CN109430853A - 一种有机枸杞酵素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机枸杞酵素及其制备方法。本发明以有机枸杞为主要原料，辅以红枣、人参果、山楂、玛咖、胡萝卜、百合、菊花、玫瑰花、金银花、决明子、银杏叶、桑叶、三七、黄芪和甘草，经过超声波清洗、深冷冻超微粉碎、复水、灭菌及酶解后，加入益生菌复合菌种进行前发酵和低温后熟发酵，再经过滤等工艺制成有机枸杞酵素。该方法最大限度的保留了枸杞等原料的各种营养成分，减少了化学添加剂的引入，提高了发酵的效率和酵素的安全性及营养保健功能。本发明酵素营养丰富、生物活性高，抗过敏、抗氧化能力强，尤其能够发挥增强免疫、抗过敏、抗氧化及保肝明目等功效。
Description
技术领域
本发明涉及酵素，特别涉及一种有机枸杞酵素及其制备方法。
背景技术
枸杞(Lycium barbarum L.)性味甘平，归肝、肾经，具有滋补肝肾、益精明目等功效，是卫生部批准的药食两用食物。早在《神农本草经》中记载：“枸杞久服能坚筋骨、耐寒暑，轻身不老，乃中药中之上品”。枸杞中含有丰富的枸杞多糖、胡萝卜素和氨基酸，并含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等特殊营养成分，使其具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、调节血脂、保肝、降血糖、血压及美容养颜等多种保健功效。
目前，市场上枸杞主要的产品形态以枸杞干果为主，枸杞行业正逐步从传统的粗放式的干果销售向枸杞精深加工转变。2018年3月，中宁县枸杞科技成果推介会上公开展示了枸杞压片糖果、枸杞泡腾片、枸杞酵素、枸杞富硒原浆啤酒、枸杞面膜、枸杞糖肽等一系列枸杞新产品，标志着枸杞产业精深加工迈向了全新的发展阶段。
酵素是指以动植物、菌类等为原材料，经微生物发酵制得的含有特定活性成分的产品，其包含了天然营养物质、生物酶、有益微生物及其活性代谢产物。关于枸杞酵素的公开专利文献较多，但其在原料的处理、发酵方式上存在着一些缺陷。原料的处理上，一般是将枸杞应用传统方法破碎打浆然后分离获得果汁，枸杞中的活性成分和各种营养成分损失严重，且传统破碎方法密封较差，易产生污染。发酵方式上，采用传统自然菌群发酵，不仅发酵周期长、发酵污染的风险大，而且酵素的口感和风味不稳定；采用现代复配纯种发酵，虽然发酵周期大大缩短，但使用的菌种多样，有些菌种不包含在卫生部办公厅公开的《可用于食品的菌种名单》中，酵素的安全性存在风险。因此，亟需开发一种生物活性高、营养丰富、稳定性强、口感和风味优良、发酵周期短且安全的枸杞酵素。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种有机枸杞酵素及其制备方法：本发明以有机枸杞为主要原料，辅以红枣、人参果、山楂、玛咖、胡萝卜、百合、菊花、玫瑰花、金银花、决明子、银杏叶、桑叶、三七、黄芪和甘草，经过超声波清洗、深冷冻超微粉碎、复水、灭菌、酶解和益生菌发酵、后熟，使酵素中各种成分协同作用。该方法不仅最大限度的保留了枸杞等原料的各种营养成分，减少了化学添加剂的引入，提高了发酵的效率和酵素的安全性及营养保健功能。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种有机枸杞酵素，它是由下述重量份的原料制成：有机枸杞80-100份，红枣10-20份，人参果10-20份，山楂10-20份，玛咖0-10份，胡萝卜0-10份，百合0-10份，菊花0-2份，玫瑰花0-2份，金银花0-2份，银杏叶0-2份，桑叶0-2份，决明子0-4份，三七0-4份，黄芪2-4份，甘草2-4份。
优选配比为：有机枸杞90份，红枣15份，人参果15份，山楂15份，玛咖5份，胡萝卜5份，百合5份，菊花1份，玫瑰花1份，金银花1份，银杏叶1份，桑叶1份，决明子2份，三七2份，黄芪3份和甘草3份。
制备方法：将各原料深冷冻超微粉碎至粒径颗粒小于30μm后，加水经过复合酶酶解、益生菌发酵、低温后熟发酵、过滤后得到有机枸杞酵素。
其中，所述复合酶为果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶按质量比2-4:0.8-1.2:0.8-1.2:1复配而成，各种酶的酶活要求≥1万U/g。
