CN109415707A - 使用官能化色谱介质回收病毒产品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。

Description

使用官能化色谱介质回收病毒产品的方法

发明领域

本发明涉及从包含病毒产品(通常是装填的病毒媒介)和产品相关杂质(通常是未装填的病毒)二者的组合物回收病毒产品的方法。所述方法包括使组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触。

介绍

生物技术市场是全球药物市场内增长最快的行业，占2012年所有市场销售额的20%(1530亿美元)。从2002年10%的市场份额起的这一增长在2012年至2018年间估计增长41%，从1530亿美元到2150亿美元。

一个代表未来很大增长潜力的领域是基因治疗。这种治疗方法有可能纠正遗传性基因缺陷，或者离体或体内操纵细胞来处理疾病例如癌症(Davila等人，2014)、血友病(Nathwani等人，2014)和帕金森病(Kaplitt等人)。

在基因治疗方法中，将目标基因递送到细胞中需要使用媒介。正为临床应用而开发的许多这种媒介衍生自重组病毒，例如腺病毒(Adv)、腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)。媒介在基因治疗中的目的是将核酸序列(DNA或RNA)递送到细胞，其中它通过细胞的生化机构受到处理以改变细胞的性质，产生期望的治疗效果。

媒介材料通常由已被改性以产生媒介的组成部分(例如其包衣或衣壳)的细胞系和打算递送到细胞的核酸材料产生。在媒介产生过程期间，需要将核酸序列掺入媒介中以形成“装填”或“满的”媒介。“活性”或“感染性”媒介是“装填”媒介，其可以成功感染靶细胞，导致核酸序列的表达。在典型的媒介产生过程中也产生本质上不含核酸材料的“空的”或“未装填”媒介。因此，在媒介产生过程期间，产生含有上述变体的混合物的混合群体。

将装填的媒介与空的媒介分离通常通过使用密度梯度离心在实验室规模进行，例如利用密度差异进行分离的CsCl梯度(Vellekamp等人，2001)或碘克沙醇梯度(MartinLock等人，2010)。然而，对于用于处理大型患者群体的工业规模纯化，这种方法是不合适的，因为它们在按比例放大时造成实施挑战。因此，已经应用某些色谱分离方法，因为它们固有地更可升级。

为了将满的AAV媒介与空的媒介分离，许多市售可得的基于多孔珠的系统已经用于离子交换分离(Urabe等人, 2006) (Qu等人, 2007)。使用具有阴离子交换功能性的整料也报道类似的分离(M. Lock, Alvira, & Wilson, 2012)。此外(Lee, Kim, & Seol,2009)报道使用金属亲和膜可以将感染性AdV材料与有缺陷的AdV颗粒分离。

然而，使用这些已知的吸附材料进行色谱分离、包括将装填的病毒媒介与未装填的媒介分离存在缺点。因此，虽然常规的多孔珠具有高容量，但不可能以高流速操作包含这种珠的填充床系统。这是因为在基于多孔珠的系统中，靶分子/杂质和固相之间的结合事件取决于向多孔珠中的扩散，意味着结合容量随着停留时间的减少而下降。高流速也与其中许多升的珠悬浮液被装填到柱中的制造规模下的多孔珠特别不相容。这里，多孔珠的机械不稳定性可导致压缩或坍塌事件，这继而导致不均匀的柱床。

多孔珠的典型结合容量在35-120mg/mL附近，取决于固相的功能性和结合的物类。然而，通过这种系统的低典型流速意味着可以实现仅约10-120mg/mL/min的单柱多孔珠系统的总生产率。

使用多孔珠的另一个缺点是材料的容量取决于靶进入珠的内表面区域的能力。典型的多孔珠的孔径在15-30nm之间，且因此在媒介纯化中存在局限，其中靶媒介可以比孔径大得多，例如为AAV(~20nm)、AdV(~80nm)和LV(~100nm)。

涉及膜和整料的分离可以在比基于多孔珠的系统高得多的流速下进行，典型的停留时间为约0.2-0.5分钟级。然而，在动态流动下，靶的10%穿透的典型结合容量对于整料(10-20mg/mL)和膜(7.5-29mg/mL)低于多孔珠(Gottschalk, U. 2008 Biotechnol Prog,24(3), 496-503. doi: 10.1021/bp070452g)。整料和膜材料的较差结合容量(与基于多孔珠的材料相比)可以通过利用更高的流速在一定程度上弥补。上面讨论的整料和膜的典型结合容量和停留时间导致整料和膜系统的结合事件的总生产率为约10-145mg/mL/min。

另外，虽然膜的孔径远大于多孔珠，在0.2-2μm的范围内，但是膜的结合容量随着吸附物类的尺寸增加而降低(Wickramasinghe, Carlson, Teske, Hubbuch, & Ulbricht,2006)。这强调需要高度多孔吸附剂与高可及表面积二者。

对能够将装填的与未装填的媒介分离的色谱材料存在需要，以使得能够以工业规模回收治疗产品。色谱材料还应共享与基于多孔珠的材料相关的高结合容量和用整料/膜材料可实现的较高流速。色谱材料还必须是足够多孔的，因此大媒介可到达结合区域，从而可以获得适当高的流速。这种材料可在高流速下提供高容量，以实现最大生产率(纯化的产品/mL/min)。

本发明人意料不到地发现，聚合物纤维材料，尤其是聚合物纳米纤维材料，可用于将装填的与未装填的媒介材料分离。因此，他们发现这种材料在非常短的停留时间即高流速下对媒介材料具有高容量。这表示与其他吸附剂例如珠、膜和整料相比，该材料具有有利的高生产率。本发明人还优化了聚合物纤维材料的聚合物接枝和随后的官能化的程度，以改善装填和未装填物类的拆分。还意料不到地发现，使用根据本发明的材料，装填和未装填的级分二者都可以在非常低的盐浓度下洗脱(洗脱电导率<6mS)。这与文献中的实例形成对比，在文献中级分不被洗脱直到电导率达到~12.5mS(Urabe等人, 2006)。

发明概述

因此，本发明提供从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，

其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且

其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。

本发明还提供：

·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与不耐盐的色谱介质接触，其中所述不耐盐的色谱介质能够以小于10mS/cm的电导率洗脱病毒产品。

·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包括一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料(frit)或其他隔离材料的保持器，

其中将所述组合物通过保持器使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。

·一种从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包括一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器，

其中所述组合物与色谱介质接触一分钟或更少的时间段。

·从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和非产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，

其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且

其中所述非产品相关杂质包括细胞和/或细胞组分，例如脂质，宿主细胞蛋白和/或宿主细胞生长培养基的其他组成部分，例如蛋白质和/或糖。

·从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含如本文限定的所述产品、产品相关杂质和非产品相关杂质，所述方法包括使组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触。

·通过本发明的方法可获得或获得的病毒产品。

·通过本发明的方法可获得或获得的产品相关杂质。

·一种包含本发明的病毒产品联合药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。

·一种包含本发明的产品相关杂质联合药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。

·一种微生物处理、接种或基因治疗的方法，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的本发明的病毒产品或本发明的组合物。

·用于微生物处理、接种或基因治疗的方法的本发明的病毒产品或本发明的组合物。

·一种将多核苷酸插入细胞中的离体方法，所述方法包括使细胞与本发明的病毒产品接触。

·通过本发明的离体方法获得或可获得的细胞。

·一种处理方法，包括向需要其的患者施用一种或多种本发明的细胞。

·用于通过治疗来处理人体或动物体的方法的本发明的细胞。

·用于处理癌症的本发明的细胞。

附图简述

图1显示对于许多不同官能化色谱材料的BSA的DBC(动态结合容量)。

图2显示低电荷密度与高电荷密度材料的比较，其中材料未接枝

图3显示低电荷密度与高电荷密度材料的比较，其中材料已接枝

图4显示均具有高电荷密度的接枝和未接枝材料的比较

图5显示对于AdV媒介和对于BSA的材料的容量

图6显示AAV材料的色谱图

图7显示AAV衣壳蛋白的Western印迹

图8显示从AAV分离收集的级分的PCR结果

图9显示比较CsCl装填材料和由本发明的色谱分离获得的装填材料的色谱图

图10提供CsCl材料和由本发明的色谱分离获得的材料的进一步比较。

发明详述

本发明是从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触。

在另一个实施方案中，本发明是从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和非产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触。

病毒产品

病毒产品通常包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸。因此，通常，病毒产品是“装填的”或“满的”病毒产品，即“装填的”或“满的”病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒。技术人员非常了解“装填的”或“满的”病毒和相关病毒产品的概念。

通常，病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都能够感染细胞。因此，通常，病毒产品是可以成功感染靶细胞的“活性”或“感染性”病毒产品。技术人员非常了解“活性”或“感染性”病毒和相关病毒产品的概念。

通常，病毒产品包含许多病毒媒介，每一种含有一种或多种转基因多核苷酸。因此，本发明的方法通常是从组合物回收一种或多种病毒媒介的方法，所述组合物包含所述病毒媒介和如本文限定的产品相关杂质。

一种或多种病毒媒介各自通常含有一种或多种转基因多核苷酸或转基因。应理解，术语“转基因多核苷酸”或“转基因”在本文中用于表示对病毒不是天然的多核苷酸。

优选地，病毒产品包含一种或多种病毒。原则上可以使用任何病毒。对于用于基因治疗的病毒媒介，病毒通常是重组基因工程病毒。重组病毒通常含有转基因。这种转基因可以例如编码生物功能蛋白质或肽、反义分子或标记分子。对于用于“病毒治疗”的病毒媒介，病毒可以是野生型裂解病毒或基因改性形式，包括有条件复制的形式，其已经被设计用于改变病毒活性的转基因(例如，编码旨在增强病毒通过实体肿瘤传播的蛋白质的转基因)或改善抗癌活性的转基因(例如编码免疫刺激蛋白或GDEPT蛋白的转基因) “武装”，且还包括工程化以编码其他病毒并在感染时产生它们的病毒。对于用于病毒接种的病毒媒介，病毒通常是基因改性的腺病毒(包括非人腺病毒)，疱疹病毒或作为抗原的痘苗病毒编码转基因。

