CN109394870A - 白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定及其应用，利用本发明的制备方法得到了生物碱含量50％以上的白鲜皮活性部位，其制备工艺简单，采用有机溶剂充分萃取，易于操作，成本低廉。在体外实验中对人胃癌细胞株MGC‑803和SGC‑7901的生长具有很好的抑制作用；在动物实验中，白鲜皮活性部位对人SGC‑7901胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用，并且能显著提高荷瘤小鼠的生存率。因此该白鲜皮活性部位能用于制备抗胃癌药物，具有良好的开发应用前景。本发明还公开了该白鲜皮抗癌活性部位的含量测定方法及主成分范围，便于后期开发应用时，进行质量标准提升与控制。

Description

白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种具有抗癌活性的中药提取物，具体地说涉及白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定及其应用。
背景技术
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。目前业内对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术、放疗、化疗为主，但许多化学抗癌药物在作用于靶细胞时往往累及正常细胞，造成严重的副反应。中草药在抗癌抗突变方面有独特的优势和广阔的应用前景，而且中药在对肿瘤的辅助治疗中也起到不容忽视的作用，寻找高效低毒的抗癌药物以及抗癌辅助药物是当前肿瘤研究的重要内容。
我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取活性物质，用于开发成治疗肿瘤疾病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活性物质，开发成具有抗肿瘤疗效的新药，具有重要应用价值和广阔发展前景。
白鲜皮主要成分：白鲜内酯、黄柏酮酸、胡芦巴碱、胆碱。白鲜碱、茵芋碱、崖椒碱、前茵芋碱、异斑沸林草碱、柠檬苦素、黄柏酮、梣酮、菜油甾醇、茵芋碱、r-崖椒碱、白鲜明碱以及谷甾醇、酸性物质和皂甙等。
功能主治：1，清热解毒，除湿止痒：用于湿热疮疹，多脓或黄水淋漓，肌肤湿烂，皮肤瘙痒及风疹疥癣。2，清热解毒除湿：用于治湿热黄疸及湿热痹证。
发明内容
本发明旨在对白鲜皮抗癌作用进行研究，进而发现白鲜皮抗癌作用的活性部位，并对白鲜皮抗癌活性部位的制备方法进行优化，得到具有较好抗癌活性的部位，并对该抗癌活性部位的主成分进行了含量测定。
有鉴于此，本发明提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
进一步的，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、r-崖椒碱、白鲜明碱和前茵芋碱。
本发明还提供了含有所述白鲜皮中抗癌活性部位在制备抗癌药物中的应用。
进一步的，该活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。
本发明还提供了一种包含该活性部位的药物组合物，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。
进一步的，该药物组合物的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂和合剂。
本发明还提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法，包含以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入乙醇水溶液回流提取3～5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，加稀酸将pH值调节至2～4，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至9～10后，用有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～3倍柱体积的体积分数为20～40％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3～5倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为Agilent制备柱Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-A和0.1％三氟乙酸水溶液-B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：
流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-18min收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗癌活性部位。
优选的，提取步骤中的乙醇溶液为70％～85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5～3倍量，加热回流时间为2～4小时，浸膏浓缩至无醇味。
优选的，萃取步骤中水的用量为浸膏的2～3倍量，萃取用有机溶剂用量与水等体积。
具体的，萃取步骤中稀酸为0.1％～l％的硫酸或盐酸溶液。
具体的，萃取步骤中有机溶剂为二氯甲烷或氯仿。
具体的，除杂步骤中大孔树脂柱型号为DH101。
进一步的，纯化步骤为：将步骤(4)的制备液相色谱替换为硅胶柱层析，即将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用3～5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用3～6倍柱体积的体积比为98:2～85:15的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮抗癌活性部位。
更进一步的，纯化步骤为：将步骤(4)的制备液相色谱替换为硅胶柱层析，即将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用6倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮抗癌活性部位。
本发明还提供了一种白鲜皮中抗癌活性部位的主成分含量测定方法，包括以下步骤：(1)供试品制备：精密称取10.0mg白鲜皮中抗癌活性部位，用色谱纯甲醇溶解且定容至10ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到白鲜皮中抗癌活性部位供试品；
(2)：对照品溶液制备：精密称定经干燥过的白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、崖椒碱和前茵芋碱对照品各5.0mg，置10mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成白鲜皮生物碱混合对照品储备液，-4℃冰箱放置，备用。
(3)：对步骤(1)制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤(2)制备的白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱对照品进行含量测定；HPLC条件为：色谱柱填料为Aglient C18，规格为250mm×4.6mm 5μm，波长为240nm，流速为10ml/min，柱温30℃；流动相为乙腈(A)-0.1％三氟乙酸水溶液(B)，梯度洗脱为：
本发明的有益效果为：1.本发明的提取分离工艺能有效地除去易在制备色谱柱上形成死吸附的杂质，提高有效成分的含量，能快速准确的得到有效成分。2.本发明提供的白鲜皮有效组分化学成分简单明确，在药理研究上更易于阐明其作用机制，在生产中更易于药物的质量控制。3.本发明提供的方法首次从白鲜皮药材中得到含白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱的总生物碱活性部位，并首次对其治疗胃癌的药效进行研究，由于成分确切，含量明确，制备工艺便捷，活性好，适宜开发成抗肿瘤中药新药。
附图说明
图1为本发明白鲜皮纯化步骤75％的乙醇水溶液洗脱部位制备液相图谱；
图2为本发明白鲜皮抗癌活性部位的HPLC分析图。
具体实施方式
如前所述，本发明旨在提供一种白鲜皮中抗癌活性部位的制备方法、含量测定方法及其应用。以下将结合实施例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
一种白鲜皮抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
一种白鲜皮抗癌活性部位在制备抗癌药物中的应用。
如图1所示，一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，提取步骤中的乙醇溶液为85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比3倍量，加热回流时间为4小时，浸膏浓缩至无醇味。加入乙醇水溶液回流提取5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加3倍量水混悬后，加0.1％的硫酸溶液。将pH值调节至3.56，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至9.0后，用等体积氯仿萃取5次，合并氯仿层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱HD101层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后，先用5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用3倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用5倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为Agilent制备柱Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-A和0.1％三氟乙酸水溶液-B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：