其中，益生菌群的组分及其活菌份数为：肠系膜明串珠菌肠膜亚种1-5份、乳酸乳球菌乳酸亚种1-5份、罗伊氏乳杆菌0-3份、嗜酸乳杆菌0-3份、植物乳杆菌0-3份、瑞士乳杆菌0-3份、鼠李糖乳杆菌0-3份和副干酪乳杆菌0-3份，其中罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌中至少含有2种杆菌，即上述6个杆菌最多4种的份数取值为0，至少2种不为0。优选比例为：肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各3份，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及副干酪乳杆菌各2份。益生菌群的总活菌数要求≥100亿cfu/ml。将上述各菌活化后分别培养得到培养液(按各菌的常规培养方法)，按活菌的份数进行各菌培养液复配后使用。
优选的，深冷冻超微粉碎前各原料优选采用超声波清洗。
本发明的有机枸杞酵素的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)超声波清洗：有机枸杞、红枣、人参果、山楂、玛咖、胡萝卜、百合用0.8-1.2％的盐水进行超声波清洗5-10min，之后再用清水清洗，沥干水分；菊花、玫瑰花、金银花、银杏叶、桑叶、决明子、三七、黄芪、甘草用0.1-0.3％的盐水进行超声波清洗3-8min，之后再用清水清洗，沥干水分；
(2)深冷冻超微粉碎：分别将清洗好的上述各种原料(其中红枣、山楂需去核)用深冷冻超微粉碎机进行超微粉碎，粒径颗粒小于30μm，将各种原料的超微粉按照比例混合均匀得发酵用超微粉；
(3)复水及灭菌：将上述发酵用超微粉按照1:4-6的重量比加入纯水，装入发酵罐，灭菌；
(4)酶解：向上述发酵液中加入复合酶酶解，复合酶的添加量为发酵液总质量的0.05-0.1％，40-50℃酶解2-4h，得到酶解发酵液；
(5)益生菌发酵及后熟：上述酶解发酵液快速冷却至35-37℃后，按照体积比接种1-5％益生菌群，35-37℃发酵5-7天，随后低温10-25℃后熟发酵20-30天；
(6)收获酵素：上述后熟好的发酵液经过滤去除残渣收集上清液，即得有机枸杞酵素液，酵素液还可按常规方法制备成有机枸杞酵素浸膏、颗粒、片剂及胶囊。
各原料及作用：
枸杞(Lycium barbarum L.)性味甘平，归肝、肾经，含有丰富的枸杞多糖、胡萝卜素和氨基酸，并含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等特殊营养成分，具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、调节血脂、保肝、降血糖血压及美容养颜等多种保健功效。
红枣(jujube)，又名大枣，富含蛋白质、糖类、有机酸、维生素A、维生素C、维生素P、多种微量钙以及环磷酸腺苷等营养成份，其中维生素含量非常高，有“天然维生素丸”的美誉。《本草纲目》中记载：“红枣味甘性温、归脾胃经，有补中益气、养血安神、缓和药性的功效”。大枣含有丰富的维生素、三萜类化合物及环磷酸腺苷，有较强的美容护肤、抑癌、抗过敏等作用；枣中含有抗疲劳作用的物质，能增强人的耐力；枣还具有减轻毒性物质对肝脏损害的功效；枣中的黄酮类化合物，有镇静降血压的作用。
人参果(Pepino Melon)，又名长寿果、凤果、艳果，果肉清香多汁，腹内无核，风味独特，具有高蛋白、低脂肪、低糖等特点，同时富含蛋白质、氨基酸以及微量元素、维生素与矿物元素，具有抗癌、抗衰老、降血压、降血糖、消炎、补钙、美容等保健功效。
山楂(Crataegus pinnatifida Bunge)，又名山里果、山里红，核果类水果，果肉薄，味微酸涩。果可生吃或作果脯果糕，干制后可入药，是中国特有的药果兼用树种，具有降血脂、血压、强心、抗心律不齐等作用，同时也是健脾开胃、消食化滞、活血化痰的良药，对胸膈脾满、疝气、血淤、闭经等症有很好的疗效。山楂内的黄酮类化合物牡荆素，是一种抗癌作用较强的药物，其提取物对抑制体内癌细胞生长、增殖和浸润转移均有一定的作用。
玛咖(Lepidium meyenii Walp)，富含高单位营养素，对人体有滋补强身的功用。玛咖中含有的丰富氨基酸、牛磺酸及矿物质锌等具有抗疲劳的作用，苄基硫代葡萄糖苷具有抗前列腺增生作用，芥子油苷、异硫氰酸苄酯、咪唑类生物碱等具有抗癌效果，玛卡烯和吗咖酰胺可以通过调节腺体来增加激素分泌来达成抗衰老以及抗氧化的功效。
胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa Hoffm.)，富含糖类、脂肪、挥发油、胡萝卜素、维生素A、维生素B1、维生素B2、花青素、钙、铁等营养成分，享有“小人参”、“金笋”的美誉。胡萝卜具有抗癌、增强免疫功能、防止血管硬化、降低血压、减少心脏病、益肝明目、通便、抗过敏、美丽容颜及预防感冒等功效。
百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)，鲜食干用均可，含有丰富的蛋白质、脂肪、还原糖及钙、磷、铁、维生素B、维生素C等营养素，还含有一些特殊的营养成分，如秋水仙碱等多种生物碱。百合味甘性寒，归心、肺经，具有润肺止咳、宁心安神、美容养颜、防癌抗癌等功效。
菊花为菊科植物的干燥头状花序，味苦、甘，性微寒，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、清热解毒等功效。
玫瑰花为蔷薇科植物玫瑰的干燥花蕾，味甘、微苦，性温，归肝、脾经，最明显的功效就是理气解郁、活血散淤和调经止痛。此外，玫瑰花的药性非常温和，能够温养人的心肝血脉，舒发体内郁气，起到镇静、安抚、抗抑郁的功效。
金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，性寒、味甘，入肺、心、胃经，具有清热解毒、抗炎、补虚疗风的功效，主治胀满下疾、温病发热，热毒痈疡和肿瘤等症。近代药理研究显示，金银花是一种作用很强的广谱抗菌中药，还具有加强免疫机能的作用。
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的功效。用于瘀血阻络，胸痹心痛，中风偏瘫，肺虚咳喘，高脂血症。
桑叶为桑科植物桑的干燥老叶，味苦、甘，性寒，归肺、肝经，具有疏散风热、清肺润燥、平肝明目、凉血止血的功效，主治风热感冒，温病初起，肺热咳嗽，肝阳上亢眩晕，目赤昏花，血热妄行之咳血、吐血。
决明子是豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子，以其有明目之功而名之。决明子味苦、甘、咸，性微寒，入肝、肾、大肠经；具有润肠通便、清肝明目、降血压降血脂的功效，治疗便秘及高血脂、高血压。
三七为五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根茎，味甘、微苦，性温，归肝、胃经，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，主治用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。
黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，性微温、味甘，入脾、肺、肝、肾经，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。其有效成分为黄芪多糖，是一种理想的免疫增强剂，它能够增强巨噬细胞吞噬功能，促进抗体合成，促进体内淋巴细胞转化，促进T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，提高白细胞产生抗病毒干扰素的能力，提高免疫球蛋白的含量，抑制病毒繁殖，对多种免疫缺陷症均有良好的防治作用。
甘草为双子叶植物豆科甘草、胀果甘草、光果甘草的根及根茎，性平、味甘，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓解气喘、调和诸药的功效。其能够解疮毒，解食物、药物中毒，既能够缓急止痛，又能够缓和药性。
本发明的有益效果：
(1)本发明以有机枸杞为主要原料，辅以红枣、人参果、山楂等辅料，原料通过深冷冻超微粉碎成超微粉，最大限度地保留了原料中的生物活性及各种营养成分，减少了有效成分的损失，并且超微粉碎是在封闭系统内进行的，既避免了超微粉污染周围环境，又可防止空气中的灰尘污染超微粉。超微粉还具有一般颗粒所没有的特殊理化性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等，能够提高发酵、酶解过程的化学反应速度。本发明克服了传统方法破碎打浆原料的缺陷。
