CN104017805B - 核苷酸、包括其的重组载体、细胞、组合物及它们的应用 - Google Patents

核苷酸、包括其的重组载体、细胞、组合物及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种核苷酸，其中，所述核苷酸的序列选自由SEQ ID Nos.1‑19所示的核苷酸序列以及分别与之相比具有至少80％同源性的核苷酸序列所组成的组中。本发明还提供了包括所述核苷酸的重组载体、含有该重组载体的细胞、含有它们的药物组合物，以及它们的应用。本发明通过分别将具有选自由SEQ ID Nos.1‑19所组成的组中所示的核苷酸序列以及分别与之相比具有至少80％同源性的核苷酸序列的核苷酸导入病毒载体中，然后将负载有本发明核苷酸的病毒载体再分别导入宿主体内细胞中持续表达多肽，从而起到治疗眼科疾病尤其是治疗伴随眼组织细胞凋亡变性疾病的作用。

Description

核苷酸、包括其的重组载体、细胞、组合物及它们的应用
本申请为申请号为201210078288.5、发明名称为核苷酸、包括其的重组载体、细胞、组合物及它们的应用的专利申请的分案申请
技术领域
本发明涉及一种核苷酸、包括所述核苷酸的重组载体、含有该重组载体的细胞、含有选自它们中一种或几种的药物组合物、以及它们的应用。具体地，本发明涉及一种治疗眼科疾病的核苷酸、包括所述核苷酸的重组载体、含有该重组载体的细胞、含有选自所述核苷酸、重组载体和细胞中一种或几种的药物组合物、以及所述核苷酸、重组载体和细胞在制备治疗眼科疾病的药物中的应用。
背景技术
对于眼科领域的疾患而言，不适当的治疗会导致致盲性重症的发生。由于缺乏根本性的治疗方法，不得不依赖对症疗法治疗的眼科疾病不在少数。最近，发现眼科领域中一部分重症疾病的发生和恶化是与细胞凋亡相关的。
视网膜色素变性，是一种具有明显家族遗传倾向的神经退行性疾病，是由于视网膜上的视神经细胞层和色素上皮层广泛受损而导致细胞死亡的一种难治性疾病。该病病程发展较为缓慢，视细胞变性过程可长达数年至数十年，一般在30岁以前发病，最常见于儿童或青少年起病，至青春期症状加重，到中老年时期视力几乎全部丧失。流行病学调查显示我国该病的群体发病率为1/3500，全国约有50-100万患者，这给患者家庭和社会都造成了沉重的经济负担和社会负担。
青光眼是指视神经乳头及视野的特征形变化至少出现了一项，通常情况下，通过充分降低眼内压可以改善视神经损害或者阻止进一步恶化的眼部功能性结构异常为特征的疾患。关于青光眼，如果不能够得到适当的治疗，常常会导致失明，青光眼引起的失明占我国后天失明原因的第二位。据报道40岁以上的人群中大约5.8％患有青光眼，依据2000年的统计，我国的40岁以上的人口大约有6500万人来推算，40岁以上的青光眼患者超过370万人。这也给患者家庭和社会都造成了沉重的负担。
基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗疾病的措施。
目前采用何种基因对眼科疾病进行持续有效的基因治疗属于亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于采用何种基因对眼科疾病进行持续有效的基因治疗。
本发明提供了一种治疗眼科疾病的核苷酸，所述核苷酸的序列选自由以下核苷酸序列所组成的组中：
(1)SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列；以及
(2)分别与SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列相比具有至少80％同源性的核苷酸序列。
本发明还提供一种治疗眼科疾病的重组载体，所述重组载体包括载体及其携带的外源基因，其中，所述外源基因为本发明所述的核苷酸。
本发明还提供了一种治疗眼科疾病的细胞，其中，所述细胞含有本发明的重组载体。
本发明还提供了一种治疗眼科疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，以及选自上述重组载体和细胞中一种或几种。
本发明还提供了所述核苷酸、重组载体和细胞分别在制备治疗眼科疾病的药物中的应用。前述应用中所述的眼科疾病为伴随眼组织细胞凋亡变性的疾病，优选青光眼、视网膜色素变性、视网膜脱落和视网膜缺血性疾患，最优选可以为视网膜色素变性。
本发明通过分别将具有选自由SEQ ID Nos.1-19所组成的组中所示的核苷酸序列以及分别与SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列相比具有至少80％同源性的核苷酸序列导入上述载体中，然后将负载有本发明核苷酸的载体再分别导入宿主体内细胞中持续表达多肽，从而起到治疗眼科疾病尤其是青光眼、视网膜色素变性、视网膜脱落和视网膜缺血性疾患的作用，最优选可以为视网膜色素变性。
附图说明
图1通过光学显微镜得到的重组腺相关病毒治疗的视神经细胞核计数结果柱状图；
图2通过光学显微镜得到的重组慢病毒治疗的视神经细胞核计数结果柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种治疗眼科疾病的核苷酸，所述核苷酸的序列选自由以下核苷酸序列所组成的组中：
(1)SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列；以及
(2)分别与SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列相比具有至少80％同源性的核苷酸序列。
所述(2)中优选地分别与SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列相比具有至少85％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少90％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少91％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少92％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少93％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少94％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少95％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少96％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少97％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少98％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99.5％同源性的核苷酸序列。
