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加热至显色清晰为止，用玻璃板覆盖，四周胶布固定，紫外365nm下检视，薄层色谱成像系统拍照，并标记；

步骤d，将层析板放入薄层色谱扫描仪中，确定背景及各个黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ斑点的横、纵坐标，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

下面通过实施例进行说明。

实施例1

步骤a，黄芪苷的粗提取：

将北芪菇于通风处阴干至材料发脆，恒温箱内(40～50℃)烘干，用高速多功能粉碎机粉碎，过80目筛筛选，装入玻璃器皿中保存，准确称取3份，每份10g于500mL的锥形瓶中分别加入250mL的70%乙醇，50℃下气浴恒温振荡器中振荡浸提24h形成浸提液。

超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，根据表1选取最佳微波超声波条件，在超声波恒定的条件下萃取，设置温度为45℃、50℃、55℃，最终测得超声波功率为800、900、1000W，微波功率为250、300、350W为佳，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，反复提取3次，合并上清液过滤、浓缩至体积的1/10；

表1 微波及超声波参数

用2倍体积的石油醚萃取水提取液2h，弃去石油醚相，保留水相，去杂后，待水相挥发至无石油醚味后，用等体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并上层溶液（正丁醇相），添加适量的纯水使其形成共沸物后于旋转蒸发仪减压浓缩干燥，设置水浴温度为80℃，回收正丁醇，浓缩至无液体溢出时用甲醇（色谱纯）将其定容至10mL，作为北芪菇供试品溶液备用；

步骤b，黄芪甲苷标准品的制备：

精确称量10mg黄芪甲苷标准品加色谱纯甲醇定容于超声洗净的10mL容量瓶中，超声条件下充分溶解后得到1mg/mL的黄芪甲苷标准品溶液，并将其置于2～4℃的冰箱中保存备用；

步骤c，薄层层析分离纯化黄芪甲苷：

活化：将100x100mm的硅胶GH254层析板，于110℃的电热鼓风干燥箱中加热活化30min，除去薄层板吸附的水分子，增强其吸附能力；

点样：用微量进样器（平头）分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及黄芪甲苷标准品溶液25μL，用全自动点样机依次点样供试液4μL，黄芪甲苷标准品溶液2μL、3μL、6μL，点样参数为点样宽度10mm、点样间距10mm、点样速度2μL/min；

展开：以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为北芪菇、正北芪黄芪供试品展开剂，密封后，预饱和20min使展开剂蒸汽在层析缸中均匀分布，将点样后的层析板以约75°倾角放入层析缸中，上行展开，展开剂不能浸没点样斑点，以防点样物质在展开剂中溶解，待展开前沿距硅胶层析板顶端1cm处时，取出层析板；

显色：将层析板晾干后，用显色喷雾瓶向硅胶层析板均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，使之显色，于105℃电热鼓风干燥箱加热至显色清晰为止。用同样大小的玻璃板覆盖，周围用胶布固定，减慢氧化速度；

检视：于紫外波长365nm下对层析板检视，观察对比对照品位置，Rf值相同，呈橙黄色荧光斑点的为北芪菇和正北芪样品中的黄芪甲苷，薄层色谱成像系统拍照，并标志；

步骤d，双波长薄层扫描法测定黄芪甲苷的含量：

将层析板放入全能型薄层色谱扫描仪中，利用手动调节位置功能确定背景及各个黄芪甲苷斑点的横、纵坐标，先用光谱扫描确定黄芪甲苷的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

结果分析：

1.黄芪甲苷薄层色谱分析：

供试品及标准品溶液经点样展开并显色后，日光下供试品在与标准品在相应的位置上显相同的棕褐色斑点，在紫外（365nm）检视下，图2、3可见，供试品色谱在与黄芪甲苷标准品图谱相应的位置上都呈现橙黄色荧光斑点，且荧光斑点位置一致，其Rf值均为0.26。由此可以判断，北芪菇和正北芪中均含有黄芪甲苷。