(2)本发明采用现代复配纯种发酵，益生菌群包含肠系膜明串珠菌肠膜亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌等8种菌，这些菌均包含在卫生部办公厅公开的《可用于食品的菌种名单》中，即确保了酵素发酵的快速与稳定，又保障了酵素的安全无污染。不同的益生菌发挥不同的益生作用，产生不同的益生次级代谢产物，8种益生菌混合发酵可以使酵素的益生作用最大化。特别重要的是本发明应用的罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌6种菌均有较强的抗过敏作用，混合发酵不仅能协同增强抗过敏作用，还增强了酵素的风味。上述菌发酵过程中均产生乳酸，乳酸是三羧酸循环最主要的能量来源物质，是人体内重要的能量载体。另外，乳酸能抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠内生态平衡和肠道的正常机能，还能刺激肠道蠕动，润肠通便，清除肠中的垃圾，且对溃疡、下痢、腹泻和便秘也有显著治疗效果。
(3)本发明的有机枸杞酵素制备方法工艺简单，操作方便，生产周期短，可规模化生产。本方法制备的有机枸杞酵素生物活性高、营养丰富(含还原糖、多糖、蛋白质、游离氨基酸、乳酸、多酚、胡萝卜素等)、稳定性强、口感和风味优良、食用安全性高，尤其具有较强的抗过敏和抗氧化作用，可协调发挥增强免疫、抗过敏、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、调节胃肠道健康、调节血脂、保肝明目、降血糖血压及美容养颜等功效。
附图说明
图1为本发明实施例中有机枸杞酵素液清除DPPH自由基能力评估；
图2口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠的免疫球蛋白表达的影响；从实验第1天到第36天分别口服给予BALB/c小鼠实施例1～5酵素液，并于实验第2天及第16天腹腔注射OVA/Al(OH)3致敏；对照组(Control)和OVA组实验期间口服给予PBS，而对照组仅腹腔注射Al(OH)3。数据均用平均数±标准差表示(n＝10)。标有不同字母的组别差异显著，P＜0.05。
图3为口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠的气道高反应的影响。“*”、“#”表示同一乙酰甲胆碱浓度下实施例组与OVA组差异显著，P＜0.05。
图4为口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠肺冲洗液中细胞组成的影响。“*”、“#”表示与OVA组相比差异显著，P＜0.05。
图5口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠脾脏细胞因子IL-4和IFN-γ分泌的影响。标有不同字母的组别差异显著，P＜0.05。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
实施例1
一种有机枸杞酵素，其原料重量份如下：有机枸杞100份，红枣20份、人参果10份，山楂10份，玛咖10份，胡萝卜5份，菊花2份，玫瑰花2份，桑叶2份，决明子2份，黄芪4份，甘草4份。
有机枸杞酵素的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)按上述重量份称取各种原料，有机枸杞、红枣、人参果、山楂、玛咖和胡萝卜用1％的盐水进行超声波清洗5-10min，之后再用清水清洗1min，沥干水分；菊花、玫瑰花、桑叶、决明子、黄芪和甘草用0.2％的盐水进行超声波清洗5min，之后再用清水清洗1min，沥干水分。
(2)将清洗好的上述各种原料(其中红枣、山楂需去核)用深冷冻超微粉碎机进行超微粉碎，粒径颗粒小于30μm，最后将各种原料的超微粉按照比例混合均匀得发酵用超微粉。
(3)将上述发酵用超微粉按照1:6的重量比加入纯水，搅拌均匀后，装入发酵罐，80℃灭菌20min，冷凝水快速冷却至40-50℃。
(4)向发酵罐中添加发酵液总质量0.1％的预先活化的复合酶，复合酶中果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶的质量比为2:1:1:1，40-50℃酶解2h，得到酶解发酵液。
