CN109423474A - 培养人类角膜缘干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭露一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：预处理一滋养细胞；将滋养细胞接种于一多孔膜；将多孔膜置入一容器中，使容器分隔为第一培养室以及第二培养室，其中，滋养细胞位于第二培养室；于容器中注入培养基；以及将人类角膜缘干细胞置于第一培养室。相较于习知技术，本发明培养人类角膜缘干细胞的方法利用多孔膜的培养技术培养人类角膜缘干细胞，使人类角膜缘干细胞的扩大率更优于传统培养方式。此外，本发明所使用的培养基不含有具毒性的二甲基亚砜成分，以降低细胞受毒杀的机率。

Description

培养人类角膜缘干细胞的方法
技术领域
本发明关于一种培养人类角膜缘干细胞的方法，并且特别地，关于一种利用多孔膜培养人类角膜缘干细胞的方法。
背景技术
角膜表面的正常与稳定对于保持角膜透明和维持正常的生理功能极为重要，不仅是角膜和结膜之间的堤坝，更是角膜上皮再生的来源。角膜的缺陷主要是由创伤、细菌感染、化学性灼伤与隐形眼镜造成。据统计显示，全球约有1300万人患有影响视力的角膜损伤或疾病，并且每年亦诊断1500至200万件新发病例。角膜的缺陷可能导致一系列眼睛疾病，甚至会导致失明。
角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)的发现是近几十年来眼科学最重要的进展之一。就目前而言，角膜缘干细胞的移植手术是治疗眼表疾病以及重建角膜结构最有效的治疗方式。体外培养角膜缘干细胞培养的标准方法是直接将角膜缘干细胞放置在停滞生长的滋养细胞(Feeder cell)上共同培养。于培养其间，滋养细胞会分泌细胞激素以提供角膜缘干细胞的扩增。然而，角膜缘干细胞随着细胞的扩增形成群落，而将滋养细胞推开，这可能会导致滋养细胞的供应不足。此外，由于培养过程中角膜缘干细胞直接接触滋养细胞，因此在收成角膜缘干细胞的过程中很难将滋养细胞完全清除，造成交叉污染的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：将一滋养细胞与一丝裂霉素C(Mitomycin C)于定温下进行一反应处理，其中丝裂霉素C的浓度范围介于1至25μg/mL之间，反应处理的时间介于2小时至2小时45分钟之间，之后再将丝裂霉素C予以去除；将处理完成的滋养细胞混合一次培养基，并且接种于一多孔膜；将接种有滋养细胞的多孔膜设置于一容器中，以使容器被分隔成一第一培养室以及一第二培养室，其中滋养细胞位于第二培养室；于容器中注入一主培养基以充满第一培养室以及第二培养室；以及，将一人类角膜缘干细胞设置于第一培养室进行细胞培养。
于一具体实施例中，丝裂霉素C浓度为5μg/mL，且该滋养细胞与该丝裂霉素C的该反应处理的时间为2小时15分钟。
于一具体实施例中，多孔膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)材质所构成，且孔径大小为0.4μm。多孔膜允许滋养细胞所释放的细胞激素通过，以滋养人类角膜干细胞扩大，并且同时防止滋养细胞与人类角膜干细胞接触。
于一具体实施例中，主培养基和次培养基为相同成分的培养基，且培养基的基底为达尔伯克氏基础培养基12型(Dulbecco's Minimum Essential Medium/F12,DMEM/F12)。培养基添加成分包含左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)、三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)、胰岛素(Insulin)、转铁蛋白(Transferrin)以及亚硒酸(Selenousacid)，并且二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)含量低于0.1％。
于实际应用上，滋养细胞为小鼠纤维母细胞(Swiss-3T3fibroblast)。
相较于习知技术，本发明培养人类角膜缘干细胞的方法运用一种独特培养基以及培养参数配合多孔膜的培养技术培养人类角膜缘干细胞，使人类角膜缘干细胞的扩大率更优于传统培养方式。此外，本发明所使用的培养基不含有具毒性的二甲基亚砜成分，使细胞受到毒杀的机率降低。