所述核苷酸的序列优选选自由以下核苷酸序列所组成的组中：
(1)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；以及
(2)分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列相比具有至少90％同源性的核苷酸序列，尤其优选为SEQ ID NO：5。
所述(2)中优选地分别与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列相比具有至少91％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少92％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少93％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少94％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少95％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少96％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少97％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少98％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99.5％同源性的核苷酸序列。
所述核苷酸的序列优选选自SEQ ID NO：8-19所示的核苷酸序列以及分别与SEQID Nos.8-19所示的核苷酸序列相比具有至少90％同源性的核苷酸序列所组成的组中，其中进一步优选以下核苷酸序列所组成的组中：
(1)SEQ ID No:8和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；以及
(2)分别与SEQ ID No:8和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列相比具有至少90％同源性的核苷酸序列。所述(2)中优选地分别与SEQ ID No:8和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列相比具有至少91％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少92％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少93％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少94％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少95％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少96％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少97％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少98％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99％同源性的核苷酸序列，更优选具有至少99.5％同源性的核苷酸序列。最优选SEQID NO：8。还优选SEQ ID NO：17。
本发明还提供一种治疗眼科疾病的重组载体，所述重组载体包括载体及其携带的外源基因，其中，所述外源基因为本发明所述的核苷酸。所述载体选自由DNA载体和病毒载体所组成的组中。所述DNA载体选自由DNA质粒载体、结合其的脂质体、结合其的分子耦联体和结合其的多聚物所组成的组中；所述病毒载体选自由腺相关病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体所组成的组中。其中，所述外源基因还可以包括调控序列，例如所述一种或几种外源基因表达的启动子、终止子和增强子。所述外源基因也可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白的基因)或其产物调节其它基因表达的基因。所述外源基因除可以是DNA外，还可以是mRNA、tRNA或rRNA，还可以包括通常与转录序列相关的转录调控序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。
所述载体可以是本领域常用的各种能携带外源基因的载体以及技术发展改进的可用的各种能携带外源基因的载体。所述载体例如，质粒(裸DNA)、脂质体、分子耦联体、多聚物和病毒载体。
所述质粒(裸DNA)载体可以携带目的基因，该携带有目的基因的质粒载体可以直接注射或通过基因枪、电穿孔及电融合技术导入到组织细胞中。此外，超声波有助于提高质粒的转移效率。超声波配合微泡回声比差剂可提高细胞膜的通透性，从而显著提高裸DNA的转移和表达效率。这项胞膜渗透技术可在细胞膜表面瞬间制造小孔，DNA则趁机进入细胞内。
所述脂质体是由脂质双分子层组成的颗粒，可介导目的基因或携带目的基因的质粒载体穿过细胞膜。所述脂质可以是来源于蛋黄和大豆的以卵磷脂(磷脂酰胆碱，PC)为主的天然磷脂；也可以是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等合成磷脂；还可以含有胆固醇。优选的脂质体为阳离子脂质体，其主要由带正电荷的脂类及中性辅助脂类以等摩尔混合而成。该带正电荷的脂质体与带负电荷的DNA之间可有效地形成复合物，并通过内吞作用移入细胞内。