(5)上述酶解发酵液快速冷却至35-37℃后，按照其体积接种5％益生菌群，35-37℃发酵5天，随后低温10-25℃后熟发酵25天。按活菌数计，益生菌群中含肠系膜明串珠菌肠膜亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌各2份，即上述8种菌分别培养，按照等活菌数复配，复配后的益生菌群中总活菌数≥100亿/ml。
(6)后熟好的发酵液经过滤去除残渣收集上清液，即得有机枸杞酵素液，酵素液还可按常规方法制备成有机枸杞酵素浸膏、颗粒、片剂及胶囊。
实施例2
一种有机枸杞酵素，其原料重量份如下：有机枸杞90份，红枣、人参果、山楂各15份，玛咖、胡萝卜、百合各5份，菊花、玫瑰花、金银花、银杏叶、桑叶各1份，决明子、三七各2份，黄芪、甘草各3份。
有机枸杞酵素的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)按上述重量比称取各种原料，进行超声波清洗。有机枸杞、红枣、人参果、山楂、玛咖、胡萝卜、百合用1％的盐水进行超声波清洗5-10min，之后再用清水清洗1min，沥干水分；菊花、玫瑰花、金银花、银杏叶、桑叶、决明子、三七、黄芪、甘草用0.2％的盐水进行超声波清洗5min，之后再用清水清洗1min，沥干水分。
(2)将清洗好的上述各种原料(其中红枣、山楂需去核)用深冷冻超微粉碎机进行超微粉碎，粒径颗粒小于30μm，最后将各种原料的超微粉按照比例混合均匀得发酵用超微粉。
(3)将上述发酵用超微粉按照1:5的重量比加入纯水，搅拌均匀后，装入发酵罐，80℃灭菌20min，冷凝水快速冷却至40-50℃。
(4)向发酵罐中添加发酵液总量0.1％的预先活化的复合酶，复合酶中果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶的比例为3:1:1:1，40-50℃酶解3h，得到酶解发酵液。
(5)上述酶解发酵液快速冷却至35-37℃后，按照其体积接种3％益生菌群，35-37℃发酵6天，随后低温10-25℃后熟发酵25天。按活菌数计，益生菌群中含肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各3份，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及副干酪乳杆菌各2份。上述8种菌分别培养，按照上述份数复配，复配后的益生菌群中总活菌数≥100亿/ml。
(5)后熟好的发酵液经过滤去除残渣收集上清液，即得有机枸杞酵素液，酵素液还可按常规方法制备成有机枸杞酵素浸膏、颗粒、片剂及胶囊。
实施例3
一种有机枸杞酵素，其原料重量份为：有机枸杞80份，红枣、人参果、山楂各15份，胡萝卜10份，玫瑰花2份，决明子4份、黄芪2份、甘草4份。
有机枸杞酵素的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)按上述重量比称取各种原料，进行超声波清洗。有机枸杞、红枣、人参果、山楂、胡萝卜用1％的盐水进行超声波清洗5-10min，之后再用清水清洗1min，沥干水分；玫瑰花、决明子、黄芪、甘草用0.2％的盐水进行超声波清洗5min，之后再用清水清洗1min，沥干水分。
(2)将清洗好的上述各种原料(其中红枣、山楂需去核)用深冷冻超微粉碎机进行超微粉碎，粒径颗粒小于30μm，最后将各种原料的超微粉按照比例混合均匀得发酵用超微粉。
(3)将上述发酵用超微粉按照1:4的重量比加入纯水，搅拌均匀后，装入发酵罐，80℃灭菌20min，冷凝水快速冷却至40-50℃。
(4)向发酵罐中添加发酵液总量0.06％的预先活化的复合酶，复合酶中果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶的比例为3:1:1:1，40-50℃酶解4h，得到酶解发酵液。
(5)上述酶解发酵液快速冷却至35-37℃后，按照其体积接种2％益生菌群，35-37℃发酵7天，随后低温10-25℃后熟发酵30天。按活菌数计，益生菌群中含肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各2份，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌各1份。上述8种菌分别培养，按照上述份数复配，复配后的益生菌群中总活菌数≥100亿/ml。
(6)后熟好的发酵液经过滤去除残渣收集上清液，即得有机枸杞酵素液，酵素液还可按常规方法制备成有机枸杞酵素浸膏、颗粒、片剂及胶囊。
