CN109430059A - 一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法 - Google Patents

一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法 Download PDF

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阮继伟
屈云慧
杨春梅
田林孟
汪国鲜
吴丽芳
单芹丽
余蓉培
李帆
吴旻
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Abstract

一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法，通过对种球预处理一次得到两种类型的外植体，经过灭菌消毒接种至启动培养基，后进行增殖培养、生根培养、练苗移栽，培养过程中针对不同类型的外植体给予不同的培养方式和培养条件，大幅度增加了材料基数，使得种苗产量得到大量提高，提高了生产效益。

Description

一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种切花虎眼万年青离体培养快繁的方法。
背景技术
虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Jacq.)，别名海葱、鸟乳花，为百合科、虎眼万年青属多年生草本植物。目前国际花卉市场涌现出一批虎眼万年青切花品种，其花枝较长，花朵繁密，切花吸水性佳，瓶插水养观赏期长达1个多月。以其主材插花，配以香石竹、马蹄莲、变叶木、香石竹，素雅淡然，摆放窗台和居室，均十分雅致耐观。
随着生活水平的不断提供，人们对花卉的需求也逐年增强并呈现多元化的趋势，特别是在鲜切花消费领域表现更突出。在原有的国际四大鲜切花(月季、康乃馨、百合、菊花)消费的基础上，消费者对新奇品种、特殊花型等提出了新的消费需求。切花虎眼万年青为特有的蝎尾状花序，其花色丰富，有白色、黄色、橙色；瓶插期长，室内瓶插期是同类型花序中最长的品种，长达1个多月，观赏价值极高，目前消费市场逐渐升温，种植环节对种苗的数量需求逐年增大。
虎眼万年青现有的繁育方式主要是鳞片扦插繁育，但由于其鳞茎的繁殖系数低,鳞片扦插操作繁琐，费工费力，生产效率低下(鳞茎属有皮鳞茎，鳞片剥取困难，鳞茎小鳞片弱，扦插繁殖成苗率低)，无法满足日益增长的市场需求。而现有的组培快繁体系均是以单一的技术手段来实现快速成苗(如：叶片诱导、花柄诱导甚至花苞诱导等)，未能把组培快繁手段运用到最佳状态，导致无菌系建立到成苗周期延长、每一批次生产的种苗产量低，生产成本高。
发明内容
为解决虎眼万年青批次生产种苗产量低的技术问题，本发明提供一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法，本发明所提供的切花虎眼万年青离体培养快繁方法，包括如下步骤：
(1)外植体的选择与处理：
将选择的切花虎眼万年青目标品种的健康种球在4℃低温条件下放置14～16天至种球长出0.5～1㎝萌芽，清除种球老化的干瘪鳞茎皮露出肥厚部分，用手术刀片沿种球纵向从上到下将种球分割为四瓣，且不划伤心芽，每瓣的底部带有相应的鳞茎基部，剥离出单个完整心芽，并将各瓣剥成单片的鳞片，且各鳞片及心芽的底部均带有相应的鳞茎基部，用清水冲洗鳞片和心芽2-3次，用浓度为0.1％w/w的HgCl2溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次,再用添加有吐温20的2％w/w NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，在无菌操作台上吹干其表面水分；所述添加有吐温20的2％w/w NaClO溶液为在100毫升的2％w/w NaClO溶液中添加2滴吐温20；
(2)无菌系建立与启动培养：
将步骤(1)经过处理的鳞片和心芽分别接种到均盛有启动培养基的不同培养瓶中，接种心芽的培养瓶为心芽组，接种鳞片的培养瓶为鳞片组，所述启动培养基为：MS+6-BA1～2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0；①心芽组置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，培养14～16d至心芽长大为无根植株，且无根植株的基部分化出幼芽；②鳞片组暗处理14～16d至鳞片伤口处分化出鳞茎芽点，再置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，培养28～30d至鳞片分化出幼芽；
(3)增殖培养：
将(2)心芽组中心芽抽生的叶片切成长1.3～1.5cm小块，心芽组中除叶片以外的其余材料和鳞片组中所有材料切成带有3-4个芽体的小块，将所有小块转接到增殖培养基中培养18-20d至有芽苗长到3～4cm，增殖培养条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，增殖培养基为：1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0；
(4)生根培养：