所述分子耦联体是将携带目的基因的质粒载体共价结合到细胞表面特异受体的配基或单克隆抗体或病毒胞膜蛋白上，利用特异的结合特性介导外源性基因导入至特定类型的细胞中。
所述多聚物，即利用阳离子多聚体，如多聚左旋赖氨酸上的正电荷与质粒载体上的负电荷结合发生电性中和胍，而形成稳定的多聚物/DNA复合物。所得阳离子多聚体与DNA的复合物仍带正电荷，可与细胞表面带负电荷的受体结合，而被渗入至细胞内。
病毒通常可以高效率地进入特定的细胞，表达自身蛋白，产生新的病毒粒子，因此，被改造的病毒首先成为了基因治疗的载体。例如，逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)、腺病毒载体、腺相关病毒载体及单纯疱疹病毒载体等。
所述载体优选选自由腺相关病毒载体和慢病毒载体所组成的组中。
其中，所述腺相关病毒属于非致病性的微小病毒科家族成员，只有依赖于辅助病毒才可能增殖。腺相关病毒基因组很小，如2型腺相关病毒是由4681个核苷酸组成的单链DNA，包含2个基因，即rep基因(编码负责调节病毒复制、结构基因表达和整合到宿主基因组中的蛋白)及cap基因(编码衣壳结构蛋白)，基因组的1个末端存在1个145bp的末端重复区。腺相关病毒可感染分裂期及静止期细胞，能插入到宿主细胞染色体内，或以染色体外串联体DNA的形式长期稳定表达，可有效地转导脑、骨骼肌及肝脏等类型的细胞，具有抗原性、毒性小及不致病等特点。
本发明的优选载体为腺相关病毒载体。其具有安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。
优选的载体可以为慢病毒载体。慢病毒类包括一系列感染灵长类动物的病毒如人类免疫缺陷病毒HIV-1和HIV-2，猴免疫缺陷病毒SIV，和感染非灵长类动物的病毒如梅迪/维斯那病毒(MVV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、和牛免疫缺陷病毒(BIV)。慢病毒家族中HIV-1和HIV-2、SIV、FIV、EIAV和CAEV等被研究用作基因治疗的载体。而基因治疗潜在靶细胞许多为非分裂细胞，主要有肝细胞、神经元细胞、造血干细胞、肌细胞、巨噬细胞等，慢病毒可以介导目的基因高效转导非分裂细胞，因此在人类基因治疗方面逐渐受到重视。
本发明还提供了一种治疗眼科疾病的细胞，其中，所述细胞含有本发明的重组载体。这里所述的“治疗眼科疾病的细胞”不仅包括直接施用于受治者的含有本发明重组载体的细胞；还包括在实现治疗过程中所使用到的细胞，例如用于扩增培养本发明重组载体的细胞，但该细胞并不直接用于给药于受治者。所述细胞可以是内源性(来自受治者本身的细胞)，也可以是外源性的(例如来自同种异体的细胞甚至异种细胞，其中包括可商购的细胞系)。所述细胞选自293T细胞、多能干细胞、视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、结膜上皮细胞和视网膜感光细胞中的一种或几种。所述多能干细胞优选选自神经干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞和角膜缘干细胞中的一种或几种。
所述直接施用于受治者的含有本发明重组载体的细胞在用于治疗眼科疾病时，常用的方法例如：①自体移植：取材于患者自体，优点是无免疫排斥反应。缺点是供材有限，需要较好的分离培养技术。②同种异体移植：取自他人组织，例如可以来自新鲜尸体(与角膜移植所需要求相当)，也可取自患者亲属(活体)，还可以购自商业上可供的细胞系。优点是供材较易；缺点是可出现免疫排斥反应。③异种移植：取自其他动物，通常有更明显的排斥反应，需用组织工程方法加以克服。其中，所述细胞优选视网膜色素上皮细胞。例如视网膜色素上皮细胞ARPE-19可以作为本发明真核表达载体的宿主细胞。所述视网膜色素上皮细胞可以是商购的细胞系，也可来自于例如视网膜色素变性患者的受治者。在基因治疗过程中，优选来自于受治者自体的视网膜色素上皮细胞ARPE，导入含本发明的核苷酸的重组载体后，重新移植至该受治者不容易发生免疫排斥反应。
本发明还提供了一种治疗眼科疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，以及选自上述重组载体和细胞中一种或几种。优选地，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的赋形剂以及选自本发明所述的重组载体和本发明所述的细胞中的一种或几种。
优选地，所述药学上可接受的赋形剂为维持所述药物组合物pH为7.2～7.6的10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，优选地PH为7.4；每毫升注射液中含有106-1012vg的所述重组载体，优选地每毫升注射液中含有1010vg的所述重组载体。
优选地，所述药学上可接受的赋形剂为pH值为5.0-9.0的磷酸缓冲液；每毫升注射液中含有106-1012vg的所述重组载体，优选地每毫升注射液中含有1010vg的所述重组载体。
所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾和/或氯化镁。
使用所述注射液时，每次给予受治个体106-1012vg的所述重组载体，优选108-1011vg，更优选1010-1011vg，尤其优选108；进一步优选所述重组载体是重组腺相关病毒载体，每次给予受治个体106-1012vg的该腺相关病毒载体，优选108-1011vg，更优选1010vg。当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，至多300微升、一般1-200微升、优选50-150微升；如选择视网膜下腔注射方式时，人每只眼睛一次注射剂量为50～150微升，优选100微升。本发明所述注射液给药次数可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。本发明所述注射液给药次数为多次，优选为1～5次，最优选为1次。因为本领域技术人员能够容易地确定最佳给药途径和剂量，所以所述给药途径和剂量仅作为参考。所述剂量可以根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症、疾病或病症的严重程度以及给药途径来确定。本发明所述药物组合物注射液也可以系统给药，也可以将本发明的药物组合物注射液注射到局部部位(例如，视网膜下腔给药)。在视网膜下腔给药的情况下，所述的给药1次是指每给药1只患病眼为1次，优选给药次数为1次。