在所有情况下，病毒是RNA或DNA病毒，且任选来自以下科和组之一：腺病毒科；苜蓿花叶病毒组( Alfamoviruses)；雀麦花叶病毒科；α潜隐病毒属(Alphacryptoviruses)；分体病毒科：杆状病毒科；杆状DNA 病毒属(Badnaviruses)；β潜隐病毒属(Betacryptoviruses)；分体病毒科；Bigeminiviruses；联体病毒科；双核糖核酸病毒科；雀麦花叶病毒(Bromoviruses)；雀麦花叶病毒科；大麦黄花叶病毒(Bymoviruses)；马铃薯Y病毒科；布尼亚病毒科；杯状病毒科；毛状病毒组；香石竹潜病毒组；香石竹斑驳病毒组；花椰菜病毒组；线形病毒组；鸭跖草黄斑病毒组；豇豆花叶病毒组；冠状病毒科；PM2噬菌体组；覆盖嗟菌体科(Corcicoviridae)；隐秘病毒组；隐病毒组；黄瓜病毒Φ6噬菌体组；囊状噬菌科；质型弹状病毒(Cytorhabdoviruses)；弹状病毒科；香石竹环斑组；香石竹病毒组；蚕豆枯萎病组；耳突花叶病毒(Enamoviruses)；蚕豆病毒组；Fijiviruses；呼肠孤病毒科；丝状病毒科；黄病毒科；真菌传棒状病毒组；双粒病毒组；贾第虫病毒组；嗜肝病毒科；疱疹病毒科；大麦病毒组；杂双粒病毒 (Hybrigeminiviruses)；联体病毒科；悬钩子病毒(Idaeoviruses)；环斑病毒组；丝杆噬菌体科；甘薯病毒(Ipomoviruses)；虹彩病毒科(Iriodoviridae)；光滑病毒科；脂毛噬菌体科；黄矮病毒组； 玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomoviruses)；柘橙病毒(Macluraviruses)；马拉菲病毒组；玉米褪绿矮病毒组；Icroviridae；单双粒病毒 (Monogeminiviruses)：联体病毒科；肌尾噬菌体科；矮缩病毒(Nanaviruses)；坏死病毒组；蠕传病毒组；野田病毒科；核型弹状病毒属(Nucleorhabdoviruses)：弹状病毒科；正粘病毒科；水稻病毒属(Oryzaviruses)：呼肠孤病毒科；甜瓜病毒属(Ourmiaviruses)；乳多空病毒科；副粘病毒科；欧洲防风草黄斑病毒组；分体病毒科；包括腺相关病毒的细小病毒科；豌豆花叶病毒组；藻类去氧核糖核酸病毒科；植物呼肠孤病毒(Phytoreoviruses)：呼肠孤病毒科；小核糖核酸病毒科；芽生噬菌体科(Plasmarviridae)；短尾噬菌体科；多去氧核糖核酸病毒科(Polydnaviridae)；马铃薯x病毒组；马铃薯Y病毒；痘病毒科；呼肠孤病毒科；逆转录病毒科；弹状病毒科；根前毛菌病毒组；黑麦草镶嵌病毒属(Rymoviruses)：马铃薯Y病毒科；卫星RNA；卫星病毒(Satelliviruses)；伴生病毒属(Sequiviruses)：伴生病毒科(Sequiviridae)；南方菜豆花叶病毒属(Sobemoviruses)；长尾噬菌体科；南方菜豆花叶病毒组；SSVI型噬菌体；Tectirividae；纤细病毒科；Tetravirirdae；烟草花叶病毒组；烟草脆裂病毒组；披膜病毒科；番茄丛矮病毒组；番茄斑萎病毒属(Tospoviruses)：布尼亚病毒科；环曲病毒组；整体病毒科；芜菁黄花叶病毒(Tymoviruses)；芜菁黄花叶病毒组；植物病毒卫星；幽影病毒(Umbraviruses)；未分配的马铃薯Y病毒：马铃薯Y病毒科(Potyviridae)：未分配的弹状病毒：弹状病毒科；巨脉病毒属(Varicosaviruses)；水稻矮化病毒属(Waikaviruses)： 伴生病毒科(Sequiviridae)；未分组的病毒。

优选地，病毒选自：腺病毒科，包括腺相关病毒的细小病毒科，和逆转录病毒科。

用于本发明的特别优选的病毒是腺病毒、腺相关病毒或慢病毒。特别优选腺病毒和腺相关病毒，且更优选腺相关病毒。

在一些实施方案中，可以使用病毒的组分，例如病毒核心或原病毒(来自例如痘病毒)。然而，优选使用病毒或病毒颗粒/病毒粒子。

技术人员非常了解术语“多核苷酸”的含义。这种多核苷酸包括合成分子，例如siRNA分子，以及DNA或RNA。

为避免疑义，“多核苷酸”是由通过许多已知的核苷间键中的任何键彼此偶联的多个连接的单个核苷单元形成的多核苷。这种核苷间键包括但不限于天然核苷间磷酸二酯键或实际上改性的核苷间键，例如但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧碳酰(carboalkoxy)、乙酰胺酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷(borano)、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基膦酸酯、桥连硫代磷酸酯和砜核苷间键。术语“多核苷酸”还包括具有一个或多个立体特异性核苷间键(例如，(Rp)-或(Sp)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯键) 的多核苷。本文所用术语“多核苷酸”明确地旨在包括具有任何这种核苷间键的多核苷，无论该键是否包含磷酸酯基团。在某些优选的实施方案中，这些核苷间键可以是磷酸二酯键、硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键，或其组合。

术语“多核苷酸”还包括具有另外的取代基的多核苷，所述取代基包括但不限于蛋白质基团、亲脂基团、插入剂、二胺、叶酸、胆固醇和金刚烷。术语“多核苷酸”还包括任何其他含核碱基的聚合物，包括但不限于肽核酸(PNA)，具有磷酸酯基团的肽核酸(PHONA)，锁核酸(LNA)，吗啉代主链寡核苷酸和具有带烷基连接基或氨基连接基的主链部分的寡核苷酸。烷基连接基可以是支化的或非支化的、被取代或未被取代的、和手性纯的或外消旋混合物。

多核苷酸可包括天然存在的核苷、改性的核苷或其混合物。如本文所用，术语“改性的核苷”是包含改性的杂环碱基、改性的糖部分或其组合的核苷。在一些实施方案中，改性的核苷是非天然的嘧啶或嘌呤核苷，如本文所述。在一些实施方案中，改性的核苷是2'-取代的核糖核苷、阿拉伯糖核苷或2'-脱氧-2'-取代的阿拉伯糖苷。

如本文所用，术语“杂合多核苷酸”是具有多于一种类型核苷的多核苷酸。

本文中，术语“多核苷酸”包括杂合和嵌合多核苷酸。“嵌合多核苷酸”是在其序列结构内具有多于一种类型核苷间键的多核苷酸。这种嵌合多核苷酸的一个优选实例是嵌合寡核苷酸，其包含硫代磷酸酯、磷酸二酯或二硫代磷酸酯区域和非离子键如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯键(US5635377和US5366878)。

本文中，术语“多核苷酸”还包括环化变体和环状多核苷酸。

优选地，多核苷酸包含至少一种天然存在的磷酸二酯，或一种改性的硫代磷酸酯，或二硫代磷酸酯核苷间键，然而还设想优选的键或实际的主链改性，包括但不限于甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前药、砜、磺酰胺、氨基磺酸酯、甲缩醛(formacetal)、N-甲基羟胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、吗啉代、硼烷膦酸酯、氨基磷酸酯(尤其是伯氨基-氨基磷酸酯、N3氨基磷酸酯和N5氨基磷酸酯)和立体特异性键(例如，(Rp)-或(Sp)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯键)。

核苷的糖部分可以是非天然存在的糖部分。本文中，“天然存在的糖部分”是作为核酸的一部分天然存在的糖部分，例如核糖和2'-脱氧核糖，且“非天然存在的糖部分”是不作为核酸的一部分天然存在，但可以用于多核苷酸的主链中的任何糖，例如但不限于己糖。阿拉伯糖和阿拉伯糖衍生物是优选的糖部分的实例。

改性或取代的多核苷酸通常比天然形式优选，这是因为合乎需要的性质，例如增强的细胞摄取、对核酸靶的增强的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。

如本文所用，“多核苷酸”是指“寡核苷酸”(长度为18-25个核苷酸的多核苷酸分子)和26或更多个核苷酸的多核苷酸二者。通常，26或更多个核苷酸的多核苷酸可具有100或更多，500或更多或甚至1000或更多个核苷酸。通常，多核苷酸一般具有少于10,000个核苷酸，例如少于5,000个核苷酸。具有1000至10,000个核苷酸的多核苷酸可能是优选的。

在其中病毒是腺相关病毒(AAV)的情况下，多核苷酸通常具有至多5000个核苷酸。

在其中病毒是腺病毒(AV)的情况下，多核苷酸通常具有至多8000个核苷酸。

在其中病毒是慢病毒的情况下，多核苷酸通常具有至多10,000个核苷酸。

产品相关杂质

产品相关杂质通常包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。因此，通常，产品相关杂质是“未装填的”或“空的”病毒产品，即“未装填的”或“空的”病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒。技术人员非常了解“未装填的”或“空的”病毒和相关产品的概念。

产品相关杂质可另外包含多核苷酸，不包含在病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心或原病毒内，而是以游离形式包含。

通常，产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都不能感染细胞。因此，通常，产品相关杂质是不能感染细胞的“无活性”或“非感染性”产品。技术人员非常了解“无活性”或“非感染性”病毒和相关病毒产品的概念。在一些实施方案中，产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心或原病毒，其可以包含或可以不包含多核苷酸，但在任何情况下都不能感染细胞。在这种实施方案中，多核苷酸材料可以例如不完全装填在病毒或病毒产品内，表示产品不能感染细胞。

通常，产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心或原病毒，其每一种都缺乏完整的病毒基因组。

通常，产品相关杂质包括一种或多种上文限定的特定病毒或病毒组分(任选地还有游离多核苷酸)，条件是那些病毒或病毒组分具有也在上文提及的产品相关杂质的一种或多种特征，即

· 实质上不含多核苷酸；

· 未装填；

· 是空的；

· 无法感染细胞；

· 无活性；

· 是非感染性的；和/或

· 缺乏完整病毒基因组。

因此，优选地，产品相关杂质包含多种腺病毒、腺相关病毒或慢病毒，条件是它们具有上述产品相关杂质的一种或多种特征。特别优选腺病毒和腺相关病毒，且更优选腺相关病毒。

非产品相关杂质

非产品相关杂质通常包含细胞或细胞组分，例如脂质，宿主细胞蛋白和/或宿主细胞生长培养基的其他组成部分，例如蛋白质、糖等。

因此，通常，非产品相关杂质包括细胞。或者，非产品相关杂质包括细胞组分例如脂质，宿主细胞蛋白，和/或宿主细胞生长培养基的其他组成部分，例如蛋白质和/或糖。

为避免疑义，非产品相关杂质是本领域技术人员熟知的。

聚合物纤维

官能化色谱介质包含一种或多种聚合物纳米纤维，且通常由所述一种或多种聚合物纳米纤维形成。在本文中提及“纳米纤维”的情况下，这些应理解为下文限定的聚合物纳米纤维。

通常，聚合物纳米纤维是一个或多个非织造片的形式，每个片包含一种或多种所述聚合物纳米纤维。包含一种或多种聚合物纳米纤维的非织造片是所述一种或多种聚合物纳米纤维的垫，其中每根纤维本质上随机取向，即它尚未制造成使得纤维采用特定图案。包含聚合物纳米纤维的非织造片通常通过已知方法提供。在某些情况下，非织造片可由单一聚合物纳米纤维组成。或者，非织造片可包含两种或更多种聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种聚合物纳米纤维。

聚合物纳米纤维可以是电纺聚合物纳米纤维。这种电纺聚合物纳米纤维是本领域技术人员熟知的。也可以使用用于产生聚合物纳米纤维的备选方法，例如拉制。

用于本发明的聚合物纳米纤维通常具有10nm至1000nm的平均直径。对于一些应用，平均直径为200nm至800nm的聚合物纳米纤维是合适的。平均直径为200nm至400nm的聚合物纳米纤维可适用于某些应用。