2.双波长薄层扫描法检测黄芪甲苷含量：

使用薄层色谱扫描仪在200～850nm波长内对黄芪甲苷斑点进行光谱扫描，图4-6可见，结果显示供试品与黄芪甲苷标准品在313nm出均有最大吸收，700nm几乎无吸收，故选择λ_S=313nm，λ_R=700nm。

线性范围的考察：以黄芪甲苷标准品微克数为横坐标（X），吸收峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.067X+0.0584（r=0.981）见图7，黄芪甲苷在2～6μg范围内峰面积与标准品量呈良好的线性关系，黄芪甲苷标准品微克数与吸收峰峰面积正相关。由于标准曲线方程不过坐标原点，采用外标两点法测定供试品溶液中黄芪甲苷的含量。

稳定性试验：将标准品溶液点于硅胶层析板上，展开、显色后，立即测定峰面积，以后每隔30min测定一次峰面积，结果显示其在2.5h内稳定，RSD为1.6％（n=6）。

精密度试验：用全自动点样机在活化后的GH254硅胶层析板上精密点黄芪甲苷标准品溶液2μL，共5个点。展开、显色后，扫描测定吸收峰峰面积积分值。RSD为0.9％（n=5）。

样品含量测定：

吸取黄芪甲苷标准品溶液25μL，在硅胶G板上分别点样2μL、3μL、6μL，再吸取供试品溶液25μL，在同一硅胶G板上点供试品溶液4μL，展开、显色后，利用反射扫描法测定含量。

北芪菇中黄芪甲苷的平均含量为0.023％。

表2 北芪菇中黄芪甲苷的含量

	第一组	第二组	第三组	平均值
					含量（%）	0.02198	0.01988	0.02798	0.02328

按相同的方法测得正北芪中黄芪甲苷的含量为0.065％。

结论：以北芪菇为原料，乙醇、水的体积比7:3为提取剂，经微波超声波萃取仪（分三阶段提取，每阶段5min，共15min。在超声波恒定的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，确定最佳超声波功率为800、900、1000W，微波功率为250、300、350W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速900r/min）辅助处理，采用多级萃取法获得了黄芪甲苷正丁醇相。

展开，10%的硫酸-乙醇显色，薄层成像系统365nm下检视，硅胶层析板上荧光斑点显色清晰，样品中有1处斑点与黄芪甲苷标准品位置一致，且均呈橙黄色斑点，其R_f值为0.26。

双波长薄层扫描结果为：λ_S=313nm，λ_R=700nm；此条件下，薄层扫描峰面积积分值与含量线性关系良好（r=0.981），精密度试验RSD=0.9%（n=5），供试品在2.5h内稳定RSD=1.6%（n=6），外标两点法测得北芪菇和正北芪中黄芪甲苷的含量分别为0.023％和0.065％。

实施例2

步骤a，黄芪苷的粗提取：

将北芪菇于通风处阴干至材料发脆，恒温箱内(40～50℃)烘干，用高速多功能粉碎机粉碎，过80目筛筛选，装入玻璃器皿中保存，准确称取3份10.0g于500mL的锥形瓶中分别加入250mL的70%乙醇，50℃下气浴恒温振荡器中振荡浸提24h形成浸提液；

超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，根据表1选取最佳微波超声波条件，在超声波恒定的条件下萃取，设置温度为45℃、50℃、55℃，最终测得超声波功率为800、900、1000W，微波功率为250、300、350W为佳，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，反复提取3次，合并上清液过滤、浓缩至体积的1/10；

表3 微波及超声波参数

用2倍体积的石油醚萃取水提取液2h，弃去石油醚相，保留水相，去杂后，待水相挥发至无石油醚味后，用等体积的水饱和正丁醇萃取3次，合并上层溶液（正丁醇相），添加适量的纯水使其形成共沸物后于旋转蒸发仪减压浓缩干燥，设置水浴温度为80℃，回收正丁醇，浓缩至无液体溢出时用甲醇（色谱纯）将其定容至10mL，作为北芪菇供试品溶液备用；