①切取步骤(3)中生长至3cm以上的芽体，接种到生根培养基，培养15-20d至生根，然后整瓶移至搭建有遮光率为30％的遮阳网的大棚苗床上炼苗3-5d即得组培苗，大棚内温度18～28℃；所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭粉1g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0，生根培养条件：光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d；
②将步骤(3)中除(4)①已经切取的3cm以上的芽体外的其余材料切成带有3～4个芽体的小块，且其中的叶片切成长1.3～1.5cm小块，所有这些小块接种到与步骤(3)相同的增殖培养基中增殖扩繁培养，培养条件与步骤(3)所述的增殖培养条件相同；之后重复步骤(4)①和步骤(4)②直至得到组培苗；
(5)组培苗移栽管理：
将步骤(4)获得的组培苗取出、洗净、杀菌剂消毒后移栽至盛有基质的穴盘中，用透明的塑料膜覆盖穴盘保温、保湿并在穴盘上方搭建遮光率为30-50％的遮阳网，于移栽的第9天～第11天揭去塑料膜和遮阳网，于移栽的第20天以后，每周喷施1000ppm平衡型大量水溶肥一次，于移栽的第40天～第50天，即得虎眼万年青穴盘种苗；所述平衡型大量水溶肥以质量分数计含：N 20％、P2O520％、K2O 20％，B 0.10％、Cu 0.02％、Fe 0.80％、Mn0.25％、Mo 0.020％、Zn 0.08％。
步骤(5)中所述的基质为由珍珠岩和草炭按珍珠岩:草炭的体积比为1:2混合而成。
步骤(5)中所述的穴盘规格为200穴/盘的穴盘。
步骤(5)中所述的杀菌剂消毒是用混合杀菌剂1000～1200倍液浸泡洗净后的组培苗2～3min，所述混合杀菌剂由30％恶霉灵水剂6重量份、50％多菌灵可湿性粉剂2重量份和50％福美双可湿性粉剂2重量份混合而成。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明通过外植体低温处理可一步获得两种外植体，一种是打破休眠状态的鳞片，一种是心芽，通过低温处理缩短了外植体的启动培养时间，萌发的心芽短时间内(14-16天)培养即可获得大量诱导物—叶片。如果不进行低温处理鳞片诱导出幼芽的时间延长(通常延长5-7天)，不进行低温处理的种球心芽细弱，从而延长了启动培养的周期(延长周期5-7天)且影响后期产量。
2、本发明的鳞片和心芽外植体的底部均带有相应的鳞茎基部，其鳞茎基部能生长出更多的鳞茎芽。
3、针对鳞片和心芽两种外植体，采用有针对性的、不同的培养条件，使得两种外植体在各自适宜的环境下，可快速生长成苗，短时间内能顺利生长出大量的繁殖材料。
前述1、2、3的创新增大了母瓶材料基数，为后期产量的提高打下了良好的基础。
4、在生根培养过程中，针对性地将3cm以上的芽体和除3cm以上的芽体外的其余材料，进行不同的培养，快速增大培养目标的培养基数，为提高批次虎眼万年青种苗产量又进一步提供了良好的基础。
5、采用地膜覆盖炼苗最大限度的保证了幼苗成活率，成苗率达100％，同时降低育苗期管理成本(地膜覆盖保湿减少人工补水环节)，缩短了成苗周期时间10-15天。
综上所述，本发明仅用种球培育出非单一材料，对非单一材料分别采用适宜的、最优的培养方案，多步骤为增大材料基数，各步骤的创新和协同配合，解决了目前虎眼万年青种苗产量较低的技术问题，采用本发明方法，平均1粒种球就可生产出87-109株种苗，同一批次采用10粒种球平均即可生产出870-1090种苗，生产效益高，同时生产周期短(164-179天)、成苗率达到100％，产生了预料不到的技术效果。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，给出本发明的实施例，实施例中无特殊说明的为常规方法。
实施例1
(1)外植体的选择与处理：
于2017年1月7日将切花虎眼万年青Princestar品种的健康种球(无病虫害的种球)10粒在4℃低温条件下放置14～16天至种球长出0.5～1㎝萌芽。
2017年1月23日进行外植体采集及灭菌，具体操作方法：清除上述种球老化的干瘪鳞茎皮露出肥厚部分，用手术刀片沿种球纵向从上到下将种球分割为四瓣，且不划伤心芽，每瓣的底部带有相应的鳞茎基部，剥离出单个完整心芽，并将各瓣剥成单片的鳞片，且各鳞片及心芽的底部均带有相应的鳞茎基部，用清水冲洗鳞片和心芽2-3次，用浓度为0.1％w/w的HgCl2溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，再用添加有吐温20的2％w/w NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，在无菌操作台上吹干其表面水分；所述添加有吐温20的2％w/wNaClO溶液为在100毫升的2％w/w NaClO溶液中添加2滴吐温20。
(2)无菌系建立与启动培养：