用于本发明的聚合物纳米纤维的长度没有特别限制。因此，常规方法例如静电纺丝可以产生数百米或甚至数千米长的聚合物纳米纤维。然而，通常，一种或多种聚合物纳米纤维的长度最高达10km，优选10m至10km。

非织造片通常具有1至40g/m²，优选5至25g/m²，在一些情况下1至20或5至15g/m²的面积密度。

非织造片通常具有5至120μm，优选10至100μm，在某些情况下为50至90μm，在其他情况下为5至40、10至30或15至25μm的厚度。

用于产生本发明的方法中使用的纳米纤维的聚合物没有特别限制，条件是该聚合物适用于色谱应用。因此，通常，聚合物是适合用作色谱方法中的色谱介质、即吸附剂的聚合物。合适的聚合物包括：聚酰胺如尼龙，聚丙烯酸，聚甲基丙烯酸，聚丙烯腈，聚苯乙烯，聚砜例如聚醚砜(PES)，聚己内酯，胶原，壳聚糖，聚环氧乙烷，琼脂糖，乙酸琼脂糖，纤维素，乙酸纤维素，及其组合。聚醚砜(PES)、纤维素和乙酸纤维素是优选的。在某些情况下，优选纤维素和乙酸纤维素。

在一些实施方案中，官能化色谱介质包含由不同聚合物形成的一种或多种纳米纤维。因此，在该实施方案中，官能化色谱介质包含一种或多种不同的聚合物。典型的聚合物如上限定。

通常，官能化色谱介质是官能化纤维素色谱介质。优选地，官能化色谱介质由一个或多个非织造片形成，每个片包含一种或多种纤维素或乙酸纤维素纳米纤维。乙酸纤维素易于形成纳米纤维，例如通过静电纺丝，且在静电纺丝后可以很容易地转化成纤维素。

尽管在特别优选的实施方案中，官能化色谱介质包含一种或多种聚合物纳米纤维，在备选实施方案中，官能化色谱介质可包含一种或多种任何类型的聚合物纤维。这样的聚合物纤维可具有与上述纳米纤维相同的性质中的任何或全部。通常，这样的聚合物纤维的平均直径可以为10nm至1000μm，优选10nm至750μm，更优选10nm至500μm，甚至更优选10nm至400μm，甚至更优选10nm至300μm，甚至更优选10nm至200μm，甚至更优选10nm至100μm，甚至更优选10nm至75μm，甚至更优选10nm至50μm，甚至更优选10nm至40μm，甚至更优选10nm至30μm，甚至更优选10nm至20μm，甚至更优选10nm至10μm，甚至更优选10nm至5μm，甚至更优选10nm至4μm，甚至更优选10nm至3μm，甚至更优选10nm至2μm，甚至更优选10nm至1μm(1000nm)。

官能化色谱介质

如上所讨论，用来接触组合物的官能化色谱介质包括一种或多种聚合物纳米纤维。聚合物纳米纤维任选地具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，其可以是相同或不同的。然而，在某些优选的实施方案中，纳米纤维没有与其共价结合的聚合物链。纳米纤维通常被官能化，通常用一种或多种配体基团，所述配体基团可以是相同或不同的，且使得包含一种或多种配体基团的纳米纤维适合用作色谱介质。

在将聚合物结合到纳米纤维或用一种或多种配体基团官能化之前，可以是一个或多个非织造片的形式的一种或多种聚合物纳米纤维可以任选地通过加热和/或压制聚合物纳米纤维/非织造片、优选加热和压制聚合物纳米纤维/非织造片而物理地改性。这些步骤改善材料的结构稳定性。还可以改变压制和加热条件以改变所得材料的厚度和/或孔隙率。

使用聚合物纳米纤维的多个非织造片能够制备更厚的材料，其具有更大的吸附容量。因此，官能化色谱介质通常通过提供两个或更多个彼此堆叠的非织造片(每个所述片包含一种或多种聚合物纳米纤维)，且同时加热和压制片的堆叠以熔合相邻片的纳米纤维之间的接触点来形成。

在纤维素官能化色谱介质的情况下，这通常通过提供两个或更多个彼此堆叠的非织造片(每个所述片包含一种或多种乙酸纤维素纳米纤维)，并同时加热和压制片的堆叠以熔合相邻片的纳米纤维之间的接触点来形成。

用于压制和加热聚合物纳米纤维/非织造片的优选加工条件可以在WO-A-2015/052460和WO-A-2015/052465中找到，其整体通过引用并入本文。

如上所述，可以是一个或多个非织造片的形式且可以任选地通过加热和/或压制物理改性的聚合物纳米纤维任选地具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，其可以是相同的或不同的。在某些实施方案中，所述聚合物纳米纤维不具有与其结合的聚合物链，特别是当病毒是腺相关病毒(AAV)时。

将一个或多个聚合物链共价结合到聚合物纳米纤维上可以包括将预制的聚合物链接枝到纳米纤维，或从纳米纤维接枝聚合物链。

为避免疑义，聚合物链与纳米纤维不同。因此，典型的制造方法将包括提供一种或多种所述聚合物纳米纤维，任选地以一个或多个所述非织造片的形式，和将一种或多种预制的聚合物链接枝到纳米纤维/片和/或从纳米纤维/片接枝一个或多个聚合物链。从纳米纤维/片接枝一个或多个链是优选的。

将预制的聚合物链接枝到纳米纤维通常包括使具有至少一个能够与纳米纤维上的官能团反应的基团的预制的聚合物链反应。

从底物接枝一个或多个聚合物链通常包括从纳米纤维上存在的一种或多种官能团生长一个或多个聚合物链，任选地在一种或多种催化剂的存在下。

因此，通常，纳米纤维包含一种或多种官能团，优选预制的聚合物链可以接枝到的和/或聚合物链可以从其生长的一种或多种官能团。

从一种或多种官能团生长聚合物链表示在来自各个单体构建嵌段的一种或多种官能团处构建聚合物。

聚合物链可以是中性的或带电荷的。在某些实施方案中，中性聚合物链是优选的。

聚合物的中性可以通过聚合物是否含有在本质上中性的pH下可离子化(即质子化或去质子化)的任何基团来评估，所述pH为例如pH 6-8，通常pH 6.5-7.5，经常pH 6.75-7.25，或约pH 7。通常，中性聚合物实质上不含酸性或碱性中心，即实质上没有在pH6-8，通常pH6.5-7.5，经常pH6.75-7.25，或约pH7下质子化或去质子化的官能团。这可以由技术人员通过本领域典型的测定来确定。酸度和碱度评估的典型程序及其理论方面在“Acidityand basicity of solids: Theory, assessment and utility(固体酸度和碱度：理论、评估和应用)” 编者J. Fraisard 和L. Petrakis, NATO ASI Series C, 卷444, KluwerAcademic Publishers, Dordrecht, Boston and London, 1994，特别是第513页中讨论，其整体通过引用并入本文。如本文所用，实质上表示小于1摩尔%，优选小于0.1摩尔%，甚至更优选小于0.01摩尔%，或甚至小于0.001摩尔%。

通常，只有一种类型的聚合物共价结合到纳米纤维。然而，在其他实施方案中，多于一种类型的聚合物可以共价结合到纳米纤维。

在官能化色谱介质由多于一种聚合物纳米纤维(即由多于一种聚合物形成的纳米纤维)形成的实施方案中，每种不同种类的聚合物纳米纤维都可以共价结合到由不同种类的聚合物形成的聚合物链。例如，这可能是由于不同的聚合物纳米纤维上存在不同的官能团。或者，相同的聚合物可以共价结合到每种不同种类的聚合物纳米纤维。

典型的官能团包括羟基、氨基和羧基。在官能化色谱介质由一种或多种纤维素或乙酸纤维素纳米纤维形成的情况下，官能团通常是羟基。

通常，处理纳米纤维以引入一种或多种官能团，或处理纳米纤维以使任何官能团脱保护或活化，或处理纳米纤维以增加官能团的数量/密度。优选地，处理纳米纤维以使底物上的任何官能团脱保护。

通常实施官能团的脱保护，使得官能团可以具有从它们生长的一个或多个聚合物链或接枝到它们的一个或多个预制的聚合物链。还可以进行脱保护，使得纳米纤维可以用如下面进一步讨论的一种或多种配体基团官能化。

例如，当色谱介质是纤维素色谱介质时，通常提供乙酸纤维素纳米纤维，且在将任何聚合物与其共价结合或用一种或多种配体基团官能化之前，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素。这涉及乙酰化羟基的脱保护以产生羟基。将乙酸纤维素转化为纤维素通常使用水性碱，优选NaOH水溶液:乙醇，更优选水:乙醇2:1实施大于12小时，例如12至36小时的期间。当在用一种或多种配体基团官能化之前使乙酰化羟基脱保护时，也可以使用相同的方案。

下文在用一种或多种配体基团官能化的语境下进一步讨论官能团的活化。该讨论同样适用于在将一个或多个聚合物链共价结合到纳米纤维之前官能团的活化。

用于增加底物上官能团数量/密度的方法会是技术人员已知的。

当将一种或多种官能团引入纳米纤维时，纳米纤维上存在的一种或多种官能团被改性以引入如下的官能团：(a)预制的聚合物链可以接枝到其和/或(b)可以由其生长一个或多个聚合物链。引入步骤可以包括单个步骤或多个步骤，其一起将纳米纤维上存在的官能团改性为一个或多个聚合物链可以接枝到其/由其接枝的官能团。

一个或多个聚合物链可以是支化的，产生“刷”型结构。或者，可以使用本质上非支化的聚合物链，产生“刷”聚合物结构。在某些实施方案中，优选非支化的聚合物链。

官能化

本发明的方法利用官能化色谱介质。色谱介质通常用一种或多种配体基团官能化，这使得该材料适合用作色谱介质。配体基团通常在聚合物纳米纤维上携带。因此，通常一种或多种聚合物纳米纤维用一种或多种配体基团官能化，所述配体基团可以是相同或不同，且使得包含一种或多种配体基团的纳米纤维适合用作色谱介质。

用于形成纳米纤维的聚合物可以在形成纳米纤维的步骤之前被官能化。

或者，且优选地，在聚合物已形成纳米纤维之后，纳米纤维被官能化。

通常，一种或多种配体基团结合到一种或多种纳米纤维。这在其中纳米纤维不具有与其共价结合的一个或多个聚合物链的情况下是典型的。因此，通常，纳米纤维不具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，且一种或多种配体基团结合到一种或多种纳米纤维。

或者，当纳米纤维具有与其共价结合的一个或多个聚合物链时，一种或多种配体基团可以共价结合到纳米纤维和/或聚合物链。在这种情况下，一种或多种配体基团优选至少共价结合到所述一个或多个聚合物链。

一种或多种配体基团通常可以通过使一种或多种纳米纤维与试剂接触而引入，所述纳米纤维任选地经压制和/或加热且任选地具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，所述试剂使产品官能化为色谱介质。