实施例4
原料及重量份同实施例2，其制备方法除发酵用的益生菌群组成差异外其余步骤均与实施例2相同。按活菌数计，益生菌群中含肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各3份，嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及副干酪乳杆菌各4份。上述8种菌分别培养，按照上述份数复配，复配后的益生菌群中总活菌数≥100亿/ml。
实施例5
原料及重量份同实施例2，其制备方法除发酵用的益生菌群组成差异外其余步骤均与实施例2相同。按活菌数计，益生菌群中含肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各3份，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌及鼠李糖乳杆菌各3份。上述8种菌分别培养，按照上述份数复配，复配后的益生菌群中总活菌数≥100亿/ml。
试验例1：
应用国家标准GB 5009.7-2016、GB/T 18672-2002、GB 5009.5-2016、GB5009.124-2016、GB/T 8313-2008、GB 5009.83-2016、GB/T 5009.157-2016及GB 10468-1989分别检测上述实施例中的有机枸杞酵素液中的还原糖、多糖、蛋白质、游离氨基酸、多酚、胡萝卜素、乳酸含量及酵素液的pH值，应用国家标准GB 4789.2-2016检测有机酵素液中的细菌活菌数，应用国家标准GB/T 5009.171-2003测定有机酵素液中超氧岐化酶(SOD)活性，应用DPPH(二苯基苦基苯肼)法评价有机酵素液的清除自由基的能力。
表1本发明实施例中有机枸杞酵素液的各指标的比较
从表1和图1可看出，本发明的有机枸杞酵素含有丰富的营养成分如还原糖、多糖、蛋白质、游离氨基酸和乳酸等，生物活性物质如多酚、胡萝卜素、SOD等的含量也很高，并含有大量的活性益生菌，还具有较强的抗氧化清除自由基的能力。尤其是丰富的胡萝卜素赋予本发明酵素优良的明目功效，丰富的生物活性物质如多酚、SOD等赋予本发明酵素较强的抗氧化清除自由基的能力。同时从表1可以看出：实施例2的各方面指标最佳，为优选实施例。
试验例2：
采用卵白蛋白(OVA)诱导的小鼠过敏性哮喘模型来评估本发明的有机枸杞酵素的抗过敏作用。过敏与2型T辅助细胞(Th2细胞)反应有关。Th2细胞反应的特征在于产生某些细胞因子如白介素(IL)-4、IL-5、IL-13，并产生总免疫球蛋白(Ig)E、抗原特异性IgE和IgG1。而Th1细胞可通过分泌干扰素(IFN)-γ、IgG2a、IL-2等从而抑制Th2细胞反应。因此，抑制Th2细胞反应同时增强Th1细胞反应将有助于过敏性疾病的治疗。
1.实验方法
1.1试验动物饲养及分组
4周龄雌性BALB/c小鼠购自山东大学实验动物中心，自由饮水摄食，饲养温度20-25℃，相对湿度40-60％，适应2周后开始实验。小鼠6周龄时随机分为7组，每组10只，其中5组以管饲方式每天给予受测酵素液(实施例1-5酵素液)0.4mL同时进行OVA/Al(OH)3致敏，1组以管饲方式每天给予PBS 0.4mL同时进行OVA/Al(OH)3致敏，剩余1组为健康对照组，以管饲方式每天给予PBS 0.5mL同时以Al(OH)3进行致敏操作过程。
1.2 OVA诱导的小鼠过敏性哮喘模型的建立
于实验开始第2天及第16天以100μL含有50μg OVA的Al(OH)3进行腹腔注射，于第30天、第31天、第32天以鼻腔内(in)滴入100μg OVA的方式诱发呼吸道炎症反应。鼻内给药后2天，检测小鼠的肺呼吸阻力反应，隔天处死小鼠进行其它生化指标的检测。
1.3血清样品的收集及血清免疫球蛋白表达的测定
于实验第1天及实验终结时(第36天)对小鼠进行眼眶静脉窦采血，血液4℃静置后离心分离血清，暂存于-20℃。使用ELISA试剂盒测定总IgE及OVA特异性IgE、IgG1和IgG2a的含量。总IgE ELISA试剂盒购自Bethyl Laboratory Inc.，OVA特异性Ig ELISA试剂盒购自Alpha Diagnostic International Inc.。
1.4气道高反应(AHR)的测定