附图说明
图1为本发明的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的步骤流程图。
图2为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的进阶流程图。
图3为本发明的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的进阶流程图。
图4为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的示意图。
图5为接种滋养细胞步骤的一具体实施例的示意图。
图6为多孔膜置入容器步骤的一具体实施例的示意图。
图7为注入培养基步骤的一具体实施例的示意图。
图8为放置人类角膜缘干细胞步骤的一具体实施例的示意图。
图9为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的步骤流程图。
图10为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的示意图。
图11(A)为实验1的二维位图。
图11(B)为实验2的二维位图。
图12为实验1与实验2的人类角膜缘干细胞扩大率。
图13(A)为实验1的细胞群落图。
图13(B)为实验2的细胞群落图。
图14为实验1与实验2的细胞群落分析图。
图15为实验1与实验2的群落尺寸分析图。
其中，附图标记说明如下：
S1：步骤 S2：步骤
S2-2：步骤 S3：步骤
S4：步骤 S5：步骤
S6：步骤 S7：步骤
S12：步骤 S14：步骤
S16：步骤 100：滋养细胞
110：细胞培养瓶 120：小鼠纤维母细胞培养基
200：人类角膜缘干细胞 220：人类角膜缘干细胞培养基
300：多孔膜 310：底面
400：容器 410：第一培养室
420：第二培养室
具体实施方式
为了让本发明的优点，精神与特征可以更容易且明确地了解，后续将以具体实施例并参照所附附图进行详述与讨论。值得注意的是，这些具体实施例仅为本发明代表性的具体实施例，其中所举例的特定方法、装置、条件、材质等并非用以限定本发明或对应的具体实施例。又，图中各装置仅用于表达其相对位置且未按其实际比例绘述，合先叙明。
请参考图1，图1为本发明的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的步骤流程图。本发明提供一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：S1：预处理一滋养细胞；S2：接种滋养细胞于一多孔膜；S3：将多孔膜设置于一容器中；S4：于容器中注入一培养基；以及S5：将一人类角膜缘干细胞设置于容器中进行细胞培养。
请参考图2，图2为预处理滋养细胞步骤的一具体实施例的进阶流程图。于本发明的一具体实施例中，预处理滋养细胞S1的步骤又进一步包含以下步骤：S12：在滋养细胞中添加包含有丝裂霉素C的培养基；S14：于培养箱中进行反应；S16：去除包含有丝裂霉素C的培养基。
请参考图3，图3为本发明的培养人类角膜缘干细胞的方法的一具体实施例的进阶流程图。于步骤S5后约经过3至5天，执行步骤S6：抽除培养基；以及步骤S7：细胞继代。
以下将以附图说明步骤S1-S5的操作流程。
请参考图1、图2以及图4，图4为预处理滋养细胞步骤S1的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，本发明使用小鼠纤维母细胞(Swiss-3T3fibroblast)作为滋养细胞100，并且将滋养细胞100放入细胞培养瓶(T75Flask)110中。在细胞培养瓶110中注入添加有浓度1至25μg/mL丝裂霉素C(Mitomycin C)的小鼠纤维母细胞培养基120，其中，丝裂霉素C较佳的添加浓度为5μg/mL。之后，将细胞培养瓶110放入37℃定温的培养箱中反应2小时至2小时45分钟，其中，较佳的反应时间为2小时15分钟。反应完成后，抽出细胞培养瓶110中的小鼠纤维母细胞培养基120(含有丝裂霉素C)，并且以1倍的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)清洗滋养细胞100。将清洗完成的滋养细胞100放入离心机中以300g离心3分钟，以完成滋养细胞100的预处理流程。此预处理步骤S1目的在于抑制滋养细胞100的分裂扩大同时又保有正常细胞生理代谢，使滋养细胞100与人类角膜缘干细胞共同培养的过程中，滋养细胞100能正常提供细胞激素给人类角膜干细胞，又不至于抢夺培养基中的养分。