该试剂通常通过引入一种或多种配体基团使色谱介质官能化，所述配体基团使得包含一种或多种配体基团的官能化产品适合用作色谱介质。配体基团是引入到接枝产品上的基团，这使其适合用作色谱介质。合适的配体基团和试剂将在下面进一步讨论。

在一些实施方案中，官能化色谱介质仅用一种类型的配体基团官能化。在其他实施方案中，官能化色谱介质用两种或更多种类型的配体基团官能化。

在其中官能化色谱介质包含由不同聚合物形成的一种或多种聚合物纳米纤维的实施方案中，每种不同种类的聚合物纳米纤维可以用可以是相同的或不同的一种或多种配体基团官能化(在聚合物链任选地与其共价结合之后)。

在其中多于一种类型的聚合物链可以共价结合到纳米纤维的实施方案中，每个聚合物链可以用一种或多种配体基团官能化，所述配体基团可以是相同或不同的。

一般而言，介质/纳米纤维的官能化改变它们的化学和/或物理性质。这继而影响官能化色谱介质在色谱方法中使用时如何行为。例如，与其未官能化形式相比，该改性可以改变官能化色谱介质的极性、疏水性或生物结合性质。在某些情况下，与其未官能化形式相比，该改性可以改变官能化色谱介质的极性、疏水性或生物结合性质中的多于一种。在一个实施方案中，与其未官能化形式相比，该改性改变官能化色谱介质的极性和疏水性。

通常，官能化色谱介质适用于选自离子交换色谱、亲和捕获色谱、疏水色谱和混合模式色谱的色谱方法。在某些情况下，色谱方法以“混合模式”操作，即利用相互作用(即离子交换、亲和捕获和疏水相互作用)中的多于一种形式。通常，这种“混合模式”色谱涉及离子交换(离子)和疏水相互作用。优选地，官能化色谱介质适用于选自离子交换色谱、亲和捕获色谱和疏水色谱的色谱方法，优选离子交换色谱和亲和捕获色谱。在操作中，这种色谱方法包括使含有所需分子的流动相通过吸附相，此处为官能化色谱介质。通常选择吸附剂相，使得所期望的分子优先于流动相中还存在的其他组分保留在其上。

通常，色谱介质用DEAE、Q、SP、CM、苯基或MEP基团，例如DEAE、Q、SP或CM基团官能化。通常，聚合物纳米纤维是纤维素纳米纤维，且色谱介质用DEAE、Q、SP、CM、苯基或MEP基团，例如DEAE、Q、SP或CM基团官能化。因此，官能化色谱介质可包括用DEAE、Q、SP、CM、苯基或MEP基团，例如DEAE、Q、SP或CM基团衍生的纤维素纳米纤维。这些配体基团可以结合到聚合物纳米纤维和/或，在聚合物链已共价结合到纳米纤维的情况下，可以结合到聚合物链。

官能化色谱介质通常适用于离子交换、亲和捕获、疏水或混合模式色谱方法。因此，通常一种或多种配体基团是一个或多个带负电荷的部分，一个或多个带正电荷的部分，一种或多种蛋白质，模拟蛋白质配体、肽、抗体或其片段的作用的模拟或合成配体，染料，组氨酸，含有金属阳离子的基团或疏水基团。优选地，一种或多种配体基团是一个或多个带负电荷的部分，一个或多个带正电荷的部分，一个或多个含有金属阳离子的基团，或疏水基团。

如上所述，可以通过用适当选择的试剂处理而将配体基团引入纳米纤维/聚合物链。优选2-氯-N,N-二乙胺盐酸盐(DEACH)和缩水甘油基三甲基铵作为试剂，特别是当官能化色谱介质用于阴离子交换色谱方法时。其他优选的试剂是1,4-丁烷砜，氯乙酸钠，TEMPO然后是高氯酸钠，或烯丙基缩水甘油醚然后是亚硫酸氢钠，特别是当官能化色谱介质用于阳离子交换色谱方法时。另一种优选的试剂是氧化苯乙烯，特别是当官能化色谱介质用于疏水色谱方法时。

通常，试剂是缩水甘油基三甲基铵、1,4-丁烷砜或氯乙酸钠。

离子交换色谱是将分子或生物实体基于其离子电荷分离的技术。因此，用于这些方法的官能化色谱介质含有一个或多个带正电荷或带负电荷的部分。官能化色谱介质中的正电荷和/或负电荷通常与一种或多种抗衡离子平衡。离子交换色谱涉及阳离子交换色谱和阴离子交换色谱中的一种或多种。

离子交换色谱是优选的。因此，优选一种或多种配体基团是带电荷的(配体)基团。

用于阳离子交换色谱的官能化色谱介质含有一个或多个带负电荷的部分。典型的带负电荷的部分包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根基团，或其混合物，即这些部分通常含有一个或多个-COO^-、-SO₃ ^-或-P(OH)₂O^-基团，或其混合物。用于阳离子交换色谱的典型官能化色谱介质含有一个或多个-O-CH₂COO^-、-CH₂COO^-、-SO₃ ^-、-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-、-CH₂CH₂SO₃ ^-或-P(OH)₂O^-部分。

用于阴离子交换色谱的官能化色谱介质含有一个或多个带正电荷的部分。典型的带正电荷的部分包括一个或多个季胺基团。用于阴离子交换色谱的典型官能化色谱介质含有一个或多个-N⁺(CH₃)₃、-N⁺(C₂H₅)H、-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)H、-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)₂(CH₂CH(OH)CH₃)、-O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃、-CH₂CH₂N⁺(CH₃)₃，或-CH₂CH₂N⁺(CH₃)₂H部分。

为避免疑义，“带电荷的基团”是指包含被离子化从而带有正电荷或负电荷的部分的基团，即“带电荷的基团”包含阴离子或阳离子部分。带电荷的基团是配体基团的具体实例。

通常，一种或多种带电荷的基团包含一个或多个羧酸根(-COO-)、磺酸根(-SO₃ ^-)或膦酸根基团(-P(OH)₂O^-)基团，或季胺基团，或其混合物。通常，一种或多种带电荷的基团包含所有阴离子基团或所有阳离子基团，然而在某些情况下，可以设想阴离子和阳离子基团的混合物。通常，仅使用一种类型的阴离子基团，但也可以使用混合物。通常，仅使用一种类型的阳离子基团，但也可以使用混合物。

代表性的带电荷的基团包括-O-CH₂COO^-、-CH₂COO^-、-SO₃ ^-、-CH₂CH₂CH₂SO₃ ^-、-CH₂CH₂SO₃ ^-、-P(OH)₂O^-、-N⁺(CH₃)₃、-N⁺(C₂H₅)H、-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)H、-CH₂CH₂N⁺(C₂H₅)₂(CH₂CH(OH)CH₃)、-O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃、-CH₂CH₂N⁺(CH₃)₃和-CH₂CH₂N⁺(CH₃)₂H部分。

典型的带电荷的基团包括DEAE、Q、SP和CM基团。通常，官能化色谱介质用DEAE、Q、SP或CM基团官能化。因此，官能化色谱介质可包括用DEAE、Q、SP或CM基团衍生的纤维素纳米纤维。

亲和捕获色谱是将分子基于其对特定配体(通常但不总是生物配体)的亲和力分离的技术。例如，该方法可以依赖于抗体和抗原或酶和底物之间的吸引力。用于亲和捕获色谱的官能化色谱介质通常含有一个或多个选自一种或多种蛋白质、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸或含有金属阳离子的基团的部分。用于亲和捕获色谱的官能化色谱介质优选含有一个或多个选自含有金属阳离子的基团的部分。因此，一种或多种配体基团可包含一个或多个这样的部分。或者，用于亲和捕获色谱的官能化色谱介质可含有模拟蛋白质配体作用的模拟或合成配体。

用于亲和捕获色谱的典型蛋白质是本领域技术人员熟知的，包括蛋白A、蛋白G和蛋白L。蛋白A是优选的。

蛋白A是技术人员熟知的蛋白质。如本文所用，对“蛋白A”的提及包括重组蛋白A(其与金黄色葡萄球菌中发现的蛋白A相比可具有改变的序列)和标记的蛋白A(如EP-B-0873353和US6399750中所述，其整体通过引用并入本文)。

用于亲和捕获色谱的典型抗体及其片段是本领域技术人员熟知的，且包括IgG。

用于亲和捕获色谱的典型染料是本领域技术人员熟知的，且包括黄色HE-4R、红色HE-3B和汽巴蓝(Cibacron Blue)F3G。

用于亲和捕获色谱的典型的含有金属阳离子的基团是本领域技术人员熟知的。这些基团通常含有螯合剂以固定金属阳离子。金属阳离子通常选自铜、镍、锌和钴阳离子，优选Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Co²⁺。

疏水相互作用色谱是将分子或生物实体基于其疏水性而分离的技术。因此，用于这些方法的官能化色谱介质含有一个或多个含有一个或多个疏水基团的部分。典型的疏水基团包括丙基、丁基、苯基和辛基。

混合模式(或多模式)色谱是基于两种或更多种特征(通常是疏水性和离子电荷)分离分子或生物实体的技术。这可涉及疏水性和阴离子性质的组合，或疏水性和阳离子性质的组合。因此，用于这种方法的官能化色谱介质通常含有一个或多个部分，其带正电荷或带负电荷，通常如上限定，且其含有一个或多个疏水基团，通常如上限定。官能化色谱介质中的正电荷和/或负电荷通常与一种或多种抗衡离子平衡。用于这种方法的官能化色谱介质还可含有一个或多个可离子化的疏水基团，用于所谓的疏水电荷诱导色谱(HCIC)。因此，在一个实施方案中，混合模式色谱是疏水电荷诱导色谱。用于这种方法的合适基团是4-巯基-乙基-吡啶(MEP)基团和辛胺基团。

用于包括疏水和阴离子相互作用的组合的混合模式色谱方法的官能化色谱介质含有一个或多个带正电荷的部分，通常如上限定，和一个或多个疏水基团，通常如上限定。用于这种方法的合适基团是N-苄基甲基乙醇胺基团和N-苯甲酰基-高半胱氨酸基团。用于包括疏水和阳离子相互作用的组合的混合模式色谱方法的官能化色谱介质含有一个或多个带负电荷的部分，通常如上限定，和一个或多个疏水基团，通常如上限定。用于这种方法的合适基团是N-苯甲酰基-高半胱氨酸基团。

通常通过使合适的试剂与聚合物纳米纤维和/或聚合物链上包含的一种或多种官能团反应，将配体基团引入官能化色谱介质中。典型的官能团包括羟基、氨基、卤素和羧基。在聚合物纳米纤维是纤维素或乙酸纤维素纳米纤维的情况下，官能团通常是羟基。