在开始实验第34天(即鼻内给药后2天)，通过全身体积描记测定小鼠的AHR。将小鼠在清醒状态下置于全身体积扫描仪腔室内，以超声波震荡气化的生理盐水(基线测定)或渐增浓度的乙酰甲胆碱(6.25、12.5、25、50mg/mL)诱发小鼠3min后，记录3min内每分钟增强的呼吸间歇(Penh)比率，并平均读数，将平均Penh值除以生理盐水的Penh值，获得Penh的相对增加百分比。
1.5肺冲洗液的细胞组成分析
处死小鼠后，立即以1mL无菌HBBS缓冲液冲洗肺部，连续冲洗3次。肺冲洗液4℃离心，弃上清，细胞沉淀再次悬浮于1mL无菌HBSS缓冲液中。用标准血球计数器计数肺冲洗液的细胞总量，取约1×105个细胞以细胞离心涂片机制作细胞涂片，以刘氏染色液染色，封片。随机观察至少300个细胞，计算巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞的细胞比例。
1.6脾脏细胞因子的测定
实验终结时处死小鼠，无菌摘取脾脏，常规处理获得脾脏细胞。将脾脏细胞用含10％FBS、1％L-谷氨酸盐、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基调整至5×106个细胞/mL。将细胞置于恒温培养箱37℃、5％CO2条件下培养48h后，收集上清液并储存于-80℃，以备细胞因子含量的测定。测定IL-4及IFN-γ的浓度采用ELISA试剂盒，均购自eBioscience。
1.7数据统计分析
实验结果均表示为平均值±标准差。各组间差异分析采用单因素方差分析和Tukey多重比较，P＜0.05视为差异显著。
2结果
2.1口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠的免疫球蛋白表达的影响
本实验中，口服给予小鼠本发明有机枸杞酵素液(实施例1～5)36天，同时于实验开始第2天及第16天腹腔注射OVA/Al(OH)3致敏。实验36天时，相较于OVA致敏组，给予本发明酵素液的小鼠血清中总IgE、OVA特异性IgE和OVA特异性IgG1的浓度显著下降，而OVA特异性IgG2a的浓度显著升高(图2)。从图2还可看出，实施例2酵素液抑制OVA致敏小鼠血清中总IgE和OVA特异性IgE的作用最强，而促进OVA特异性IgG2a的作用最强，表明实施例2酵素液的抗过敏效果最好。
2.2气道高反应(AHR)的测定结果
实验小鼠于实验第30～32天滴鼻OVA诱发呼吸道炎症，1天后采用非侵入性的全身体积描记评估小鼠的气道高反应。如图3所示，相对于对照组，OVA组和实施例1～5组小鼠的Penh值呈现乙酰甲胆碱浓度依赖性增加的趋势。与OVA组相比，口服给予实施例1～5酵素液显著降低小鼠在高浓度乙酰甲胆碱(25mg/mL和50mg/mL)刺激下的Penh值。
2.3肺冲洗液的细胞组成分析结果
通过计数肺冲洗液中的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞的数量，评估实验小鼠肺部发炎的情况。与对照组相比，OVA组小鼠肺冲洗液中巨噬细胞的比例显著降低，而嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的比例显著增加，表明OVA组小鼠肺部呈现明显的过敏性炎症。与OVA组相比，口服给予实施例1～5酵素液显著降低小鼠肺冲洗液中嗜酸性粒细胞的比例，并显著提高小鼠肺冲洗液中巨噬细胞的比例，表明口服给予实施例1～5酵素液能显著缓解肺部的过敏性炎症(图4)。
2.4口服给予本发明有机枸杞酵素液对OVA致敏小鼠脾脏细胞因子分泌的影响。
通过测定Th2细胞因子IL-4和Th1细胞因子IFN-γ来评估口服给予实施例1～5酵素液对OVA致敏小鼠脾脏细胞因子表达的影响。与对照组相比，OVA组小鼠脾脏细胞分泌IL-4的量显著增加，而分泌IFN-γ的量显著降低，表明OVA致敏导致免疫反应倾向于Th2免疫反应。然而，口服给予实施例1～5酵素液显著降低IL-4的分泌量，并显著增加IFN-γ的分泌量(图5)，表明口服给予实施例1～5酵素液使免疫反应由Th2向Th1倾斜。
本实验结果显示，OVA过敏性小鼠口服给予本发明有机枸杞酵素液能够显著降低血清总IgE、OVA特异性IgE及OVA特异性IgG1，显著缓解OVA诱导的吸入乙酰甲胆碱的气道高反应，显著降低肺冲洗液中嗜酸性粒细胞的比例，显著降低脾脏细胞IL-4的分泌；并显著升高血清OVA特异性IgG2a水平和肺冲洗液中巨噬细胞的比例及显著增加脾脏细胞IFN-γ的分泌，表明本发明有机枸杞酵素具有显著的抗过敏功效，其抗过敏作用可能是通过增强Th1细胞免疫反应而抑制Th2细胞免疫反应来实现的。