将步骤(1)经过处理的鳞片和心芽分别接种到均盛有启动培养基的不同培养瓶中，接种心芽的培养瓶为心芽组，接种鳞片的培养瓶为鳞片组，所述启动培养基为：MS+6-BA1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8；①心芽组置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10h/d，培养14～16d至心芽长大为无根植株，且无根植株的基部分化出幼芽；②鳞片组暗处理14～16d至鳞片伤口处分化出鳞茎芽点，再置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为11h/d，培养28～30d至鳞片分化出幼芽。
(3)增殖培养：
将(2)心芽组中心芽抽生的叶片切成长1.3～1.5cm小块，心芽组中除叶片以外的其余材料和鳞片组中所有材料切成带有3-4个芽体的小块，将前述所有小块转接到增殖培养基中，培养18-20d至有芽苗长到3～4cm，培养条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为12h/d，增殖培养基为：1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8。
(4)生根培养：
于2017年5月22日切取步骤(3)中生长至3cm以上的芽体，接种到生根培养基中，培养15-20d至生根。然后整瓶(不打开瓶盖)移至搭建有遮光率为30％的遮阳网的大棚苗床上炼苗3-5d即得组培苗，大棚内温度18～28℃。所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭粉1g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8，生根培养条件：光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为10h/d；
②将步骤(3)中除(4)①已经切取的3cm以上的芽体外的其余材料切成带有3～4个芽体的小块，且其中的叶片切成长1.3～1.5cm小块，所有这些小块接种到与步骤(3)相同的增殖培养基中增殖扩繁，培养条件与步骤(3)所述的培养条件相同；之后重复步骤(4)①和步骤(4)②直至得到组培苗。
(5)组培苗移栽管理：
将步骤(4)获得的组培苗取出、洗净、杀菌剂消毒后移栽至盛有基质的穴盘中870株，穴盘规格为200穴/盘，所述基质由珍珠岩和草炭按珍珠岩:草炭的体积比为1:2混合而成。
用透明的塑料膜覆盖穴盘保温、保湿并在穴盘上方搭建遮光率为50％的遮阳网，于移栽的第9天揭去塑料膜和遮阳网，于移栽的第20天以后，每周喷施1000ppm平衡型大量水溶肥一次，所述平衡型大量水溶肥以质量分数计含：N 20％、P2O520％、K2O 20％，B0.10％、Cu 0.02％、Fe 0.80％、Mn 0.25％、Mo 0.020％、Zn 0.08％。所述平衡型大量水溶肥按常规方法制备：按其配方成分含量比例称取尿素、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、硼酸、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锰、钼酸铵、硫酸锌混合而成。
所述杀菌剂消毒是用混合杀菌剂1000倍液浸泡洗净后的组培苗2min，所述混合杀菌剂由30％恶霉灵水剂6重量份、50％多菌灵可湿性粉剂2重量份和50％福美双可湿性粉剂2重量份混合而成。于2017年7月4日得虎眼万年青穴盘种苗870株，成苗率100％，整个生产周期179天。
实施例2
实施例2除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同。
(1)外植体的选择与处理：
于2018年1月10日将切花虎眼万年青Yellowstar品种的健康种球(无病虫害的种球)15粒在4℃低温条件下放置14-16天至种球长出0.5-1㎝萌芽，2018年1月26日进行外植体采集及灭菌。
(2)无菌系建立与启动培养：
启动培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为6.0；①心芽组置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为12h/d，培养14～16d至心芽长大为无根植株，且无根植株的基部分化出幼芽。
(3)增殖培养：
培养条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10h/d，增殖培养基为：1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为6。
(4)生根培养：
于2018年4月25日切取步骤(3)中生长至3cm以上的芽体，接种到生根培养基中培养15-20d至生根。所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭粉1g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为6，生根培养条件：光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为12h/d。
(5)组培苗移栽管理：
用透明的塑料膜覆盖穴盘保温、保湿并在穴盘上方搭建遮光率为30％的遮阳网。于2018年6月23日得虎眼万年青穴盘种苗1635株，成苗率100％，整个生产周期164天。