所述一种或多种官能团可以在与试剂反应之前活化。可以采用本领域已知的常规活化方法。因此，在其中官能团是羟基的情况下，可以通过用羰基二咪唑(CDI)、双环氧乙烷、氰尿酸、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4磺酸盐(FMP)、NaIO₄或二乙烯砜处理来活化这种基团。在其中官能团是氨基的情况下，可以通过用表氯醇、戊二醛或环氧化物处理来活化这种基团。在其中官能团是羧基的情况下，可以通过用CDI或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)处理来活化这种基团。在其中官能团是卤原子的情况下，可以通过用二乙烯砜处理来活化这种基团。技术人员可以选择合适的试剂以将特定的基团和部分引入到特定的纳米纤维/聚合物链上，例如基于所期望的配体基团和部分以及那些纳米纤维/聚合物链中包含的官能团。典型的试剂包括2-氯-N,N-二乙胺盐酸盐(DEACH)，缩水甘油基三甲基氯化铵(GMAC)，1,4-丁烷砜或氯乙酸钠。

通常，

-色谱方法是阳离子交换方法，且色谱介质用包含一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根部分的一种或多种带电荷的基团官能化；或

-色谱方法是阴离子交换方法，且色谱介质用包含一个或多个季氨基或二乙基胺部分的一种或多种带电荷的基团官能化；

-色谱方法是亲和捕获色谱方法，且色谱介质用一个或多个含有金属阳离子的基团官能化；

-色谱方法是疏水相互作用色谱方法，且色谱介质用一个或多个丙基、丁基、苯基或辛基官能化；或

-色谱方法是混合模式色谱方法，且色谱介质用一种或多种MEP、辛胺、N-苄基甲基乙醇胺或N-苯甲酰基-高半胱氨酸基团官能化。

官能化色谱介质的性质

官能化色谱介质中配体基团的密度通常为100-1,500μmol/g官能化色谱介质。密度优选为300-1,500μmol/g，更优选为500-1200μmol/g，甚至更优选为600-1000μmol/g，甚至更优选为700-900μmol/g。在一些实施方案中，密度为100-500μmol/g。当配体基团是带电荷的基团时，该数字代表材料的电荷密度。

通常通过滴定方法测定密度以确定官能化材料中的部分数。技术人员将了解用于确定给定的官能化材料样品中存在的特定部分的量的合适方法。

在用三甲基氯化铵官能化的语境下，密度可以作为三甲基氯化铵密度来确定，其可以通过以下测定来确定：

1)在布氏过滤漏斗上用100mL 0.1M HCl溶液洗涤50 mg材料，且然后再用100 mL0.01M HCl溶液洗涤；

2)将材料在75℃的干燥烘箱中干燥至恒定质量，然后撕成小块并置于装配有小磁力搅拌棒的50mL离心管中；

3)加入15mL去离子水以及约1mL(经由橡皮头移液管加入)铬酸钾溶液，使混合物颜色变成黄色；

4)剧烈搅拌混合物20分钟，然后用0.1M硝酸银滴定，滴定的终点通过从透明黄色到雾状棕色的颜色变化来识别；

5)将三甲基氯化铵含量(μmol/g)计算为到达终点所加入的硝酸银的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数。

在用磺酸(S)基团官能化的语境下，密度可以作为磺酸密度来确定，其可以通过以下测定来确定：

1)用0.1M HCL和0.01M HCl洗涤干燥的官能化材料样品；

2)将材料在烘箱中干燥并称重；

3)通过达到pH7必须加入的NaOH的量来确定材料的摩尔浓度；

4)将磺酸(S)含量(μmol/g)计算为达到pH7所加入的NaOH的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数。

官能化色谱材料通常具有10至210mg/mL(10%穿透)，优选20至195mg/mL(10%穿透)，30至180mg/mL(10%穿透)，40至165 mg/mL(10%穿透)或50至150 mg/mL(10%穿透)的动态结合容量(DBC)。在某些实施方案中，DBC可以是至多50mg/mL(10%穿透)，例如10至50mg/mL(10%穿透)。对于阴离子官能化色谱介质，DBC(10%穿透)通常计算为BSA的DBC(10%穿透)。对于阳离子官能化色谱介质，DBC(10%穿透)通常计算为溶菌酶的DBC(10%穿透)。

10%穿透的DBC可以根据标准方法确定，例如使用AKTA Pure系统。

通常根据以下测定方法测定10%穿透的DBC：

1)将加载材料(对于阴离子交换材料，加载材料是达pH8的10mM Tris中的1mg/mL BSA。对于阳离子交换材料，加载材料是乙酸钠pH4.7 10mM中的1mg/mL溶菌酶。)通过AKTA Pure系统(GE Healthcare)上的保持器内所含的官能化材料；

2)材料在确定的膜体积每分钟流速(mV/min)下加载，直到保持器出口后的浓度超过加载的10%，如通过UV流动池测定；

3)考虑系统和保持器设备中的死体积，通过Unicorn软件(GE Healthcare)中的色谱图分析来确定在10%穿透时加载到盘上的蛋白质的总量。

通常，官能化色谱材料是不耐盐的材料。不耐盐的材料是能够在低盐浓度下的结合洗脱分离方法的洗脱步骤中洗脱产品的材料。如本文所用，低盐浓度是电导率小于10mS/cm的溶液。

色谱方法

本发明的方法是色谱分离方法。通常，色谱分离是结合-洗脱色谱分离方法。或者，色谱分离方法是流动通过色谱分离方法。官能化色谱介质用作色谱分离方法中的固定相。

本发明的方法包括使包含如本文限定的病毒产品和如本文限定的产品相关杂质的组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触。或者，本发明的方法包括使包含如本文限定的病毒产品和如本文限定的非产品相关杂质的组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触。

官能化色谱介质可以是膜或片的形式。这种膜和片适用于膜色谱方法。膜色谱方法是本领域技术人员熟知的，且在“Membrane Processes in Biotechnologies andPharmaceutics” ed. Catherine Charcosset, Elsevier, 2012中讨论，其整体通过引用并入本文。

官能化色谱介质可以容纳在色谱筒(cartridge)或保持器(holder)中。术语筒和保持器在本文中同义使用。筒通常包含一种或多种本发明的官能化色谱介质。筒通常是圆柱形的。

通常，色谱筒包括一种或多种本发明的官能化色谱介质，其堆叠或卷绕在通常为圆柱形的保持器内。色谱筒可设计成在轴向或径向流动下操作。在一个实施方案中，所述筒包含缠绕在保持器内的本发明的一种或多种官能化色谱介质，所述保持器设计成在轴向流动下操作。或者，所述筒包括堆叠在保持器内的本发明的一种或多种官能化色谱介质，所述保持器设计成在径向流动下操作。

通常，色谱筒包含本发明的两种或更多种官能化色谱介质。色谱筒通常包含本发明的至多20种官能化色谱介质。

通常，色谱筒还包括在通常为圆柱形的保持器内的一个或多个熔料。熔料是本领域技术人员熟知的，且是指刚性多孔结构，通常是刚性金属、聚合物或陶瓷，优选刚性金属或陶瓷多孔结构。通常将熔料包含在色谱筒中以改善通过筒的流动分布和/或支撑本发明的一种或多种官能化色谱介质。典型熔料中的孔的直径为1-1000μm，优选5-500μm，更优选10-150μm。其他合适的熔料孔径包括1至20μm，优选5至10μm，更优选3至7μm。

通常，筒包含本发明的两种或更多种官能化色谱介质和一个或多个熔料，所述熔料位于官能化色谱介质之间。

在一些实施方案中，筒不包括熔料。

代替熔料或者除熔料外，筒可以包括备选隔离材料。典型的备选隔离材料包括非织造和织造材料。

非织造材料，例如非织造聚合物材料是本领域技术人员已知的。这种非织造材料是多孔的，即允许液体通过，通常没有明显的压降。通常，非织造聚合物材料是聚丙烯。通常，非织造材料的面积密度为45-150gsm。

在一些实施方案中，所述筒包含本发明的两种或更多种官能化色谱介质和一个或多个如上限定的非织造聚合物材料层，所述一个或多个非织造聚合物材料层位于官能化色谱介质之间。

织造材料是本领域技术人员已知的。这种织造材料是多孔的，即允许液体通过，通常没有明显的压降。通常，织造材料是织造聚合物材料，优选织造聚丙烯。通常，织造材料的厚度小于1mm。

通常，色谱筒还包括一个或多个入口流体分配装置和/或出口流体收集装置。这些装置是本领域技术人员熟知的。

本发明的方法包括使本文限定的组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触，所述官能化色谱介质可以是如本文限定的膜或片的形式，和/或包含在如本文限定的筒中。认为病毒产品和产品相关杂质以不同强度与官能化色谱介质结合。通常，这允许它们在随后的洗脱步骤中分离。这可以根据对已知的色谱方法的结合和洗脱阶段已知的常规方法进行。或者，病毒产品和产品相关杂质的不同结合强度使得病毒产品能够以流动通过模式与产品相关杂质分离，即包含病毒产品和产品相关杂质的组合物与官能化色谱介质接触且病毒产品从柱洗脱，而产品相关杂质实质上与官能化色谱介质结合。

或者或另外，认为病毒产品和非产品相关杂质以不同强度与官能化色谱介质结合。通常，这允许它们在随后的洗脱步骤中分离。这可以根据对已知的色谱方法的结合和洗脱阶段已知的常规方法进行。或者，病毒产品和非产品相关杂质的不同结合强度使得病毒产品能够以流动通过模式与非产品相关杂质分离，即使包含病毒产品和非产品相关杂质的组合物与官能化色谱介质接触，且从柱洗脱病毒产品，而非产品相关杂质实质上与官能化色谱介质结合。

组合物通常在流动相中包含如本文限定的病毒产品和产品相关杂质。或者，组合物通常在流动相中包含如本文限定的病毒产品和非产品相关杂质。流动相通常是水相，优选缓冲溶液，例如缓冲盐水或Tris缓冲液。组合物通常从用于产生病毒产品的过程获得，或在缓冲液交换步骤(例如病毒媒介产生过程)后获得。这些过程是本领域技术人员已知的(Urabe等人, 2006) (Qu等人, 2007) (M. Lock等人, 2012) (Lee等人, 2009)，所有这些都通过引用并入本文。

组合物通常还包含用于产生病毒产品的过程的另外的副产品。另外的副产品可包括例如缓冲液、细胞碎片、细胞蛋白、细胞DNA和细胞培养基的组分。

在根据本发明进行处理之前，可以进行另外的处理步骤，例如，离心、用DNAse处理、尺寸排阻色谱、亲和色谱和/或离子交换色谱中的一种或多种。

因此，本发明提供一种回收病毒产品的方法，所述方法包括：

(i)提供如本文限定的组合物，其包含如本文限定的病毒产品和如本文限定的产品相关杂质，

(ii)任选地使组合物经受选自离心、用DNAse处理、尺寸排阻色谱、亲和色谱和离子交换色谱的一个或多个处理步骤，和

(iii)使所得组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触。

或者，本发明因此提供一种回收病毒产品的方法，所述方法包括：

(i)提供如本文限定的组合物，其包含如本文限定的病毒产品和如本文限定的非产品相关杂质，

(ii)任选地使组合物经受选自离心、用DNAse处理、尺寸排阻色谱、亲和色谱和离子交换色谱的一个或多个处理步骤，和

(iii)使所得组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触。

在一些实施方案中，步骤(ii)至少包括亲和色谱。

步骤(i)通常包括病毒媒介产生过程，其可以根据如别处所讨论的已知方法进行。

组合物通常具有溶解的盐浓度，使得电导率低于30mS/cm。电导率优选低于25mS/cm，更优选低于20mS/cm，甚至更优选低于15mS/cm，甚至更优选低于10mS/cm，甚至更优选低于9mS/cm，甚至更优选8mS/cm或更低。技术人员非常了解可用于确定电导率的合适方法。