本发明还提供了所述核苷酸、重组载体和细胞分别在制备治疗眼科疾病的药物中的应用。前述应用中所述的眼科疾病为伴随眼组织细胞凋亡变性，尤其优选青光眼、视网膜色素变性、视网膜脱落和视网膜缺血性疾患。前述应用中所述的眼科疾病最优选可以为视网膜色素变性。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例中采用的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆实验指南》第三版。
实施例1化学合成本发明核苷酸
交由大连宝生物公司分别合成SEQ ID Nos.1-19，并在它们两端加上合适的限制内切酶酶切位点Cla I(ATCGAT)和BglII(AGATCT)，连于pMD-18T载体上，分别记为pMD-18T-S1、pMD-18T-S2、pMD-18T-S3、pMD-18T-S4、pMD-18T-S5、pMD-18T-S6、pMD-18T-S7、pMD-18T-S8、pMD-18T-S9、pMD-18T-S10、pMD-18T-S11、pMD-18T-S12、pMD-18T-S13、pMD-18T-S14、pMD-18T-S15、pMD-18T-S16、pMD-18T-S17、pMD-18T-S18和pMD-18T-S19。经测序，合成序列SEQ ID Nos.1-19正确。
实施例2重组腺相关基因转移载体(以下简称AAV)的构建
1)将pMD-18T-S1转化感受态大肠杆菌DH5a，在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基平板上过夜培养，长出的阳性克隆在含氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用质粒提取试剂盒提取pMD-18T-S1，提取产物送测序公司测序，确认连入的序列正确，测序结果正确的置-80℃保存备用；
2)用限制性内切酶Cla I(ATCGAT)和BglII(AGATCT)将SEQ ID No:1片段从pMD-18T-S1载体中切出，凝胶电泳回收目标产物SEQ ID No:1片段各30ul；
3)用限制性内切酶酶Cla I(ATCGAT)和BglII(AGATCT)酶切pAAV-hrGFP(Stratagene公司)，凝胶电泳回收载体片段各50ul；
4)在T4连接酶的作用下将步骤2)回收的SEQ ID No:1片段与步骤3)回收的载体片段连接，按照上述1)中的方法进行转化测序，确认连入的序列正确。
鉴定正确的即为腺相关病毒外源基因转移载体pAAV-S1，-80℃下保存备用。
按照上述方法制备获得其余十八个序列的腺相关病毒外源基因转移载体pAAV-S2、pAAV-S3、pAAV-S4、pAAV-S5、pAAV-S6、pAAV-S7、pAAV-S8、pAAV-S9、pAAV-S10、pAAV-S11、pAAV-S12、pAAV-S13、pAAV-S14、pAAV-S15、pAAV-S16、pAAV-S17、pAAV-S18、pAAV-S19。
负载有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ IDNo.18和SEQ ID No.19的腺相关病毒载体(pAAV)分别与腺相关病毒外源基因转移载体pAAV-S1、pAAV-S2、pAAV-S3、pAAV-S4、pAAV-S5、pAAV-S6、pAAV-S7、pAAV-S8、pAAV-S9、pAAV-S10、pAAV-S11、pAAV-S12、pAAV-S13、pAAV-S14、pAAV-S15、pAAV-S16、pAAV-S17、pAAV-S18和pAAV-S19相对应。
实施例3携带治疗基因的rAAV载体的大量制备及浓缩
3-1、携带SEQ ID No:1片段的rAAV-S1载体制备
以改造型基因转移载体pAAV-S1、Cap/Rep辅助质粒R2C2、腺病毒辅助病毒(pAdhelper)3种质粒系统(stratagene公司，AAV Helper-Free System)为基础，对AAV载体进行制备。携带治疗基因的载体以每20个15cm培养皿为单位进行生产。按照每一个15cm的塑料培养皿接种大约107的293T细胞，培养24小时后，将培养基用OPTI-MEM培养基置换，在37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育，准备用于转染。准备转染复合物，用磷酸钙转染试剂进行转染。转染后的次日，用新鲜的30ml含10％胎牛血清的DMEM培养基进行交换培养。转染两天后，回收上清和细胞。参照吴小兵等的文献(吴小兵等，一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通讯，2000，45(19)，2071-2075)进行高速分离纯化rAAV-S1载体，得到浓缩和纯化的病毒液。将病毒液用孔径为0.45μm的过滤器进行过滤，滤液经阳离子柱(SPsepharose 4FF)纯化(上样流速5ml/min)，D-PBS洗至平衡，用含1mol/l的NaCl的D-PBS溶液洗脱，用超滤管(100KD，milipore)2000rpm/min超滤3min后，再用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤。收集滤液，滤液中的AAV病毒载体保存在D-PBS中。分装后在在-80℃下进行保存，取其中一份进行滴度检测。
按照上述方法大量制备携带SEQ ID Nos.2-19片段的rAAV-S2--19载体及不携带目的基因的空载体pAAV-hrGFP的病毒液。
3-2、滴度测定