请参考图1以及图5，图5为接种滋养细胞步骤S2的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，将预处理完成的滋养细胞100混合人类角膜缘干细胞培养基220(次培养基)。之后，将含有滋养细胞100的人类角膜缘干细胞培养基220接种于多孔膜(transwell)300的底面310，其中，滋养细胞100较佳的接种密度为2×104cells/cm2。接着，等待一段时间(约2.5-4hr)确认滋养细胞100完全接种于多孔膜300的底面310后，即完成步骤S2。
如图5所示，多孔膜300外型类似具有帽沿的帽子，主要由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)材质所构成。多孔膜300的底面310具有均匀分布的小孔。本发明中所使用的多孔膜300选用的孔径大小为0.4μm。这样的孔径大小允许细胞激素通过，同时又能阻挡细胞穿越。
请参考图1以及图6，图6为多孔膜置入容器步骤S3的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，将接种有滋养细胞100的多孔膜300翻转后置入容器400中，使多孔膜300的边缘卡合于容器400的边缘，其中，容器400为6孔的培养孔盘(6-well plates)的孔洞。如图6所示，容器400被多孔膜300分隔为第一培养室410以及第二培养室420，其中，滋养细胞100位于第二培养室中且贴合多孔膜300的底面310。
请参考图1以及图7，图7为注入培养基步骤S4的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，将人类角膜缘干细胞培养基220(主培养基)注入容器400中，以充满第一培养室410以及第二培养室420。值得注意的是，此步骤S4使用的主培养基与步骤S2时使用的次培养基同样为人类角膜缘干细胞培养基220，因此步骤S2接种完成滋养细胞100后可以不必将培养基抽除，以保留最完整的养分。
于实际应用上，本发明所使用的人类角膜缘干细胞培养基220以达尔伯克氏基础培养基12型(Dulbecco's Minimum Essential Medium/F12,DMEM/F12)为基底，并且添加成分包含人类表皮生长因子(Human epidermal growth factor)20ng/mL、皮质醇(Hydrocortisone)0.5μg/mL、胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)5％、左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)4mM、三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)2nM、胰岛素(Insulin)5μg/mL、转铁蛋白(Transferrin)5μg/mL、亚硒酸(Selenous acid)5ng/mL、青霉素(Penicillin)100μg/mL、链霉素(Streptomycin)100U/mL、庆大霉素(Gentamicin)50μg/mL、以及两性霉素(Amphotericin B)1.25μg/mL。值得注意的是，习知的培养基中经常使用到的成分二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)于本发明的培养基中含量低于0.1％。少量的二甲基亚砜虽可以促进细胞分化，但由于此物质具有毒性，故亦会抑制细胞的增生，而过量的二甲基亚砜甚至会毒杀细胞。因此，本发明所使用的人类角膜缘干细胞培养基220将此成分去除，以降低细胞被毒杀的风险。
请参考图1以及图8，图8为放置人类角膜缘干细胞步骤S5的一具体实施例的示意图。于一具体实施例中，于充满人类角膜缘干细胞培养基220的第一培养室410中放入人类角膜缘干细胞(Limbal Stem Cells,LSCs)200。滋养细胞100于人类角膜缘干细胞培养基220中分泌细胞激素，并且透过多孔膜300的底面310将细胞激素传递给人类角膜缘干细胞200。同时，多孔膜300又可以将滋养细胞100与人类角膜缘干细胞200隔开避免直接接触造成污染。