本发明的方法可包括使组合物与官能化色谱介质以分批方法接触，即将组合物和介质置于容器中；或以连续方法接触，即其中官能化色谱介质为膜或片的形式且将组合物通过包含一个或多个所述膜/片和任选的一个或多个熔料或如本文限定的其他隔离材料的保持器或筒。通常在这样的实施方案中，将组合物通过保持器，使得(a)通过所述一个或多个膜/片的路径长度小于2mm和/或(b)通过保持器中存在的膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。

在实施方案(a)中，应当理解，组合物还可以通过在保持器中不是膜/片的其他材料，且2mm路径长度不包括这些其他材料。在实施方案(b)中，50mm路径长度包括保持器中的其他材料。为避免疑义，上述任一个路径长度都不包括保持器中材料层之间的任何气隙。

本发明的方法可以在高流速下操作。因此，通常在本发明的色谱方法中，使组合物与官能化色谱介质接触一分钟或更少，优选50秒或更少，更优选40秒或更少，又更优选30秒或更少，仍更优选20秒或更少，或甚至15秒或更少，12秒或更少，10秒或更少，8秒或更少，6秒或更少，4秒或更少，2秒或更少，1.5秒或更少，或甚至1秒或更少的时间段。

本发明的方法通常包括从官能化色谱介质回收病毒产品的进一步步骤。当与官能化色谱介质接触时，病毒产品被吸附在官能化色谱介质上。该步骤通常可以通过使吸附有一种或多种生物分子的官能化色谱介质与洗脱缓冲液接触来实施。通常，这包括与相对于时间离子强度渐增的液相接触。这选择性洗脱病毒产品。产品相关杂质也可以吸附到官能化色谱介质。非产品相关杂质也可以吸附到官能化色谱介质。通过小心地增量控制洗脱缓冲液的离子强度，可以优先于这些杂质选择性洗脱病毒产品。这可以根据对这种色谱方法的洗脱阶段已知的常规方法进行。因此，该方法通常是结合-洗脱色谱方法。

在结合步骤和洗脱步骤之间，方法可以进一步包括洗涤吸附有病毒产品和/或产品相关和/或非产品相关杂质的官能化色谱介质的步骤。进行该洗涤步骤以除去未与官能化色谱介质或色谱筒结合的任何组分。这可以根据对这种色谱方法的洗涤阶段已知的常规方法进行。该洗涤步骤通常包括用低离子浓度的液相洗涤。

通常，本发明的方法包括以下步骤：

(i)使如本文限定的组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触；

(ii)任选地用低离子浓度的液相洗涤官能化色谱介质；和

(iii)通过使官能化色谱介质与离子强度渐增的液相接触，选择性洗脱病毒产品和产品相关杂质。

或者，本发明的方法包括以下步骤：

(i)使如本文限定的组合物与如本文限定的官能化色谱介质接触；

(ii)任选地用低离子浓度的液相洗涤官能化色谱介质；和

(iii)通过使官能化色谱介质与离子强度渐增的液相接触，选择性洗脱病毒产品和非产品相关杂质。

在洗脱步骤之后，该方法可以进一步包括再生官能化色谱介质的步骤。通常，这通过使已经洗脱病毒产品和/或产品相关杂质的官能化色谱介质与缓冲液接触来实施。这可以根据对这种色谱方法的再生阶段已知的常规方法进行。

或者，当与官能化色谱介质接触时，病毒产品不会被吸附在官能化色谱介质上。代替的是，当与官能化色谱介质接触时，产品相关杂质可被吸附在官能化色谱介质上。因此，通过使包含含有病毒产品和产品相关杂质的组合物的溶液流动通过包含官能化色谱介质的筒，可以优先于产品相关杂质选择性收集病毒产品，因为在完成流动通过步骤之后产品相关杂质保持实质上与官能化色谱介质结合。

或者或另外，当与官能化色谱介质接触时，非产品相关杂质可被吸附在官能化色谱介质上。因此，通过使包含含有病毒产品和非产品相关杂质的组合物的溶液流动通过包含官能化色谱介质的筒，可以优先于非产品相关杂质选择性收集病毒产品，因为在完成流动通过步骤之后非产品相关杂质保持实质上与官能化色谱介质结合。

因此，本发明的方法备选地包括以下步骤：

(i)使包含如本文限定的组合物的溶液与如本文限定的官能化色谱介质接触；和

(ii)收集在步骤(i)中已接触官能化色谱介质的溶液，该溶液包含病毒产品。

通常，根据本发明的回收病毒产品的方法包括单一结合-洗脱步骤或单一流动通过步骤。或者，根据本发明的方法可以包括串联的多于一个洗脱步骤，例如两个、三个、四个、五个或更多个结合-洗脱步骤。或者，根据本发明的方法可包括串联的多于一个流动通过步骤，例如两个、三个、四个、五个或更多个流动通过步骤。或者，根据本发明的方法可以包括串联的结合-洗脱和流动通过步骤的组合，例如总共两个、三个、四个、五个或更多个步骤。

通常，回收病毒产品并丢弃产品相关杂质。通常，丢弃非产品相关杂质。然而，某些产品相关杂质可用于某些应用，因此还可以设想产品相关杂质可以作为第二产品收集。

本发明的方法用于回收病毒产品。然而，应当理解，没有色谱方法能够提供100%纯度的病毒产品。因此，本发明提供一种从包含病毒产品和产品相关杂质的组合物回收与原始组合物相比富含病毒产品的产品级分的方式。因此，通常，产品级分含有比组合物中存在的更大量的病毒产品，表示为病毒产品和产品相关杂质的总量的百分比。通常，表示为病毒产品和产品相关杂质的总量的百分比的产品级分中病毒产品的量是组合物中的量的10倍或更多倍，优选100、1000、10000、1x10^5、1x10^6、1x10^7、1x10^8、1x10^9、1x10^10、1x10^11、1x10^12、1x10^13或1x10^14或更多倍。

因此，通常，表示为病毒产品和产品相关杂质的总量的百分比的产品级分中病毒产品的量用%PF指代，其可通过100PF_VP/(PF_VP + PF_I)计算，其中PF_VP是产品级分中病毒产品的量，且PF_I是产品级分中产品相关杂质的量。表示为病毒产品和产品相关杂质的总量的百分比的原始组合物中病毒产品的量可以通过%C指代，其计算为100C_VP/(C_VP + C_I)，其中C_VP是组合物中的病毒产品的量，且C_I是组合物中产品相关杂质的量。

本发明的方法使产品级分中的病毒产品的量相对于组合物中的量富集，使得通常%PF≥10%C。优选地，%PF≥100%C、1000%C、10000%C、%Cx10^5、%Cx10^6、%Cx10^7、%Cx10^8、%Cx10^9、%Cx10^10、%Cx10^11、%Cx10^12、%Cx10^13、或%Cx10^14。

通常，本发明的方法采用模拟或实际移动床系统。因此，通常，所述方法包括将组合物引入一个或多个具有多个连接的色谱柱的模拟或实际移动床色谱装置中，该色谱柱含有作为吸附剂的官能化色谱介质。

任何已知的模拟或实际移动床装置可用于进行所述色谱方法，条件是它包含官能化色谱介质作为吸附剂。

模拟和实际移动床色谱是本领域技术人员熟悉的已知技术。操作原理涉及液体洗脱相和固体吸附相的逆流运动。该操作允许最少的溶剂使用，使得该方法在经济上可行。这种分离技术已经在不同领域得到应用，包括使用膜吸附剂纯化生物分子。

模拟移动床系统由许多含有吸附剂的单个柱组成，这些柱串联连接在一起。洗脱液以第一方向通过柱。通过一系列阀周期性地移动原料和洗脱液的注入点以及系统中经分离组分的收集点。总体效果模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱的操作。因此，模拟移动床系统由柱组成，与在常规的固定床系统中一样，柱包含洗脱液通过的固体吸附剂的固定床，但在模拟移动床系统中，操作以达到模拟连续逆流移动床。

实际移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。然而，不是通过阀系统移动进料混合物和洗脱液的注入点以及经分离组分的收集点，而是相对于进料和排出点物理地移动一系列吸附单元(即柱)。同样，操作以达到模拟连续逆流移动床。

本发明人发现，与现有技术的病毒媒介纯化方法相比，使用如上概述的官能化色谱介质具有几个优点。

一个优点是该材料对盐相对不耐受，且因此可以使用相对低盐浓度的洗脱缓冲液从色谱介质洗脱病毒产品。可通过洗脱缓冲液的电导率测量该低盐浓度。

因此，本发明还提供从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与不耐盐的色谱介质接触，其中不耐盐的色谱介质能够以小于10mS/cm的电导率洗脱病毒产品。

或者，本发明还提供从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的非产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与不耐盐的色谱介质接触，其中不耐盐的色谱介质能够以小于10mS/cm的电导率洗脱病毒产品。

在这些实施方案中，不耐盐的色谱介质是如上限定的不耐盐的材料。

不耐盐的色谱介质在许多方面类似于上文限定的官能化色谱介质，但不限于包含聚合物纳米纤维的色谱介质。然而，不耐盐的色谱介质通常是由一种或多种上文限定(对于聚合物纳米纤维)的聚合物形成的聚合物介质。不耐盐的色谱介质通常也是官能化的介质，用如上限定的一种或多种配体基团官能化。

另一个优点是仅需要使用低体积的色谱材料来分离装填的和未装填的媒介。

因此，本发明还提供从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片的形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器， 其中将所述组合物通过保持器使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。

在该实施方案中，色谱介质在许多方面类似于上文限定的官能化色谱介质，但不限于包含聚合物纳米纤维的色谱介质。然而，色谱介质通常是由一种或多种上文限定(对于聚合物纳米纤维)的聚合物形成的聚合物介质。色谱介质通常也是官能化介质，用一种或多种如上限定的配体基团官能化。

另一个优点是短停留时间是可能的。

因此，本发明还提供从如本文限定的组合物回收如本文限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如本文限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片的形式的色谱介质接触且将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器，其中所述组合物与色谱介质接触一分钟或更少的时间段。

在该实施方案中，色谱介质在许多方面类似于上文限定的官能化色谱介质，但不限于包含聚合物纳米纤维的色谱介质。然而，色谱介质通常是由一种或多种上文限定(对于聚合物纳米纤维)的聚合物形成的聚合物介质。色谱介质通常也是官能化介质，用一种或多种如上限定的配体基团官能化。

优选的停留(接触)时间如上限定。

另一个优点是认为根据本发明的方法确保在色谱分离步骤期间比使用备选纯化方法时更大比例的病毒颗粒保持完整。因此，认为进行根据本发明的方法比进行现有技术中已知的病毒纯化方法损害病毒颗粒要少。