使用点杂交方法测定AAV载体滴度的含义为每ml病毒液中含有病毒颗粒的基因组拷贝数(vector genomes/ml，简称vg/ml)。用负载有人源化绿色荧光蛋白的病毒载体pAAV-hrGFP(Stratagene公司)作为AAV载体滴度测定的标准品，用启动子/目的基因序列标记探针与标准和供试样品在膜上进行杂交，通过比较杂交膜上待测样品与标准系列的杂交信号的强弱，判断待测的AAV载体样品点所含启动子/目的基因的拷贝数，从而推算出AAV载体滴度(vg/ml)。载体滴度测定所需溶液：
1)预杂交液：
5×SSC、1％(W/V)封阻试剂(Roche公司，Cat#11096176001)、0.1％(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠和0.02％(W/V)SDS。
2)杂交液：
5×SSC、1％(W/V)封阻试剂、0.1％(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠、0.02％(W/V)SDS和新变性的探针DNA(20ul)(探针现用现加)。
3)2×SSC/0.1％(W/V)SDS
用5×SSC和10％的SDS按比例稀释成2×SSC/0.1％(W/V)SDS。
4)0.1×SSC/0.1％SDS
用5×SSC和10％的SDS按比例稀释成0.1×SSC/0.1％(W/V)SDS。
5)缓冲液1
顺丁烯二酸(100mmol/L)；NaCl(150mmol/L)；pH7.5(20℃)。
6)缓冲液2
1％(W/V)封阻试剂，配制于缓冲液1中。
7)缓冲液3
Tris-HCl(100mmol/L)；NaCl(100mmol/L)；pH9.5(20℃)。
8)缓冲液4
Tris-HCl(10mmol/l)；EDTA(1mmol/L)；pH8.0(20℃)。
9)显色溶液
新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μl NBT溶液(Roche公司，Cat#11383213001)和35μl BCIP(Roche公司，Cat#11383221001)。
10)5mol/L LiCl。
3-2-1探针标记与纯化
1)PCR方法探针标记
反应体系如下所示：
补ddH2O至总体积为50μl。
其中，上游引物：5’-GTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA-3’
下游引物：5’-GGTCCCGGTGTCTTCTATGGA-3’。
反应条件：
94℃，300s；94℃，30s；55℃，30s；72℃，1分钟；--30个循环的72℃，300s。
其中，所使用的PCR仪为TECHNE Techgene公司的仪器编号为PCR-02～04的仪器。
2)探针的纯化
a)向50μl的PCR反应溶液中加入4μl 5mol/L LiCl和150μl预冷(0℃下20分钟)的无水乙醇，置于-70℃30分钟或-20℃2h。
b)4℃以12000rpm离心10分钟，沉淀加入200ul70％乙醇水溶液轻轻上下颠倒2次，4℃以12000rpm离心5分钟，吸弃上清，重复离心1次。
c)室温下干燥10分钟，用20μl pH8.0的TE缓冲液溶解沉淀。置-20℃保存备用。
3-2-2样品和标准品的预处理
a)取3-1中制备的待检载体10μl，加入9μl ddH2O、1μl DNaseI(SIGMA公司)，至总体积20μl。37℃孵育1h。
b)将标准品经紫外分光光度计(SOP—ZJ01—YQ005)定量，用TE(pH8.0)稀释，使之浓度分别为10.4ng/μl，7.8ng/μl，5.2ng/μl，2.6ng/μl，1.3ng/μl，0.65ng/μl。
c)将样品和步骤b)系列稀释的标准品于100℃煮沸10分钟变性后，立即置于冰水中。
d)将变性后的样品和系列稀释的标准品各取1μl点于尼龙膜(正电荷标记，Roche公司，Cat#1 209 299)上，待点于所述膜上的液体完全干后，把所述膜用两张滤纸夹好，放在一个玻璃盘中，放入120℃烤膜20分钟。
3-2-3预杂交
将所述膜用小镊子夹住一角放入塑料袋，加入2ml预杂交液，排除气体后密封，在68℃水浴预杂交3小时。
3-2-4杂交
将所述预杂交袋剪一个小口，倒出大约1.8ml预杂交液，加入2ml杂交液，于68℃水浴杂交过夜(18小时)。
3-2-5洗膜杂交
a)将所述膜取出放到一个干净的一次性平皿中，室温下加入20ml 2×SSC/0.1％(W/V)SDS溶液，放在摇床上以80rpm，洗5分钟，2次。
b)取出所述膜放到一个50ml的三角瓶中，加入30ml 0.1×SSC/0.1％SDS在68℃条件下溶液漂洗，15分钟，2次。
3-2-6免疫测定
c)将所述膜放到一个一次性的平皿中，加入缓冲液120ml中，室温，短暂洗涤5分钟。
d)再将所述膜放到20ml的缓冲液2中，室温放置15分钟，不时摇动。
e)再用20ml缓冲液1洗涤30秒。
f)用10ml缓冲液2稀释抗地高辛抗原结合片段(Anti-DIG-Fab)得到150U/L(1:5000)的抗体结合物溶液，所述膜在前述抗体结合物溶液中室温放置30分钟。
g)用20ml缓冲液1摇洗，以除去未结合的抗体结合物，15分钟，共洗2次。
h)所述膜在10ml缓冲液3中平衡5分钟。
i)将所述膜放入10ml显色溶液中，避光显色反应3小时。
j)当标准品显色出现明显的梯度，即显色完成，用10ml缓冲液4洗膜10分钟以终止反应。
k)扫描显色结果，用Bandscan 4.3软件处理数据(SOP-ZJ01-01027)。根据杂交信号，确定待检样品的滴度。
滴度(vg/ml)＝对应的拷贝数×2×稀释倍数
上述测定滴度的方法按照地高辛DNA标记和检测试剂盒(Roche公司)说明书所记载的步骤进行。
按照上述方法测定的实施例3-1制得的携带SEQ ID Nos.1-19片段的rAAV-S1-S19载体及空载体pAAV-hrGFP的病毒液滴度均为1×1012vg/ml。
实施例4重组慢病毒载体(以下简称Len)的构建及大量制备
4-1重组慢病毒基因转移载体Len-S1的构建
以pMD-18T-S1质粒为模板，以如下引物做PCR扩增：
正向引物S1-Forward:atgcaggccctggtgctactcc
反向引物S1-Reverse:tcatctcacagccttcctgctg
PCR反应循环条件：95℃变性5分钟，然后在95℃，30秒；，60℃，1分钟，72℃,45秒40个循环，最后72℃延伸10min。