综上所述，本发明的有机枸杞酵素营养丰富、生物活性高，抗过敏抗氧化能力强，可发挥增强免疫、抗过敏、抗衰老、抗肿瘤、抗疲劳、调节胃肠道健康、调节血脂、保肝明目、降血糖血压及美容养颜等功效。
Claims (9)
1.一种有机枸杞酵素，它是由下述重量份的原料制成：有机枸杞80-100份，红枣10-20份，人参果10-20份，山楂10-20份，玛咖0-10份，胡萝卜0-10份，百合0-10份，菊花0-2份，玫瑰花0-2份，金银花0-2份，银杏叶0-2份，桑叶0-2份，决明子0-4份，三七0-4份，黄芪2-4份，甘草2-4份。
2.如权利要求1所述的一种有机枸杞酵素，它是由下述重量份的原料制成：有机枸杞90份，红枣15份，人参果15份，山楂15份，玛咖5份，胡萝卜5份，百合5份，菊花1份，玫瑰花1份，金银花1份，银杏叶1份，桑叶1份，决明子2份，三七2份，黄芪3份和甘草3份。
3.如权利要求1或2所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，将各原料深冷冻超微粉碎至粒径颗粒小于30μm后，加水经过复合酶酶解、益生菌发酵、低温后熟发酵、过滤后得到有机枸杞酵素。
4.如权利要求3所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，所述复合酶为果胶酶、蛋白酶、淀粉酶及纤维素酶按质量比2-4:0.8-1.2:0.8-1.2:1复配而成。
5.如权利要求3所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，所述益生菌群的组分及其活菌份数为：肠系膜明串珠菌肠膜亚种1-5份、乳酸乳球菌乳酸亚种1-5份、罗伊氏乳杆菌0-3份、嗜酸乳杆菌0-3份、植物乳杆菌0-3份、瑞士乳杆菌0-3份、鼠李糖乳杆菌0-3份和副干酪乳杆菌0-3份；其中罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和副干酪乳杆菌中至少含有2种；上述益生菌群的总活菌数要求≥100亿cfu/ml。
6.如权利要求5所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，所述肠系膜明串珠菌肠膜亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种各3份，罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及副干酪乳杆菌各2份。
7.如权利要求3所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，所述深冷冻超微粉碎前各原料采用超声波清洗。
8.如权利要求4-7中任意一项所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，依次包括以下步骤：
(1)超声波清洗：有机枸杞、红枣、人参果、山楂、玛咖、胡萝卜和百合用0.8-1.2％的盐水进行超声波清洗5-10min，之后再用清水清洗，沥干水分；菊花、玫瑰花、金银花、银杏叶、桑叶、决明子、三七、黄芪和甘草用0.1-0.3％的盐水进行超声波清洗3-8min，之后再用清水清洗，沥干水分；
(2)深冷冻超微粉碎：分别将清洗好的各种原料用深冷冻超微粉碎机进行超微粉碎，粒径颗粒小于30μm，将各种原料的超微粉按照比例混合均匀得发酵用超微粉；
(3)复水及灭菌：将上述发酵用超微粉按照1:4-6的重量比加入水，装入发酵罐，灭菌，得到用于发酵的发酵液；
(4)酶解：向上述发酵液中加入复合酶酶解，复合酶的添加量为发酵液总质量的0.05-0.1％，40-50℃酶解2-4h，得到酶解发酵液；
(5)益生菌发酵及后熟：上述酶解发酵液快速冷却至35-37℃后，按照体积比接种1-5％益生菌群，35-37℃发酵5-7天，随后低温10-25℃后熟发酵20-30天；
(6)收获酵素：上述后熟好的发酵液经过滤去除残渣收集上清液，即得有机枸杞酵素液。
9.如权利要求8所述的有机枸杞酵素的制备方法，其特征是，所述有机枸杞酵素液进一步加工成有机枸杞酵素浸膏、颗粒、片剂或者胶囊。
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