请再参考图3，于步骤S5共同培养一段时间后(约3至5天)，滋养细胞100会逐渐死亡，人类角膜缘干细胞培养基220中的养分会减少，而人类角膜缘干细胞200则会有明显的扩大。此时，执行步骤S6：将人类角膜缘干细胞培养基220连同滋养细胞100一起抽除，并且使用1倍的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS)清洗人类角膜缘干细胞200。接着，步骤S7：在人类角膜缘干细胞200中添加胰蛋白酶(Trypsin/EDTA)放入培养箱中反应8分钟，使扩大的人类角膜缘干细胞200被分割，之后进行继代。其中，继代的过程为将分割的人类角膜缘干细胞200重新分盘，并且注入新的人类角膜缘干细胞培养基220以及预处理过的滋养细胞100(重复步骤S1-S5)，使人类角膜缘干细胞200持续扩大。
利用本发明的培养方式以及参数设定所培养出的人类角膜缘干细胞200扩大率较优于传统培养方式，将利用以下实验说明。
实验1：以本发明的培养方式培养人类角膜缘干细胞。使用上述实施例中步骤S1-S7的实验方法及较佳参数培养人类角膜缘干细胞200。
实验2：以传统培养方式培养人类角膜缘干细胞。请参考图9以及图10，图9为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的步骤流程图，图10为一具体实施例的传统培养人类角膜缘干细胞方式的示意图。于一具体实施例中，以传统培养人类角膜缘干细胞的方式当作实验的对照组，其包含步骤S1：预处理一滋养细胞100；步骤S2-2：将滋养细胞100置入容器400；步骤S4：于容器400中注入人类角膜缘干细胞培养基220；步骤S5：放置人类角膜缘干细胞200于人类角膜缘干细胞培养基220中；将人类角膜缘干细胞200与滋养细胞100共同培养约3-5天后，执行步骤S6：抽除原本的人类角膜缘干细胞培养基220以及滋养细胞100；以及步骤S7：细胞继代，将人类角膜缘干细胞200分盘后重新换上新的人类角膜缘干细胞培养基220以及滋养细胞100。传统培养人类角膜缘干细胞方式的示意图如图10所示，与本发明的培养方式差别在于传统培养方式将人类角膜缘干细胞200直接置于滋养细胞100上，这样的培养方式可能会造成人类角膜缘干细胞200污染机率增加，且具有不易分离人类角膜缘干细胞200及滋养细胞100的缺点。其中，本实施例中所使用的培养基成分以及预处理参数皆与实验1相同。
验证1：比较实验1与实验2的干细胞检测比例。请参考图11(A)及图11(B)，图11(A)为实验1的二维位图，图11(B)为实验2的二维位图。于本验证中，使用流式细胞仪检测实验1及实验2的人类角膜缘干细胞培养7天后所得到的干细胞比例。其中，检测的表面标记(Surface Marker)以蛋白质P63的表现量作为正指标，以蛋白质Cx43的表现量作为负指标，亦即代表细胞中蛋白质P63数量越多且蛋白质Cx43数量越少，则干细胞特征越明显。将所得到的人类角膜缘干细胞进行双染，图11(A)及图11(B)中横轴为观察蛋白质Cx43表现量的荧光染剂APC-A，纵轴为观察蛋白质P63表现量的荧光染剂FITC-A。图11(A)及图11(B)中每一个点即代表一个细胞，当细胞分布位置越接近图中Q1象限时，则代表干细胞特征越明显。由11(A)及图11(B)中可以看出，实验1在Q1象限的干细胞比例为95.1％，而实验2在Q1象限的干细胞为98.4％，两者的干细胞比例无明显差异。
验证2：比较实验1与实验2的干细胞扩大率。请参考图12，图12为实验1与实验2的人类角膜缘干细胞扩大率。扩大率(expansion rate)定义为细胞成长数量除以细胞原始数量。图12为人类角膜缘干细胞培养7天后实验1以及实验2的扩大率图表。由图12中可知，实验2的人类角膜缘干细胞扩大率为4.99倍，而实验1的细胞扩大率为18.3倍，扩大率明显优于传统培养方式。