凝胶回收后将得到的序列(长度为1737bp)按照说明书采用TA克隆的方法连入载体(Invitrogen K5315-20)，测序确认连入的片段序列正确，则得到的即为Len-S1。
按照上述方法，不同的是，以表1中的模板、引物进行PCR扩增凝胶回收后将得到的序列按照上述方法制备并测定携带其余18个序列(SEQ ID Nos.2-19)的重组慢病毒基因转移载体Len-S2～Len-S19。
表1
4-2、携带SEQ ID No.1片段的重组慢病毒载体Len-S1的大量制备
将293T细胞(购自美国模式培养物保藏所(American type culturecollection)，简称ATCC)，按照每一个15cm塑料培养皿大约l×l07细胞(次日密度为80％)进行接种，在20ml含10％胎牛血清的D-MEM培养基(Gibco BRL)中进行24小时培养。24小时培养后，将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换(Gibco BRL)，作为转染细胞备用。
按照每一个培养皿步骤4-1所得的基因转移载体Len-S1为10μg，包装载体5μg、rev表达载体2μg和VSV-G表达载体2μg(Invitrogen公司)溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基后，加入40μl的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌，在室温下放置15分钟。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培养基稀释的60μl的LIPOFECT AMINE Reagent试剂进行搅拌，在室温下放置15分钟。将所得DNA复合物滴加到上述的15cm培养皿的293T细胞中，小心振荡混匀，在37℃,5％CO2的孵育器中进行3小时的孵育。然后在上述培养皿中加入13ml含20％胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。
转染后的次日，用新鲜的30ml含10％胎牛血清的DMEM培养基进行交换培养。转染两天后，回收上清，加入20ml新鲜培养基。回收的上清用0.45μm的过滤器进行过滤，在4℃下保存。转染三天后，回收上清，用0.45μm的过滤器进行过滤，与前一天回收的载体混合，利用高速离心机进行浓缩操作。具体地，将回收的载体悬液加入到经过灭菌处理的试管中分装，在42500G，4℃下进行1小时的离心。所述离心操作重复二次，将载体悬液浓缩成1000倍。所述载体作为沉淀物进行沉淀，沉淀物用D-PBS进行溶解。浓缩后的载体，经柱层析(GEHealthcare，XK16/100，填料4FF(Sepharose 4Fast Flow)，上样流速1.5ml/min，柱床高度90cm)后，收集第一峰，将收集到的样品经0.22μm的滤膜过滤分装，取其中一份用于滴度测定，其余的保存于-80℃备用。
按照上述方法大量制备携带SEQ ID Nos.2-19片段的Len-S2-19载体及不携带目的基因的空载体lentivirus(pLenti6.3/V5-TOPO)的病毒液。
4-3滴度测定
(1)根据Trizol LS(Invitrogen公司)试剂盒说明书提取上述制备所得载体中的基因组RNA；
(2)实时定量PCR定量基因组RNA拷贝数：
A.准备标准品Len-RNA：
1)体外转录制备RNA，体外转录反应根据HiScribeTMT7体外转录试剂盒(In VitroTranscription Kit)(NEB，Cat：2030S)试剂盒说明书进行。
2)RNA标准品中DNA模板的去除上述反应体系75℃，10分钟将T7RNA聚合酶变性后，冷却至室温，补加10μl DNase I，37℃继续反应1小时。
3)RNA标准品的纯化定量
加200μl酚氯仿，涡旋(Vortex)混匀，4℃离心，12000rpm，10分钟，转移上清(约180μl)至新离心管中，加入500μl无水乙醇，再加入20μl 3M NaAc(pH5.2)。4℃离心，12000rpm，20分钟，弃上清，沉淀用500μl70％乙醇洗，4℃离心，去上清。沉淀干燥后，溶于200μl无RNase水。将纯化后的RNA标准品稀释100倍和200倍，测定OD260/280，计算浓度，并根据RNA浓度计算拷贝数。
每微克拷贝数＝10-3g×6.02×1023/RNA分子量。
4)RNA标准品的分装
定量Len基因组的标准品RNA需要用酵母tRNA(20ng/ul)溶液进行倍比稀释，得到标准溶液(0拷贝/μl，20拷贝/μl，2×102拷贝/μl，2×103拷贝/μl，2×104拷贝/μl，2×105拷贝/μl和2×106拷贝/μl)，分装成20μl/管，-80度冰箱保存备用。
B.用Taqman试剂盒(Taqman RNA-to-CT 1-step Kit)(Applied Biosystems,cat#4392938)在PCR管中制备反应混合液。
反应体系如下：
其中，
正向引物Len F-primer：5’-CATCAATGGGCGTGGATAGC-3’
反向引物Len R-primer：5’-CGCCTACCGCCCATTTG-3’
Len probe探针：
FAM-CTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCC-TAMRA
C.加入样品RNA或者标准品RNA(5ul)到PCR管中，按照下列条件进行实时定量PCR。(总量：25ul)
D.根据标准曲线定量样品中慢病毒(lentivirus)基因组RNA的拷贝数，根据标准曲线定量的基因组RNA的拷贝数×1000×稀释倍数，即为要检测的携带治疗基因的慢病毒载体滴度(vg/ml)。
E.根据得到的回收率校正。
按照上述方法测定的实施例4-2制得的携带SEQ ID Nos.1-19片段的Len-S1-S19载体及空载体lentivirus的病毒液滴度均为5×1010vg/ml。
4-4慢病毒液的浓缩
取所述携带SEQ ID No:1片段的Len-S1载体的慢病毒液1ml放置于标记的超滤管(Milipore，100KD/15ml)中，加入D-PBS至15ml。4℃，3000rpm分钟离心2-3分钟，弃上清，控制最终慢病毒液为0.1ml。
0.22μm滤膜过滤后，无菌分装后，样品立即(20分钟内)使用上述同样的方法进行滴度检测，得病毒液滴度为5×1011vg/ml。
