CN109395080A - 一种多功能蛋清蛋白凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多功能蛋清蛋白凝胶及其制备方法，该制备方法包括如下步骤：步骤1，将盐酸多巴胺粉末加入溶剂蛋清溶液中，进行磁力搅拌使盐酸多巴胺粉末完全溶解于所述蛋清溶液中，同时搅拌盐酸多巴胺粉末自聚合变黑生成光热材料聚多巴胺，得到混合溶液；步骤2，将化疗药物分散于所述混合溶液中，而后进行加热凝固，得到负载有光热材料和化疗药物的蛋清蛋白凝胶；该多功能蛋清蛋白凝胶采用上述方法制备得到。本发明的制备方法简单，原材料成本低，易于大规模生产，且制备得到的多功能蛋清蛋白凝胶安全性好，凝胶化过程可控，操作简便，适合临床转化，具有优越的光热转化能力、计算机断层扫描成像和光声成像能力，并能有效地控制化疗药物的释放。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米材料领域，具体涉及一种多功能蛋清蛋白凝 胶及其制备方法。
背景技术
癌症是当前威胁人类健康的最危险疾病之一。目前，手术、放 疗和化疗是癌症治疗的几种重要手段。手术治疗采取局部切除肿瘤组 织，通常会对患者身心带来巨大的创伤，而化疗和放疗会对机体器官 造成很大的毒副作用。
光热治疗，是近年来兴起的一种新型的微/无创肿瘤治疗方法， 但由于使用的油溶胶在肿瘤内分布不均，造成肿瘤治疗的效果有限。
凝胶是由聚合物交联形成的网络结构，在溶胀状态下含水量大而 又不会溶于水。凝胶通常具有良好的生物相容性，材料整体具备一定 流动性，可减弱与组织的摩擦，大大减少了排异性。在肿瘤治疗领域， 凝胶多被用于药物载体负载亲水/疏水性药物，以控制药物释放、降 低药物的毒副作用和提高对癌细胞的杀伤作用。
多巴胺，对人体或者哺乳动物内的神经传导起着相当重要的作 用。在生物医疗相关方面，常用多巴胺协助细胞传递神经化学物质， 负责控制人或者哺乳动物生物体大脑的感觉、兴奋等信息。
目前，用蛋清蛋白凝胶负载光热材料/化疗药物，实现肿瘤联合 治疗领域的研究还未见报道。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种多功能 蛋清蛋白凝胶及其制备方法。
本发明提供了一种多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法，具有这样的 特征，包括如下步骤：
步骤1，将盐酸多巴胺粉末加入溶剂蛋清溶液中，进行磁力搅拌 使盐酸多巴胺粉末完全溶解于蛋清溶液中，同时搅拌至盐酸多巴胺粉 末自聚合变黑生成光热材料聚多巴胺，得到混合溶液；
步骤2，将化疗药物分散于混合溶液中，而后进行加热凝固，得 到负载有光热材料和化疗药物的蛋清蛋白凝胶，
其中，步骤1中，溶解后的盐酸多巴胺粉末占混合溶液的质量浓 度百分比为2％-10％。
步骤1中，磁力搅拌的速率为50-400转/分钟，时间为1-3天。
在本发明提供的多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法中，还可以具有 这样的特征：其中，步骤2中，化疗药物为水溶性的抗癌药物，分散 浓度为0.1-1mg/mL。
在本发明提供的多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法中，还可以具有 这样的特征：其中，抗癌药物为盐酸阿霉素或者5氟尿嘧啶。
在本发明提供的多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法中，还可以具有 这样的特征：其中，步骤2中，加热的温度不低于60℃。
本发明还提供了一种多功能蛋清蛋白凝胶，用于作为负载抗肿 瘤药物的载体或者光热转化材料的载体，具有这样的特征：多功能蛋 清蛋白凝胶用如上述制备方法制备得到。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种多功能蛋清蛋白凝胶及其制备方法，该 制备方法简单，原材料成本低，易于大规模生产，由该制备方法制备 得到的多功能蛋清蛋白凝胶具有安全性好，凝胶化过程可控，操作简 便等优点，适合临床转化，具有优越的光热转化能力、计算机断层扫 描成像和光声成像能力，并能有效地控制化疗药物的释放，可应用于 在肿瘤的高效协同治疗等领域。
附图说明
图1(a)是本发明的实施例的蛋清蛋白凝胶SEM图；
图1(b)是本发明的实施例的负载光热材料聚多巴胺的蛋清蛋白凝 胶SEM图片；
图1(c)是本发明的实施例的负载抗肿瘤药物的蛋清蛋白凝胶SEM 图；
图1(d)是本发明的实施例的同时负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药 物的蛋清蛋白凝胶SEM图；
图2(a)是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的可注射 性图；
图2(b)是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶图；