Claims (4)

1.一种切花虎眼万年青离体培养快繁方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)外植体的选择与处理：
将选择的切花虎眼万年青目标品种的健康种球在4℃低温条件下放置14～16天至种球长出0.5～1㎝萌芽，清除种球老化的干瘪鳞茎皮露出肥厚部分，用手术刀片沿种球纵向从上到下将种球分割为四瓣，且不划伤心芽，每瓣的底部带有相应的鳞茎基部，剥离出单个完整心芽，并将各瓣剥成单片的鳞片，且各鳞片及心芽的底部均带有相应的鳞茎基部，用清水冲洗鳞片和心芽2-3次，用浓度为0.1％w/w的HgCl2溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次,再用添加有吐温20的2％w/w NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，在无菌操作台上吹干其表面水分；所述添加有吐温20的2％w/w NaClO溶液为在100毫升的2％w/w NaClO溶液中添加2滴吐温20；
(2)无菌系建立与启动培养：
将步骤(1)经过处理的鳞片和心芽分别接种到均盛有启动培养基的不同培养瓶中，接种心芽的培养瓶为心芽组，接种鳞片的培养瓶为鳞片组，所述启动培养基为：MS+6-BA 1～2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0；①心芽组置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，培养14～16d至心芽长大为无根植株，且无根植株的基部分化出幼芽；②鳞片组暗处理14～16d至鳞片伤口处分化出鳞茎芽点，再置于光照条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，培养28～30d至鳞片分化出幼芽；
(3)增殖培养：
将(2)心芽组中心芽抽生的叶片切成长1.3～1.5cm小块，心芽组中除叶片以外的其余材料和鳞片组中所有材料切成带有3-4个芽体的小块，将所有小块转接到增殖培养基中培养18-20d至有芽苗长到3～4cm，增殖培养条件：光照强度为1500～2000lx，温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d，增殖培养基为：1/2MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0；
(4)生根培养：
①切取步骤(3)中生长至3cm以上的芽体，接种到生根培养基，培养15-20d至生根，然后整瓶移至搭建有遮光率为30％的遮阳网的大棚苗床上炼苗3-5d即得组培苗，大棚内温度18～28℃；所述生根培养基为：1/2MS+IBA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭粉1g/L+蔗糖30g/L+琼脂6.25g/L，pH为5.8～6.0，生根培养条件：光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d；
②将步骤(3)中除(4)①已经切取的3cm以上的芽体外的其余材料切成带有3～4个芽体的小块，且其中的叶片切成长1.3～1.5cm小块，所有这些小块接种到与步骤(3)相同的增殖培养基中增殖扩繁培养，培养条件与步骤(3)所述的增殖培养条件相同；之后重复步骤(4)①和步骤(4)②直至得到组培苗；
(5)组培苗移栽管理：
将步骤(4)获得的组培苗取出、洗净、杀菌剂消毒后移栽至盛有基质的穴盘中，用透明的塑料膜覆盖穴盘保温、保湿并在穴盘上方搭建遮光率为30-50％的遮阳网，于移栽的第9天～第11天揭去塑料膜和遮阳网，于移栽的第20天以后，每周喷施1000ppm平衡型大量水溶肥一次，于移栽的第40天～第50天，即得虎眼万年青穴盘种苗；所述平衡型大量水溶肥以质量分数计含：N 20％、P2O520％、K2O 20％，B 0.10％、Cu 0.02％、Fe 0.80％、Mn 0.25％、Mo0.020％、Zn 0.08％。
2.根据权利要求1所述的切花虎眼万年青离体培养快繁方法，其特征在于，步骤(5)中所述的基质为由珍珠岩和草炭按珍珠岩:草炭的体积比为1:2混合而成。
3.根据权利要求1所述的切花虎眼万年青离体培养快繁方法，其特征在于，步骤(5)中所述的穴盘规格为200穴/盘的穴盘。
4.根据权利要求1所述的切花虎眼万年青离体培养快繁方法，其特征在于，步骤(5)中所述的杀菌剂消毒是用混合杀菌剂1000～1200倍液浸泡洗净后的组培苗2～3min，所述混合杀菌剂由30％恶霉灵水剂6重量份、50％多菌灵可湿性粉剂2重量份和50％福美双可湿性粉剂2重量份混合而成。
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