病毒产品、杂质、组合物和用途

本发明提供通过本发明的方法获得或可获得的病毒产品。在一个优选的实施方案中，本发明提供通过本发明的方法获得或可获得的病毒媒介。这些产品可有利地用于本发明的微生物处理、接种和基因治疗方法。

还提供通过本发明的方法获得或可获得的产品相关杂质。尽管通常会丢弃这些杂质，在某些实施方案中，它们可用于治疗，例如接种。

还提供一种组合物，其包含如本文限定的病毒产品联合药学上可接受的载体或稀释剂。这种组合物可用于本发明的微生物处理、接种和基因治疗方法。

还提供一种组合物，其包含如本文限定的产品相关杂质联合药学上可接受的载体或稀释剂。

优选的组合物不含污染微生物和热原。

本发明的病毒产品(和任选的产品相关杂质)可以多种剂型施用。因此，它们可以口服施用，例如作为水性或油性悬浮液。它们还可以肠胃外施用，皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内、透皮或通过输注技术的任一。它们还可以经由吸入器或雾化器以气溶胶的形式吸入施用。

用于口服施用的制剂例如可以连同活性成分含有：增溶剂，例如环糊精或改性环糊精；稀释剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、和/或聚乙二醇；粘合剂；例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、海藻酸、藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠；泡腾混合物；染料；甜味剂；润湿剂，如卵磷脂、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸盐；和用于药物制剂的通常无毒和药理学惰性的物质。

用于口服施用的液体分散体可以是溶液、糖浆、乳液和悬浮液。溶液可含有增溶剂，例如环糊精或改性环糊精。糖浆可含有载体，例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇。

悬浮液和乳液可含有例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。用于肌内注射的悬浮液或溶液可以连同活性化合物含有：药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇例如丙二醇；增溶剂，例如，环糊精或改性环糊精，且如果需要，适量的盐酸利多卡因。

用于静脉内或输注的溶液可含有载体(例如无菌水)和增溶剂(例如环糊精或改性环糊精)，或优选它们可以是无菌水性等张盐水溶液的形式。

本发明的病毒产品可用于体内递送治疗性遗传物质到患者，例如进行基因治疗或遗传-接种处理，其中病毒产品包括治疗性遗传物质。应当理解，术语“治疗性遗传物质”在本文中用于表示为获得治疗效果而施用的任何遗传物质或核酸，例如通过表达治疗上有用的蛋白质或RNA。这种方法可任选地包括向患者还施用一种或多种产品相关杂质，特别是在接种的情况下。

基因治疗在人类疾病的整个领域具有应用，包括但不限于癌症的处理(包括适合于直接注射的局部可及的肿瘤结节，以及需要全身处理的转移性癌症)，帕金森病，X-SCID，镰状细胞病，Lesch-Nyhan综合症，苯丙酮尿症(PKU)，亨廷顿氏舞蹈病，杜氏肌营养不良症，血友病，囊性纤维化，溶酶体贮积病，心血管疾病和糖尿病。

本发明的病毒产品也可用于递送病毒疫苗。设想将针对HIV、结核病、疟疾、流感、癌症和其他疾病进行接种。疫苗可以初免加强方案(prime boost regime，即通过多次施用)或与佐剂组合给予。

本发明的病毒产品可用于将治疗剂体内递送到患者，例如进行包括病毒治疗的微生物治疗。

在某些实施方案中，本发明的病毒产品可以与其他药物、例如其他有效于处理癌症的药物组合使用。

病毒产品也可以用于将多核苷酸插入细胞的离体方法，所述方法包括使细胞与本发明的病毒产品离体接触。例如，这种离体方法可包括随后用于治疗的细胞的离体操作。典型的治疗应用包括嵌合抗原受体-T(CAR-T)癌症治疗。或者，离体方法可用于研究目的，或用于例如基因编辑(包括CRISPR)，例如在产生转基因作物或用于产生生物燃料的酶中。

随后可以将根据该离体方法改性的细胞作为治疗剂施用到患者。本发明提供通过本发明的离体方法获得或可获得的细胞。因此，本发明还提供一种处理方法，所述方法包括向需要其的患者施用一种或多种根据本发明的离体方法改性的细胞。还提供一种或多种细胞，其已根据本发明的离体方法改性，以用于通过治疗处理人体或动物体的方法中，例如用于治疗癌症。

以下实施例说明本发明。

实施例

材料和设备

除非另有说明，否则所有化学品从公司例如Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、FluoroChem、Repligen和VWR获得或可得自这些公司。

洗涤方案

洗涤方案A

用等体积的去离子水替换反应介质并循环1小时。再次重复冲洗程序。最后，在从反应容器取出之前，材料用等体积的乙醇水溶液(2:1-H₂O:EtOH)处理。

洗涤方案B

用等体积的去离子水替换反应介质并循环1小时。此后，用0.01M HCl替换洗涤介质，将其循环1小时，此时用0.001M HCl替换它并循环1小时。最后，用2:1的H₂O:EtOH混合物替换介质，其循环1小时。然后将经衍生的纳米纤维从反应容器取出。

洗涤方案C

用等体积的温热(60℃)去离子水:丙酮的1:1混合物替换反应介质，循环30分钟。洗涤程序再重复两次。最后，用2:1的H₂O:EtOH混合物替换介质，将其循环1小时。然后将经衍生的纳米纤维从反应容器取出。

洗涤方案D

将2升超纯水泵送通过纳米纤维材料。

洗涤方案E

用等体积的1:1去离子水:EtOH替换反应介质并循环1小时。洗涤程序再重复两次。最后，用2:1的H₂O:EtOH混合物替换介质，将其循环1小时。然后将经衍生的纳米纤维从反应容器取出。最后，用2:1的H₂O:EtOH混合物替换介质，将其循环1小时。然后将经衍生的纳米纤维从反应容器取出。

洗涤方案F

用超纯去离子水替换反应介质。将纳米纤维材料在该清洁水中温和搅拌30分钟。此后，替换洗涤介质并重复洗涤循环。

洗涤方案G

倒出反应介质，且烧杯用水补充直至流出物的pH为中性或微酸性。

I 材料的制备

制备实施例1

在静电纺丝以产生300-600nm范围的直径的纤维之前，将相对分子质量为29,000g/mol的乙酸纤维素溶液溶解在普通溶剂中。纳米纤维产生的优化条件可以在例如O. Hardick等人, J.Mater. Sci. 46 (2011) 3890中发现，其整体通过引用并入本文。将约20g/m²材料的片分层并进行组合的加热和压制处理。

参考实施例1-三甲基氯化铵官能化

纳米纤维材料根据下面概述的方案衍生：

步骤(i)：乙酸纤维素(CA)皂化成再生纤维素(RC)

将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片(44*32mm*150mm)置于含有5L 0.075M氢氧化钠的2:1-水:乙醇溶液的大烧杯中。将反应混合物在室温下循环48小时。然后根据洗涤方案A洗涤材料。

步骤(ii)：缩水甘油基三甲基氯化铵衍生化

将步骤(i)中获得的材料悬浮在1升0.5M NaOH中。在以单份加入缩水甘油基三甲基氯化铵(25mL，100mL)前将反应介质循环15分钟。将反应介质在室温下再循环16小时。然后根据洗涤方案B洗涤材料。

通过以下方法确定三甲基氯化铵含量。50mg材料在布氏过滤漏斗上用100mL 0.1MHCl溶液洗涤，且然后用另外的100mL 0.01M HCl溶液洗涤。然后将该材料置于75℃的干燥烘箱中并干燥至恒重，然后撕成小块，且然后置于50mL离心管中。然后加入小磁力搅拌棒和15mL去离子水以及约1mL(经由橡皮头移液管加入)铬酸钾溶液，使混合物颜色变成黄色。将混合物剧烈搅拌20分钟，然后用0.1M硝酸银滴定。滴定的终点通过从透明黄色到雾状棕色的颜色变化来识别。

三甲基氯化铵含量(μmol/g)计算为到达终点所加入的硝酸银的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数。

发现用25mL GMAC处理的样品的三甲基氯化铵含量(μmol/g)为308。发现用100mLGMAC处理的样品的三甲基氯化铵含量(μmol/g)为775。

制备实施例3-缩水甘油/三甲基氯化铵官能化

纳米纤维材料根据下面概述的方案衍生：

步骤(i)：乙酸纤维素(CA)皂化成再生纤维素(RC)

将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片(44*32mm*150mm)置于含有5L 0.075M氢氧化钠的2:1-水:乙醇溶液的大烧杯中。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案A洗涤材料。

步骤(ii)：缩水甘油聚合

将来自(i)的材料悬浮在1L的0.5M NaOH中。在以单份小心加入缩水甘油(180mL)前将反应介质循环15分钟。将反应介质在室温下循环16小时，且随后根据洗涤方案B洗涤该材料。

步骤(iii)：缩水甘油基三甲基氯化铵衍生化

步骤(ii)中获得的材料通常悬浮在1升0.5M NaOH中。在以单份加入缩水甘油基三甲基氯化铵(50mL，100mL)前将反应介质循环15分钟。将反应介质在室温下再循环16小时。然后根据洗涤方案C洗涤材料。

使用来自制备实施例2的方法确定三甲基氯化铵含量。

发现用50mL GMAC处理的样品的三甲基氯化铵含量(μmol/g)为523。发现用100mLGMAC处理的样品的三甲基氯化铵含量(μmol/g)为775。

制备实施例4-腺病毒(AV)媒介的制备

从已知方法类推地制备腺病毒媒介。

因此，腺病毒媒介在HEK-293细胞培养物中产生。腺病毒媒介产生方法在第一卷：Adenoviruses, Ad Vectors, Quantitation, and Animal Models 编者: William S. M.Wold, Ann E. Tollefson ISBN:978-1-58829-598-9 (印刷) 978-1-59745-166-6 (在线)中讨论。使用冻融循环裂解细胞，并使用离心纯化所得材料，然后用DNAse(benzonase)处理(Wright等人, 2005)。将所得材料透析到10mM Tris缓冲液中。

制备实施例5-腺相关病毒(AAV)媒介的制备

从已知方法类推地制备含有由编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA序列组成的有效载荷的腺相关病毒媒介。

因此，在HEK-293细胞培养物中产生腺相关病毒媒介(Martin Lock等人, 2010)。将细胞裂解，且使用过滤纯化所得材料，然后用DNAse(benzonase)处理(Wright等人,2005)，随后进行尺寸排阻色谱(Chromatographic purification of recombinantadenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications；GeneTherapy (2005) 12, S5–S17. doi:10.1038/sj.gt.3302611；http://www.nature.com/gt/journal/v12/n1s/full/3302611a.html)。将所得材料透析到pH 8的Bis Tris Propan10mM中。

制备实施例6-腺相关病毒(AAV)媒介的备选制备

如上文讨论从已知方法类推地制备含有由编码绿色荧光蛋白(GFP)的DNA序列组成的有效载荷的腺相关病毒媒介。

因此，在HEK-293细胞培养物中产生腺相关病毒媒介。裂解细胞，并使用过滤(0.45μm，0.22μm)纯化所得材料。将所得材料透析到pH 8的Bis Tris Propan 10mM中。