图2(c)是本发明的实施例的60℃处理后的负载聚多巴胺蛋清蛋白 凝胶图；
图3是本发明的实施例的负载不同浓度多巴胺蛋清蛋白凝胶的在3 W/cm2下的光热效果图；
图4是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的在3W/cm2下 的光热效果图；
图5是本发明的实施例中的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的光热稳定 性9次升温-降温循环图；
图6是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的细胞安全性 测试结果图；
图7是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的溶血测试结 果图；
图8是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的在介质的pH 值为7.4和pH值为5.4的阿霉素释放曲线图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实 施例及附图对本发明作具体阐述。
实施例一：
图1(a)是本发明的实施例的蛋清蛋白凝胶SEM图，图1(b) 是本发明的实施例的负载光热材料聚多巴胺的蛋清蛋白凝胶SEM图 片。
步骤1，称取0.5g盐酸多巴胺，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶液。
步骤2，将黑色混合溶液在60℃鼓风干燥箱2h，即得到负载聚 多巴胺蛋清蛋白凝胶。
SEM观察结果如图1(a)和图1(b)所示，所得到的蛋清蛋白 凝胶呈现不规则结构。
实施例二：
图1(c)是本发明的实施例的负载抗肿瘤药物的蛋清蛋白凝胶 SEM图。
步骤1，称取10mg盐酸阿霉素，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌2h，得到分散均匀的混合溶液。
步骤2，将混合溶液在60℃鼓风干燥箱2h，即得到负载抗肿瘤 药物的蛋清蛋白凝胶。
SEM观察结果如图1(c)所示，所得到的蛋清蛋白凝胶呈现不 规则结构。
实施例三：
图1(d)是本发明的实施例的同时负载光热材料聚多巴胺抗肿 瘤药物的蛋清蛋白凝胶SEM图。
步骤1，称取0.5g盐酸多巴胺，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋白的黑色混合溶液。
步骤2，向黑色混合溶液加入10mg盐酸阿霉素，室温下以转速400rpm搅拌2h，得到分散均匀的混合溶液。
步骤3，将分散均匀的混合溶液在60℃鼓风干燥箱2h，即得到 同时负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋白凝胶。
SEM观察结果如图1(d)所示，所得到的蛋清蛋白凝胶呈现不 规则结构。
实施例四：
图2(a)是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的可 注射性图，图2(b)是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝 胶，图2(c)是本发明的实施例的60℃处理后的负载聚多巴胺蛋清 蛋白凝胶图。
步骤1，称取0.5g盐酸多巴胺，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶液。
如图2(a)所示，在室温条件时，聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶 液仍可以自由流动，并具有很好的可注射性，此时蛋清蛋白溶液尚未 凝固成凝胶，如图2(b)所示。
步骤2，将混合溶液加热高于60℃时，聚多巴胺蛋清蛋白的黑色 溶液完全凝固成凝胶，如图2(c)所示。
实施例五：
图3是本发明的实施例的负载不同浓度多巴胺蛋清蛋白凝胶的 在3W/cm2下的光热效果图。
步骤1，分别称取0.2g、0.5g、0.8g盐酸多巴胺，与10mL蛋 清溶液混合，室温下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋 白的黑色溶液。
步骤2，各取100μL不同多巴胺浓度的聚多巴胺蛋清蛋白溶液置 于96孔细胞培养板中，用808nm的功率密度为3W/cm2的NIR激 光照射聚多巴胺蛋清蛋白溶液，用FLIR E60型红外热像仪记录凝胶 温度随时间的变化关系，如图3所示。
实施例六：
图4是本发明的实施例的负载多巴胺蛋清蛋白凝胶的在3W/cm2下的光热效果图。
步骤1，称取0.5g盐酸多巴胺，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋白的黑色混合溶液。