步骤b，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品的制备：

精确称量10mg黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品分别加甲醇（色谱纯）定容于超声洗净的10mL容量瓶中，超声条件下充分溶解后分别得到1mg/mL的黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品溶液，并将其置于2～4℃的冰箱中保存备用；

步骤c，薄层层析分离纯化黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ：

活化：将100x100mm的硅胶GH254层析板，于115℃的电热鼓风干燥箱中加热活化20min，除去薄层板吸附的水分子，增强其吸附能力；

点样：用微量进样器(平头)分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及黄芪皂苷Ⅰ标准品溶液25μL，用全自动点样机依次点供试液3μL，黄芪皂苷Ⅰ标准品溶液2μL、3μL、6μL，点样参数为点样宽度10mm、点样间距10mm、点样速度2μL/min；

黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅲ点样方法同上；

展开：以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为北芪菇、正北芪黄芪供试品展开剂，倒入展开缸中，密封后，预饱和20min使展开剂蒸汽在层析缸中均匀分布，将点样后的层析G板以约75°倾角轻轻放入展开剂液面高约2-3mm高的平卧式层析缸中，上行展开，展开剂不能浸没点样斑点，以防点样物质在展开剂中溶解，待展开前沿距硅胶层析板顶端1cm处时，取出层析板；

显色：将层析板晾干后，用显色喷雾瓶向硅胶层析板均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，使之显色，于105℃电热鼓风干燥箱加热至显色清晰为止。用同样大小的玻璃板覆盖，周围用胶布固定，减慢氧化速度；

检视：于紫外波长365nm下对层析板检视，观察对比对照品位置，Rf值相同，呈橙黄色荧光斑点的为北芪菇和正北芪样品中的黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，薄层色谱成像系统拍照，并标志；

步骤d，双波长薄层扫描法测定黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量：

将层析板放入全能型薄层色谱扫描仪中，利用手动调节位置功能轨迹跟踪确定背景及各个黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ斑点的横、纵坐标，先用光谱扫描确定黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

结果分析：

1.黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ薄层色谱分析：

供试品及黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品溶液经点样展开并显色后，日光下供试品在与黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品在相应的位置上显相同的棕褐色斑点，在紫外365nm检视下，图2、3可见，供试品色谱在与黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品图谱相应的位置上都呈现橙黄色荧光斑点，且荧光斑点位置一致，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Rf值分别为0.71、0.54和0.34。由此可以判断，北芪菇和正北芪中均含有黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

2.双波长薄层扫描法检测黄芪皂苷Ⅰ含量：

使用薄层色谱扫描仪在200～850nm波长内对黄芪皂苷Ⅰ斑点进行光谱扫描，图8-10可见，结果显示供试品与黄芪皂苷Ⅰ标准品在306nm出均有最大吸收，700nm几乎无吸收，故选择λ_S=306nm，λ_R=700nm。

线性范围的考察：以黄芪皂苷Ⅰ标准品微克数为横坐标（X），吸收峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.5477X+0.5967(r=0.9816)，见图11，黄芪皂苷Ⅰ在2～6μg范围内峰面积与黄芪皂苷Ⅰ标准品量呈良好的线性关系。由于标准曲线方程不过坐标原点，采用外标两点法测定供试品溶液中黄芪皂苷Ⅰ的含量。

稳定性试验：将供试品溶液点于硅胶层析板上，展开、显色后，立即测定峰面积，以后每隔30min测定一次峰面积，结果显示其在2.5h内稳定，RSD为1.40％（n=6）。

精密度试验：用全自动点样机在活化后的GH254硅胶层析板上精密点黄芪皂苷Ⅰ溶液2μL，共5个点。展开、显色后，扫描测定吸收峰峰面积积分值。RSD为1.30％（n=5）。