II材料分析

分析实施例1-色谱材料的DBC

使加载材料通过包含在AKTA Pure系统(GE Healthcare)上的保持器内的选定的官能化纳米纤维盘。在确定的膜体积每分钟流速(mV/min)下加载材料，直到保持器出口后的浓度超过加载的10%，如通过UV流动池确定。考虑到系统和保持器设备中的死体积，通过Unicorn软件(GE Healthcare)中的色谱图分析确定在10%穿透时加载到盘上的蛋白质的总量。

对于阴离子交换材料，加载材料达pH 8的10mM Tris中的1mg/mL BSA。

确定制备实施例2和3的各种材料的DBC。测试的材料作为下表1中的材料1至4示出且DBC示于图1中。

表1：BSA结合容量

从图1中可以看出，增加材料的电荷密度增加BSA的DBC。增加与材料共价结合的聚合物的量也增加BSA的DBC。BSA的最高容量是最低的7.6倍。

II病毒材料的分离

实施例1-腺病毒材料(AV)的分离

使用制备实施例2和3中产生的材料对制备实施例4中产生的腺病毒材料进行结合-洗脱色谱分离方法。

以下色谱方法用于分离。

表2：色谱方法1

色谱图分析

在图2至4中比较材料1至4的所得色谱图。

图2比较材料1和2。这表明未接枝材料的电荷密度的增加明显改变色谱图的形状。使用材料2的色谱图中似乎还存在第二物类。

对于聚合物链共价结合(接枝)的材料，看到相反的关系。图3比较材料3和4。这证实，对于接枝材料，当吸附剂(对于BSA)的电荷密度和结合容量增加时，分离的表观拆分率降低。

当比较相同电荷密度的接枝和未接枝材料时，可以看出，对于未接枝的材料，实现更好的拆分，且使用具有更高电荷密度的材料改善物类的拆分。

图4比较材料2和4。

腺病毒容量数据

比较四种不同色谱方法(使用材料1至4)的总洗脱面积以确定材料的容量。结果在图5中显示。由此可以看出，最高结合材料结合的AdV是最低结合材料的1.8倍。

出乎意料的是，与对BSA的相同材料的容量差异(其中最强和最弱结合之间的差异为7.6x)相比，对AdV制备的容量差异要不明显得多。

这表明，针对小分子例如BSA(66KDa)的高结合容量而优化的材料可能不适合结合和分离数量级大许多(20-110nm)的大媒介材料。

实施例2-腺相关病毒(AAV)材料的分离

使用根据制备实施例2的方法产生的具有820μmol/g电荷密度的材料对制备实施例5中产生的腺病毒材料进行结合-洗脱色谱分离方法。其使用120mL GMAC，使用制备实施例2的方法制备。

以下色谱方法用于分离。

表3：色谱方法2

色谱图分析

所得色谱图如图6所示。这显示两个清晰的峰，它们被认为是装填和未装填的媒介材料。其使用已知技术(Western印迹和PCR)进一步分析。

Western印迹分析

使用已知方法(例如，如在http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/wb-beginner.pdf中所讨论的)经由western印迹分析AAV媒介衣壳蛋白的来自图6的峰1和2。Western印迹迹线如图7所示。由此可以看出，存在于载荷中的衣壳蛋白也存在于峰1和峰2中。

PCR分析

对来自图6的峰1和2的级分进行PCR分析以扩增GFP DNA序列。这使用已知方法(MartinLock等人, 2010)进行。

PCR分析的结果如图8所示。这清楚地表明是峰2包含GFP DNA序列。这澄清了是峰2包含主动装填媒介。然而，峰1不含有GFP DNA序列。

将图7和8联系在一起，显然本发明的色谱分离方法已将装填和未装填的媒介材料的混合物分离成含有DNA的装填媒介和不含DNA有效载荷的媒介。返回参考图6，显然装填和未装填的峰都在小于6mS的电导率下洗脱。

实施例3-本发明的方法与CsCl梯度离心的比较

使用与上述实施例2相同的材料和方法对制备实施例6中产生的腺病毒材料进行结合-洗脱色谱分离方法。

使用260nm和280nm信号之间的特征关系识别的装填峰(如图6所示)被收集并透析到Bis Tris Propan 10mM pH 8中。

使用已知方法(Martin Lock等人, 2010)对相同腺病毒材料的单独样品(制备实施例6中产生)进行CsCl梯度离心分离。经由该方法获得装填和未装填的病毒材料二者(透析到Bis Tris Propan 10mM pH 8中)并分别识别为CsCl-装填和CsCl未装填。然后将该材料与使用本发明的方法分离的材料进行比较。

使用与实施例2中所示相同的材料和方法分析来自本发明的色谱分离的纯化的装填材料。本质上，使用相同的材料和方法，但是作为分析色谱而不是制备色谱。产生色谱图以表征材料。

以相同的方式分析CsCl装填材料。产生色谱图以表征材料。

装填材料和CsCl装填材料的色谱图如图9叠加显示。由此可以看出，两条迹线之间存在高水平的相似性，证实两种方法的产品可相比。

为了进一步比较CsCl方法和本发明的方法，将CsCl未装填材料与装填材料混合，并以与上述装填材料和CsCl装填材料相同的方式分析所得混合物。

产生色谱图。在图10中比较装填峰和污染物峰的相对大小。

由此可以看出，CsCl未装填材料中的掺加对装填峰的大小没有贡献。这证实装填峰(以及因此使用本发明的方法获得的装填级分)不含有未装填的媒介。从图10中还可以看出，CsCl未装填材料显著有助于污染物峰。这表明使用本发明产生的装填峰(以及因此的级分)具有高纯度。

参考文献

本文引用的所有参考文献均通过引用并入本文。

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Claims (41)

1. 从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，

其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且

其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都实质上不含多核苷酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都能够感染细胞。

3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒产品包含许多病毒媒介，每一种都含有一种或多种转基因多核苷酸。

4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都不能感染细胞。

5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述产品相关杂质包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒样颗粒、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都缺乏完整病毒基因组。

6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒选自腺病毒、腺相关病毒和慢病毒。

7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒选自腺相关病毒。

8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质由一种或多种非织造聚合物纳米纤维形成。

9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种聚合物纳米纤维用一种或多种配体基团官能化，所述配体基团可以是相同或不同的，且使得包含所述一种或多种配体基团的聚合物纳米纤维适合用作色谱介质。

10.根据权利要求9的方法，其中可以是相同或不同的所述一种或多种配体基团结合到所述一种或多种聚合物纳米纤维。

11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种聚合物纳米纤维具有与其共价结合的一个或多个聚合物链，所述聚合物链可以是相同或不同的。

12.根据权利要求11的方法，其中可以是相同或不同的所述一个或多个聚合物链具有与其结合的一种或多种配体基团，所述配体基团可以是相同或不同，且使得包含所述一个或多个聚合物链和所述一种或多种配体基团的所述聚合物纳米纤维适合用作色谱介质。

13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质适合用于选自离子交换、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法。

14.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质具有50μmol/g至1,500μmol/g官能化色谱介质的配体基团密度。

15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质具有至多50mg/mL(10%穿透)的动态结合容量。

16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述组合物具有溶解盐浓度，使得电导率低于30mS/cm。

17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质是膜或片的形式。

18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质为膜或片的形式，且将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器。

19.根据权利要求18的方法，其中将所述组合物通过所述保持器，使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。

20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使所述组合物与所述官能化色谱介质接触一分钟或更少的时间段。

21.根据前述权利要求中任一项的方法，包括以下步骤：

(i)使所述组合物与所述官能化色谱介质接触；

(ii)任选地用低离子浓度的液相洗涤所述官能化色谱介质；和

(iii)通过使所述官能化色谱介质与离子强度渐增的液相接触，选择性洗脱所述病毒产品和所述产品相关杂质。

22. 根据权利要求1至20中任一项的方法，包括以下步骤：

(i)使包含所述组合物的溶液与所述官能化色谱介质接触；和

(ii)收集在步骤(i)中已接触所述官能化色谱介质的溶液，所述溶液包含所述病毒产品。

23.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述聚合物纳米纤维是纤维素纳米纤维。

24.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述官能化色谱介质用一种或多种带电荷的基团官能化。

25.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种多核苷酸是选自DNA和RNA的一种或多种核酸，包括siRNA。

26.从如权利要求1和16中任一项所限定的组合物回收权利要求1至3、6和7中任一项所限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如权利要求1和4至7中任一项所限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与不耐盐的色谱介质接触，其中所述不耐盐的色谱介质能够以小于10mS/cm的电导率洗脱所述病毒产品。

27.从如权利要求1和16中任一项所限定的组合物回收权利要求1至3、6和7中任一项所限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如权利要求1和4至7中任一项所限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触，并将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器，

其中将所述组合物通过所述保持器，使得(a)通过所述一个或多个膜或片的路径长度小于2mm或(b)通过膜、片、熔料和其他隔离材料的总路径长度小于50mm。

28.从如权利要求1和16中任一项所限定的组合物回收权利要求1至3、6和7中任一项所限定的病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和如权利要求1和4至7中任一项所限定的产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与膜或片形式的色谱介质接触，并将所述组合物通过包含一个或多个所述膜或片和任选的一个或多个熔料或其他隔离材料的保持器，

其中所述组合物与色谱介质接触一分钟或更少的时间段。

29.根据前述权利要求中任一项的方法，其中收集所述产品相关杂质作为第二产品。

30. 从组合物回收病毒产品的方法，所述组合物包含所述产品和非产品相关杂质，所述方法包括使所述组合物与包含一种或多种聚合物纳米纤维的官能化色谱介质接触，

其中所述病毒产品包含许多病毒、病毒颗粒/病毒粒子、病毒核心、膜剥离的病毒、去除外膜和/或去除衣壳的病毒核心、或原病毒，其每一种都包含一种或多种多核苷酸，且

其中所述非产品相关杂质包括细胞和/或细胞组分例如脂质，宿主细胞蛋白和/或宿主细胞生长培养基的其他组成部分例如蛋白质和/或糖。

31.通过前述权利要求中任一项的方法可获得或获得的病毒产品。

32.通过权利要求1至29中任一项的方法可获得或获得的产品相关杂质。

33.一种组合物，其包含权利要求31所限定的病毒产品联合药学上可接受的载体或稀释剂。

34.一种组合物，其包含权利要求32所限定的产品相关杂质联合药学上可接受的载体或稀释剂。

35.一种微生物处理、接种或基因治疗的方法，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的如权利要求31所限定的病毒产品或如权利要求33所限定的组合物。

36.如权利要求31所限定的病毒产品或如权利要求33所限定的组合物，用于微生物处理、接种或基因治疗的方法。

37.将多核苷酸插入细胞的离体方法，所述方法包括使细胞与权利要求31所限定的病毒产品接触。

38.通过权利要求37的方法获得或可获得的细胞。

39.一种处理方法，包括向需要其的患者施用一种或多种如权利要求38所限定的细胞。

40.如权利要求38所限定的细胞，用于通过治疗来处理人体或动物体的方法。

41.如权利要求38所限定的细胞，用于处理癌症。