步骤2，向混合溶液加入50μL碘海醇，室温下以转速400rpm 搅拌2h，得到分散均匀的混合溶液。取100μL混合溶液置于96孔 细胞培养板中，用808nm的功率密度3W/cm2的NIR激光照射聚多 巴胺蛋清蛋白溶液，用FLIR E60型红外热像仪记录凝胶温度随时间 的变化关系，如图4所示。
实施例七：
图5是本发明的实施例中的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的光热 稳定性9次升温-降温循环图。
步骤1，称取0.5g盐酸多巴胺，与10mL蛋清溶液混合，室温 下以转速400rpm搅拌24h，得到聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶液。
步骤2，取100μL不同多巴胺浓度的聚多巴胺蛋清蛋白溶液置于 96孔细胞培养板中，用808nm的功率密度为3W/cm2NIR激光照射 聚多巴胺蛋清蛋白凝胶5分钟，再停止照射5分钟，重复循环数次， 用FLIR E60型红外热像仪记录凝胶温度随时间的变化关系。
如图5所示，聚多巴胺蛋清蛋白凝胶表现出了良好的光热稳定 性。
实施例八：
图6是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的细胞安 全性测试结果图。
步骤1，收集对数期4T1细胞，以8000细胞/孔的密度接种于96 孔细胞培养板中，置于CO2培养箱中培养24h。
步骤2，向各孔中加入不同质量负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药 物的蛋清蛋白凝胶并培养24h。
步骤3，根据CCK-8试剂盒说明书，向每孔中加入10mL CCK-8 工作液，继续培养1h，利用BioTek酶标仪读取405nm处的吸光值， 分析评价材料对4T1细胞的分裂的影响和成活率，如图6所示。
实施例九：
图7是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的溶血测 试结果图。
步骤1，取稳定的健康成年人全血1mL，在3000转/分钟的速度 下离心3分钟，用PBS洗涤沉淀3次，得血红细胞，而后用PBS按 照1：50的比例配置成人血红细胞悬浊液，于4℃冰箱中备用。
步骤2，分别称取2组一定质量的负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤 药物的蛋清蛋白凝胶，然后将负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋 清蛋白凝胶浸入成人血红细胞悬浊液(对照组设置0.3mL人血红细 胞悬浊液溶于1.2mLPBS中，以及0.3mL人血红细胞悬浊液溶于1.2 mL蒸馏水中)，并在37℃环境下孵育2h。
步骤3，取出负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋白凝胶， 并将处理后的成人血红细胞悬浊液在1000转/分钟的速度下离心1分 钟，取上清液并用Lamada 25型紫外分光光度计测试上清液在540nm 处的吸光值，以评价材料的溶血性，如图7所示。
实施例十：
图8是本发明的实施例的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶的在介质 的pH值为7.4和pH值为5.4的阿霉素释放曲线图。
步骤1，取12组0.2g负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清 蛋白凝胶，置于6组装有5mL PBS且pH值为7.4的样品瓶中和6 组装有柠檬酸缓冲液且pH为5.4的样品瓶中。
步骤2，将6组装有5mL PBS且pH值为7.4的样品瓶中的3组 置于37℃的摇床中震荡，并将另外3组置于50℃的摇床中震荡，同 时将6组装有柠檬酸缓冲液且pH为5.4的样品瓶中的3组置于37℃ 的摇床中震荡，并将另外3组置于50℃的摇床中震荡，在预先设计 好的时间点，从样品瓶中各取出1mL溶液，并补充1mL新的相应 缓冲液。
步骤3，用紫外-可见分光光度计测试上述取出的1mL缓释液在 490nm处的吸光值，根据标准曲线计算出释放出来的阿霉素的浓度， 绘制出凝胶对阿霉素的释放动力学曲线，如图8所示。
实施例的作用与效果
根据实施例一可知，当只采用盐酸多巴胺与蛋清溶液混合时，得 到的负载聚多巴胺蛋清蛋白凝胶呈现不规则结构。
根据实施例二可知，当只采用盐酸阿霉素与蛋清溶液混合时，得 到的负载抗肿瘤药物蛋清蛋白凝胶呈现不规则结构。
根据实施例三可知，根据制备方法得到的同时负载光热材料和聚 多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋白凝胶呈现不规则结构。
根据实施例四可知，在室温条件时，聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶 液仍可以自由流动，并具有很好的可注射性，此时蛋清蛋白溶液尚未 凝固成凝胶；当温度高于60℃时，聚多巴胺蛋清蛋白的黑色溶液完 全凝固成凝胶。