按照上述相同方法浓缩携带SEQ ID Nos.2-19片段的Len-S2-S19载体及空载体lentivirus的慢病毒液，测定知病毒滴度均为5×1011vg/ml。
实施例5重组腺相关病毒载体对视网膜色素变性模型动物的治疗效果
1、视网膜色素变性模型动物的建模
视网膜色素变性模型鼠RCS购自西南眼科医院动物中心，本实施例选择45只3周龄RCS大鼠，随机分为9组，每组5只，7组为试验组，含不同序列的载体给药组，另两组分别为空载体对照和BBS对照，自由食水一周。
2、给药实施例3的重组腺相关病毒
试验组药物配方：将实施例3-1中得到的含SEQ ID Nos.1-19片段的AAV病毒液用等量D-PBS溶液稀释至病毒滴度为5×1011vg/ml；
对照组药物配方：以等量的空载体病毒D-PBS溶液和等体积D-PBS作对照；
给药方式：通过视网膜下腔给药，单次给药每只眼在2ul，给药总剂量109vg/每只眼。
3、效果观察
重组载体转导4周后，摘取眼球，使用光学显微镜对包含视神经切片的视网膜部位进行单位面积(平方毫米)内的视神经细胞核的计数。光学显微镜的计数结果(病毒滴度为109的药物组合物结果)如图1所示，其中纵坐标为视神经细胞核的数量(单位：个/平方毫米)。图1的结果显示，导入十九种重组AAV病毒载体的大鼠视网膜部位视神经细胞核的数量显著增多，说明本发明的核苷酸具有显著的治疗效果。
视网膜细胞核个数治疗结果数据见表2(单位个/mm2)：
表2
D-PBS rAAV rAAV-S1 rAAV-S2 rAAV-S3 rAAV-S4 rAAV-S5 rAAV-S6 rAAV-S7
S1 500 500 2480 2650 3050 3180 3400 3400 4100
S2 530 550 2490 2750 3189 3200 3400 3350 4250
S3 440 450 2488 2500 2800 3200 3350 3600 3950
S4 450 400 2500 2400 3490 3400 3500 3650 4000
S5 450 400 2500 2650 3250 3200 3500 3500 4100
平均值 474 550 2490 2590 3340 3236 3430 3500 4080
续表2
rAAV-S8 rAAV-S9 rAAV-S10 rAAV-S11 rAAV-S12 rAAV-S13
平均值 5214 5101 4672 4786 5411 5027
rAAV-S14 rAAV-S15 rAAV-S16 rAAV-S17 rAAV-S18 rAAV-S19
平均值 4960 5228 5051 5542 5124 4955
从表2可以看出，本发明的重组腺相关病毒对视网膜色素变性模型动物具有显著的治疗效果。
实施例6重组慢病毒载体对视网膜色素变性模型动物的治疗效果
试验组药物配方：药物配方为实施例4-4中得到的含SEQ ID Nos.1-19片段的慢病毒(lentivirus)溶液；
对照组药物配方：以等量的空载体病毒D-PBS溶液和等体积的D-PBS作对照；
给药方式：通过视网膜下腔给药，单次给药每只眼控制在2μl，给药总剂量109vg/每只眼。
3、效果观察
根据实施例5相同的方法进行效果观察，视网膜细胞核个数治疗结果数据见表3和图2(单位个/mm2)：
表3
续表3
Len-S8 Len-S9 Len-S10 Len-S11 Len-S12 Len-S13
平均值 5467 5046 4600 4893 5331 5124
Len-S14 Len-S15 Len-S16 Len-S17 Len-S18 Len-S19
平均值 4389 5516 5023 5420 5103 4394
从表3可以看出，本发明的重组慢病毒对视网膜色素变性模型动物具有显著的治疗效果。
实施例7重组腺相关病毒对缺血再灌注模型动物青光眼治疗效果
通过缺血再灌注建立青光眼模型动物，以证明重组腺相关病毒制剂对青光眼的治疗效果。
首先将本发明的载体制剂：rAAV不带外源基因的空载体、实施例3-1得到的rAAV-S1～rAAV-S19悬液对4周龄的Wistar大鼠的视网膜下腔进行给药，单次给药每只眼控制在2μl，给药总剂量109vg/每只眼。载体转导14天后，使上述大鼠眼内压力置于110mmHg压力下进行60分钟缺血处理，对视网膜神经节细胞进行损害。损害4天后，利用脑立体定位仪，将荧光色素DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)注入到两眼视上丘，对神经节细胞进行标记。视网膜神经节细胞损害7天后(载体导入21天后)摘出眼球，铺平用荧光显微镜进行观察，计数距离视神经1mm处每1mm2被标记的神经节细胞数量。
作为对照，D-PBS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，缺血再灌注损害处置的“无载体给药/缺血再灌注损害组”，按照同样的方法在荧光显微镜下进行观察，并对标记的神经节细胞数量进行计数。
显微镜下观察得到的标记的神经节细胞数量(个/mm2)如表4所示：
表4
分组/荧光细胞数 标记的神经节细胞数量(个/mm2)
无载体给药/缺血再灌注损害组 177.4
空载体给药组 185.3
rAAV-S1 217.8
rAAV-S2 223.6
rAAV-S3 232.1
rAAV-S4 228.5
rAAV-S5 238.6
rAAV-S6 240.3
rAAV-S7 251.4
rAAV-S8 278.3
rAAV-S9 271.1
rAAV-S10 263.0
rAAV-S11 266.4
rAAV-S12 274.5
rAAV-S13 270.1
rAAV-S14 260.5
rAAV-S15 279.2
rAAV-S16 271.8
rAAV-S17 275.6
rAAV-S18 271.0
rAAV-S19 265.5
这些结果表明：重组腺相关病毒携带的核苷酸序列对缺血再灌注引起的青光眼中的神经节细胞具有保护效果。
实施例8重组慢病毒Len-S1～Len-S19对缺血再灌注模型动物青光眼治疗效果
通过缺血再灌注建立青光眼模型动物，以证明重组腺相关病毒制剂对青光眼的治疗效果。