样品含量测定：

吸取黄芪皂苷Ⅰ标准品溶液25μL，在硅胶层析板上分别点样2μL、3μL、6μL，再吸取供试品溶液25μL，在同一硅胶层析板上点供试品溶液4μL，展开、显色后，利用反射扫描法测定含量。

表4 北芪菇中黄芪皂苷Ⅰ的含量

	第一组	第二组	第三组	平均值
					含量（%）	0.0581	0.0493	0.0401	0.0493

3.双波长薄层扫描法检测黄芪皂苷Ⅱ含量：

使用薄层色谱扫描仪在200～850nm波长内对黄芪皂苷Ⅱ斑点进行光谱扫描，图12-14可见，结果显示供试品与黄芪皂苷Ⅱ标准品在308nm出均有最大吸收，700nm几乎无吸收，故选择λ_S=308nm，λ_R=700nm。

线性范围的考察：以黄芪皂苷Ⅱ标准品微克数为横坐标（X），吸收峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.9024X-0.5681(r=0.9664)，见图15，黄芪皂苷Ⅱ在2～6μg范围内峰面积与黄芪皂苷Ⅱ标准品量呈良好的线性关系。由于标准曲线方程不过坐标原点，采用外标两点法测定供试品溶液中黄芪皂苷Ⅱ的含量。

稳定性试验：将供试品溶液点于硅胶层析板上，展开、显色后，立即测定峰面积，以后每隔30min测定一次峰面积，结果显示其在2.5h内稳定，RSD为1.10％（n=6）。

精密度试验：用全自动点样机在活化后的GH254硅胶层析板上精密点黄芪皂苷Ⅱ溶液2μL，共5个点。展开、显色后，扫描测定吸收峰峰面积积分值。RSD为1.50％（n=5）。

样品含量测定：

吸取黄芪皂苷Ⅱ标准品溶液25μL，在硅胶层析板上分别点样2μL、3μL、6μL，再吸取供试品溶液25μL，在同一硅胶层析板上点供试品溶液4μL，展开、显色后，利用反射扫描法测定含量。

表5 北芪菇中黄芪皂苷Ⅱ的含量

	第一组	第二组	第三组	平均值
					含量（%）	0.0232	0.0251	0.0248	0.0244

4.双波长薄层扫描法检测黄芪皂苷Ⅲ含量；

使用薄层色谱扫描仪在200～850nm波长内对黄芪皂苷Ⅲ斑点进行光谱扫描，图16-18可见，结果显示供试品与黄芪皂苷Ⅲ标准品在306nm出均有最大吸收，700nm几乎无吸收，故选择λ_S=304nm，λ_R=700nm。

线性范围的考察：以黄芪皂苷Ⅲ标准品微克数为横坐标（X），吸收峰峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=0.5956X-0.1195(r=0.9945)，见图19，黄芪皂苷Ⅲ在2～6μg范围内峰面积与黄芪皂苷Ⅲ标准品量呈良好的线性关系。由于标准曲线方程不过坐标原点，采用外标两点法测定供试品溶液中黄芪皂苷Ⅲ的含量。

稳定性试验：将供试品溶液点于硅胶层析板上，展开、显色后，立即测定峰面积，以后每隔30min测定一次峰面积，结果显示其在2.5h内稳定，RSD为1.50％（n=6）。

精密度试验：用全自动点样机在活化后的GH254硅胶层析板上精密点黄芪皂苷Ⅲ溶液2μL，共5个点。展开、显色后，扫描测定吸收峰峰面积积分值。RSD为1.30％（n=5）。

样品含量测定：

吸取黄芪皂苷Ⅲ标准品溶液25μL，在硅胶层析板上分别点样2μL、3μL、6μL，再吸取供试品溶液25μL，在同一硅胶G板上点供试品溶液4μL，展开、显色后，利用反射扫描法测定含量。