验证3：比较实验1与实验2的细胞群落特性。请参考图13(A)、图13(B)、图14以及图15。图13(A)为实验1的细胞群落图，图13(B)为实验2的细胞群落图，图14为实验1与实验2的细胞群落分析图，图15为实验1与实验2的群落尺寸分析图。细胞群落形成(ColonyFormation)可以反映出细胞分裂的能力，形成的群落越多，表示具有分裂能力的前驱细胞越多。干细胞具形成群落的特性，故可以群落分析实验作为判断干细胞特性的指标之一。由图13(A)及图13(B)中可以约略看出，实验1的细胞群落特性较实验2明显。将图13(A)及图13(B)的实验结果在显微镜下进行影像分析，得到实际的图形化数据如图14以及图15。图14中显示，实验1的细胞群落生成率为12.3％，高于实验2的8.3％。进而比较每一个形成群落的大小，图15中显示，实验1的细胞群落尺寸为1.3mm，亦高于实验2的1.2mm。
相较于习知技术，本发明培养人类角膜缘干细胞的方法运用一种独特培养基以及培养参数配合多孔膜的培养技术培养人类角膜缘干细胞。由上述实验以及验证可得知，本发明不论是细胞扩大率或是细胞群落特性皆明显优于传统培养方式。此外，本发明所使用的培养基不含有具毒性的二甲基亚砜成分，使细胞受到污染机率降低。
藉由以上较佳具体实施例的详述，希望能更加清楚描述本发明的特征与精神，而并非以上述所揭露的较佳具体实施例来对本发明的范畴加以限制。相反地，其目的是希望能涵盖各种改变及具相等性的安排于本发明所欲申请的权利要求的范畴内。

Claims (10)

1.一种培养人类角膜缘干细胞的方法，其步骤包含：
将一滋养细胞与一丝裂霉素C(Mitomycin C)于定温下进行一反应处理，其中该丝裂霉素C的浓度范围介于1至25μg/mL之间，该反应处理的时间介于2小时至2小时45分钟之间，之后再将该丝裂霉素C予以去除；
将处理完成的该滋养细胞混合一次培养基，并且接种于一多孔膜；
将接种有该滋养细胞的该多孔膜设置于一容器中，以使该容器被分隔成一第一培养室以及一第二培养室，其中该滋养细胞位于该第二培养室；
于该容器中注入一主培养基以充满该第一培养室以及该第二培养室；以及
将一人类角膜缘干细胞设置于该第一培养室。
2.如权利要求1所述的方法，其中该丝裂霉素C浓度为5μg/mL，且该滋养细胞与该丝裂霉素C的该反应处理的时间为2小时15分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其中该滋养细胞于该培养基中释放一细胞激素，该多孔膜允许该细胞激素传递于该第一培养室以及该第二培养室之间，并且防止该滋养细胞以及该人类角膜缘干细胞传递。
4.如权利要求1所述的方法，其中该多孔膜由聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethyleneterephthalate,PET)材质所构成，且该多孔膜的孔径大小为0.4μm。
5.如权利要求1所述的方法，其中该主培养基以及该次培养基为相同成分的一培养基。
6.如权利要求5所述的方法，其中该培养基包含左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)、三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)、胰岛素(Insulin)、转铁蛋白(Transferrin)以及亚硒酸(Selenous acid)，且二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)含量低于0.1％。
7.如权利要求6所述的方法，其中该左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)于该培养基中的浓度为4mM、该三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)于该培养基中的浓度为2nM、该胰岛素(Insulin)于该培养基中的浓度为5μg/mL、该转铁蛋白(Transferrin)于该培养基中的浓度为5μg/mL、该亚硒酸(Selenous acid)于该培养基中的浓度为5ng/mL。
8.如权利要求7所述的方法，其中该培养基包含达尔伯克氏基础培养基12型(Dulbecco's Minimum Essential Medium/F12,DMEM/F12)。
9.如权利要求1所述的方法，其中该滋养细胞以每平方公分2×104个细胞的密度接种于该多孔膜。
10.如权利要求1所述的方法，其中该滋养细胞为小鼠纤维母细胞(Swiss-3T3fibroblast)。
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