首先，将本发明实施例4-2得到的载体Len-S1～Len-S19、或者不带外源基因的空慢病毒载体lentivirus悬液对4周龄的Wistar大鼠的视网膜下腔进行给药，单次给药每只眼控制在2ul，给药总剂量109vg/每只眼。载体转导14天后，使上述大鼠眼内压力置于110mmHg压力下进行60分钟缺血处理，对视网膜神经节细胞进行损害。损害4天后，利用脑立体定位仪，将荧光色素DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)注入到两眼视上丘，对神经节细胞进行标记。视网膜神经节细胞损害7天后(载体导入21天后)摘出眼球，铺平用荧光显微镜进行观察，计数距离视神经1mm处每1mm2被标记的神经节细胞数量。
作为对照，D-PBS溶液替代载体悬液给药于视网膜下腔，缺血再灌注损害处置的“无载体给药/缺血再灌注损害组”，按照同样的方法在荧光显微镜下进行观察，并对标记的神经节细胞数量进行计数。
显微镜下观察得到的标记的神经节细胞数量(个/mm2)如表5所示：
表5
上表说明：携带本发明所述的核苷酸序列的重组慢病毒载体对缺血再灌注引起的青光眼中的神经节细胞具有保护作用。
实施例9重组腺相关病毒载体及慢病毒载体制剂的制备
1、保存液配制：按照表6中的配方，将病毒载体外其他成分混合后配制保存液并调节渗透压至配方中的相应值；
2、溶液置换：
取实施例3-1中得到的AAV病毒(1×1012vg/ml)、1ml放置于标记的超滤管中，或用D-PBS溶液稀释到所需浓度或用实施例4-4方法浓缩到所需浓度，加入上述制备的保存液至15ml。4℃，3000rpm分钟离心2-3分钟，弃上清，保留3ml的液体。再加入制剂的上述制备的保存液至15ml，3000rpm分钟再离心1次，最后控制重组病毒载体制剂的体积为1ml。
0.22μm滤膜过滤后，无菌分装后，样品立即(20分钟内)进行滴度检测。上述实验过程均应在0℃的冰上。其他剩余的样品液氮中速冻后，直接保存在-80℃。
按照同样的方法制备重组慢病毒载体制剂。
表6
实施例10重组腺相关病毒载体及慢病毒载体制剂对视网膜色素变性模型动物的治疗效果
试验组药物配方：实施例9制备的重组相关病毒载体及慢病毒载体制剂
对照组药物配方：以含与表6相同配方成分的空载体病毒和含与表6相同配方成分但不含任何病毒的溶液作对照；
按照实施例5相同的方法进行效果观察，结果显示，视网膜下腔注射携带本发明SEQ ID Nos.1-19所示的核苷酸序列的重组AAV/Len病毒载体制剂的大鼠视网膜部位视神经细胞核的数量均有显著增多，具体地，本发明的重组病毒载体266个配方的制剂给药个体神经细胞核数是对照组(含空载体病毒或不含任何病毒的溶液)的神经细胞核数的5-10倍，说明本发明的核苷酸序列具有显著的治疗效果。

Claims (18)

1.一种治疗眼科疾病的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为
SEQ ID No.9或SEQ ID No.16所示的核苷酸序列。
2.一种治疗眼科疾病的重组载体，所述重组载体包括载体及其携带的外源基因，其特征在于，所述外源基因为权利要求1所述的核苷酸。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述载体为DNA载体。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述载体为病毒载体。
5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述DNA载体选自由DNA质粒载体、结合其的脂质体、结合其的分子耦联体和结合其的多聚物所组成的组中。
6.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述病毒载体选自由腺相关病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体所组成的组中。
7.一种治疗眼科疾病的细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求2-6任意一项所述的重组载体。
8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自293T细胞、多能干细胞、视网膜色素上皮细胞、虹膜色素上皮细胞、结膜上皮细胞和视网膜感光细胞中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述多能干细胞选自神经干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞和角膜缘干细胞中的一种或几种。
10.一种治疗眼科疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有药学上可接受的赋形剂，以及选自权利要求2-6任意一项所述的重组载体和权利要求7-9任意一项所述的细胞中的一种或几种。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的赋形剂，以及权利要求2-6任意一项所述的重组载体。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的赋形剂为维持所述药物组合物pH为7.2～7.6的10mM三羟甲基氨基甲烷；每毫升注射液中含有106-1012vg的所述重组载体。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的赋形剂为维持所述药物组合物pH值为5.0-9.0的磷酸缓冲液；每毫升注射液中含有106-1012vg的所述重组载体。
14.根据权利要求12或13所述的药物组合物，其特征在于，所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾和氯化镁中的一种或几种。
15.权利要求1所述的核苷酸在制备治疗青光眼或视网膜色素变性的药物中的应用。
16.权利要求2-6任意一项所述的重组载体在制备治疗青光眼或视网膜色素变性的药物中的应用。
17.权利要求7-9任意一项所述的细胞在制备治疗青光眼或视网膜色素变性的药物中的应用。
18.权利要求10-14任意一项所述的组合物在制备治疗青光眼或视网膜色素变性的药物中的应用。
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