北芪菇中黄芪皂苷Ⅲ的平均含量为0.0497％，

表6 北芪菇中黄芪皂苷Ⅲ的含量

	第一组	第二组	第三组	平均值
					含量（%）	0.0411	0.0443	0.0427	0.0497

结论：以北芪菇为原料，乙醇、水的体积比7:3为提取剂，经微波超声波萃取仪（分三阶段提取，每阶段5min，共15min。在超声波恒定的条件下，设置温度为45℃、50℃、55℃，确定最佳超声波功率为800、900、1000W，微波功率为250、300、350W，超声波频率为50KHz，模式15:10，电机转速900r/min）辅助处理，采用多级萃取法获得了黄芪苷正丁醇相。

展开，10%的硫酸-乙醇显色，薄层成像系统紫外365nm下检视，硅胶层析板上荧光斑点显色清晰，样品中有3处斑点分别与黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ标准品位置一致，且均呈橙黄色斑点，Rf值分别为0.71、0.54和0.34。

双波长薄层扫描结果为：供试样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的样品波长（λs）分别为306nm、308nm和304nm，参比波长(λ_R)均为700nm；此条件下，黄芪皂苷Ⅰ（r=0.9816）、黄芪皂苷Ⅱ（r=0.9664）、黄芪皂苷Ⅲ（r=0.9945），薄层扫描峰面积积分值与含量线性关系良好，精密度试验，RSD分别为1.30%、1.50%、1.30%（n=5)，供试样品在2.5h内稳定，RSD分别为1.40%、1.10%、1.50%（n=6）。外标两点法测得北芪菇中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量分别为0.0493%、0.0244%、0.0427%。

本发明方法证实了北芪菇在生长发育过程中会对培养基中的黄芪苷起到一定的富集作用。由此看来，北芪菇有较高的生物学转化作用，作为经济型食用菌，拥有极高的营养价值和药用价值，值得广泛栽培。

本文所用的溶剂提取法是常用的中药成分提取方法，结合文献分析，最终选定以乙醇作为本实验的提取溶剂。现微波联合超声波提取比单一的超声波、微波提取效率更高，该方法不仅能使细胞内的目标物质充分溶解于提取剂中，不造成目标物质的损失，而且操作简单、用时短，大大的提高了提取效率，广泛的适用于各种物质的提取。经次优化试验条件，采用了硅胶G薄层板，该薄层板能够有效的分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。双波长薄层扫描法可基本消除铺板不均产生的误差，因此扫描基线很稳定。由于标准曲线方程没有过坐标原点，因此采用外标两点法对供试品溶液中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量进行了测定。

Claims (1)

1.一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理后，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，采用双波长薄层扫描法测定北芪菇中黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量，具体过程如下：

步骤a，以北芪菇粉为原料，分别加入70%乙醇，料液比为1:25，50℃下振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出时用甲醇将其定容备用；

步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ标准品加于色谱纯的甲醇中，超声条件下充分溶解后制得1mg/mL的标准品溶液，置于2～4℃的冰箱中保存备用；

步骤c，将层析板加热活化，用微量进样器分别吸取北芪菇、正北芪供试品溶液及标准品溶液25μL，依次点样供试液3-4μL，标准品溶液2μL、3μL、6μL，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开前沿距层析板顶端1cm处时，取出层析板晾干，均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，于105℃加热至显色清晰为止，用玻璃板覆盖，四周胶布固定，紫外365nm下检视，薄层色谱成像系统拍照，并标记；

步骤d，将层析板放入薄层色谱扫描仪中，确定背景及各个黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ斑点的横、纵坐标，采用光谱扫描确定黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的测定波长与参比波长，再用反射扫描法测定各个斑点的吸收峰峰面积积分值，根据黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收峰峰面积积分值与标准品量的线性关系，用外标两点法测定其含量。

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