根据实施例五可知，掺杂有高浓度多巴胺的聚多巴胺蛋清蛋白凝 胶能更加有效地进行光热转换而升高温凝胶的温度；聚多巴胺蛋清蛋 白凝胶表现出了良好的光热转换能力，充分说明聚多巴胺赋予了蛋清 蛋白凝胶良好的光热转换能力。
根据实施例六可知，掺杂有造影剂的聚多巴胺蛋清蛋白凝胶表现 出了良好的光热效果，同时具有计算机断层扫描(CT)和光声成像 造影的效果。
根据实施例七可知，负载光热材料聚多巴胺蛋清蛋白凝胶表现出 了良好的光热稳定性。
根据实施例八可知，负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋 白凝胶表现出良好的生物相容性。
根据实施例九可知，负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋 白凝胶具有良好的血液相容性。
根据实施例十可知，负载光热材料聚多巴胺抗肿瘤药物的蛋清蛋 白凝胶可以很好地控制阿霉素的释放速度，升高温度或降低pH均可 以明显地促进药物的释放，这对于提高化疗药物的肿瘤治疗效果、降 低药物毒副作用非常重要。
由此可知，本发明的多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法简单，选择 了具有良好生物相容性、升温可相变的的蛋白高分子材料为基质，与 光热材料和化疗药物同时溶解于溶剂中得到混合溶液，并且这种混合 溶液会随着温度的改变逐渐凝胶化，在体外或瘤内后形成包裹光热材 料和化疗药物的复合凝胶。另外，相比于水凝胶，这类复合凝胶是因 外界条件(温度)变化而引发的缓慢的、可控凝胶化，且体系中未选 取任何有机溶剂，解决了溶剂安全性问题；在材料体系方面，光热材 料可以高效地进行光热转化，赋予蛋清蛋白凝胶良好的光热转化能 力；化疗药物可以复合凝胶中释放出来杀死肿瘤，而且还可以选择具 有造影性能的材料，如碘海醇是一种良好的计算机断层扫描(CT) 和光声成像造影剂，在发挥光热性能的同时，监控凝胶在肿瘤内的弥 散情况，在合适的时机改变体系的温度，引发在肿瘤内形成均匀的凝 胶，以获得最佳的治疗效果；在临床转化方面，除了可实现对中晚期 的实体瘤的光热治疗/化疗联合治疗外，这种凝胶还有望阻塞由大量 畸形血管组成的静脉血管瘤的血管，起到肿瘤栓塞治疗的效果。
另外，本发明将盐酸多巴胺和化疗药物溶解分散于蛋清溶液中， 得三者的混合溶液，其中，蛋清溶液具有温度响应性凝胶性能，在 60℃左右或更高温度时，可以发生明显的凝固凝胶，将自聚合生成的 聚多巴胺光热材料和化疗药物束缚于所形成的凝胶中，且本发明的蛋 清凝胶兼具光热材料的光热杀死肿瘤和化疗药物的化疗治疗肿瘤的 功效。更重要的是，光热材料和化疗药物被束缚于凝胶材料内，不至 于大量地进入血液循环，使得材料和药物的利用率得到大幅提高的同 时，降低了对正常组织和脏器的损伤，有效地弥补了肿瘤治疗研究中 通过静脉注射和瘤内注射光热材料和化疗药物的不足。
综上所述，本发明的多功能蛋清蛋白凝胶的具有安全性好，凝胶 化过程可控，操作简便等优点，适合临床转化，具有优越的光热转化 能力、计算机断层扫描成像和光声成像能力，并能有效地控制化疗药 物的释放，可应用于在肿瘤的高效协同治疗等领域，另外，本发明的 多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法简单，原材料成本低，易于大规模生 产。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护 范围。
Claims (5)
1.一种多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，将盐酸多巴胺粉末加入溶剂蛋清溶液中，进行磁力搅拌使所述盐酸多巴胺粉末完全溶解于所述蛋清溶液中，同时搅拌至所述盐酸多巴胺粉末自聚合变黑生成光热材料聚多巴胺，得到混合溶液；
步骤2，将化疗药物分散于所述混合溶液中，而后进行加热凝固，得到负载有所述光热材料和所述化疗药物的蛋清蛋白凝胶，
其中，所述步骤1中，溶解后的盐酸多巴胺粉末占混合溶液的质量浓度百分比为2％-10％，
所述步骤1中，磁力搅拌的速率为50-400转/分钟，时间为1-3天。
2.根据权利要求1所述的一种多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，化疗药物为水溶性的抗癌药物，分散浓度为0.1-1mg/mL。
3.根据权利要求2所述的一种多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：
其中，所述抗癌药物为盐酸阿霉素或者5氟尿嘧啶。
4.根据权利要求1所述的一种多功能蛋清蛋白凝胶的制备方法，其特征在于：
其中，所述步骤2中，加热的温度不低于60℃。
5.一种多功能蛋清蛋白凝胶，用于作为负载抗肿瘤药物的载体或者光热转化材料的载体，其特征在于：
其中，所述蛋清蛋白凝胶采用如权利要求1～4所述的制备方法制备得到。
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