流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-18min收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮中抗癌活性部位，其总生物碱含量为85.3％，液相图谱见图1。
实施例2
一种白鲜皮抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
一种白鲜皮抗癌活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。
一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，提取步骤中的乙醇溶液为85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5倍量，加热回流时间为2小时，浸膏浓缩至无醇味。加入乙醇水溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加3倍量水混悬后，加萃取步骤中稀酸为l％的盐酸溶液。将pH值调节至3.56，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至10后，用等体积二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱HD101层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后，先用4倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用2倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用4倍柱体积的体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用6倍柱体积的体积比为97:3的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮活性部位，其总生物碱含量为78.3％。
实施例3
一种白鲜皮抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
一种白鲜皮抗癌活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。
一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，提取步骤中的乙醇溶液为70％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5倍量，加热回流时间为2小时，浸膏浓缩至无醇味。加入乙醇水溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加倍量水混悬后，加萃取步骤中稀酸为l％的盐酸溶液。将pH值调节至3.56，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至10后，用等体积氯仿萃取3次，合并氯仿层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱HD101层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:2纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后，先用3倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用3倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用6倍柱体积的体积比为85:15的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮活性部位，其总生物碱含量为61.8％。
实施例4
一种白鲜皮抗癌活性部位，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
一种白鲜皮抗癌活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。
一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，提取步骤中的乙醇溶液为70％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5倍量，加热回流时间为2小时，浸膏浓缩至无醇味。加入乙醇水溶液回流提取3次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加倍量水混悬后，加萃取步骤中稀酸为l％的盐酸溶液。将pH值调节至3.56，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至10后，用等体积氯仿萃取3次，合并氯仿层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱HD101层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:2纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后，先用3倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1倍柱体积的体积分数为30％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3倍柱体积的体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为75％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用3倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用6倍柱体积的体积比为98:2的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮活性部位，其总生物碱含量为69.2％。
可见，上述提取物的制备方法，其工艺简单，该采用水或有机溶剂充分提取或萃取后进行除杂与纯化，易于操作，质量可控，易重现，得到的白鲜皮抗癌活性部位中总生物碱含量在60％以上，最高能达到85.3％％。
白鲜皮抗癌活性部位中总生物碱含量测定方法
1.仪器与试剂
UV-300型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；恒温水浴锅，电子分析天平，白鲜碱对照品，中国药品检定所；柠檬酸，南京化学试剂有限公司；柠檬酸钠，南京化学试剂有限公司；苯二甲酸氢钾，南京化学试剂有限公司；溴甲酚绿，南京化学试剂有限公司，三氯甲烷，南京化学试剂有限公司。
2.溶液配制：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液：取40ml已配置好待用的0.1mol·L-1的柠檬酸溶液和85ml(0.1mol·L-1)的柠檬酸钠溶液放置于250ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度线，摇匀，即得柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH＝5.4)。
溴甲酚绿指示液：称取溴甲酚绿0.125g，用25ml(0.1mol·L-1)NaOH溶液溶解后，加邻2.55g苯二甲酸氢钾，用水溶解后转移至250ml容量瓶中，加水至刻度线，摇匀即得。
对照品溶液：精密称量白鲜碱对照品3.0mg，用1％酸性乙醇溶液溶解后转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线，摇匀即得白鲜碱对照品溶液，浓度为0.327mg·ml-1。
3.最大吸收波长及标准曲线确定
精密量取对照品溶液0.4ml，置分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。另取供试品溶液1ml，同法操作。进行全波长扫描，对照品和供试品吸收曲线均在435nm处有最大吸收，故本实验用435nm作为测定波长。
分别精密吸取对照品标准溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml置于分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。以相应的试剂为空白溶液，在435nm下测定吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝0.054C-0.021，R2＝0.999。对照品溶液在3.27～26.16μg·mg/ml浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
4.供试品溶液的制备
取上述各实施例所得的白鲜皮抗癌活性部位待测成分适量，精密称定，用1％酸性乙醇溶液溶解后转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线。
5.纯度测定方法
精密吸取供试品溶液1ml，精密量取对照品溶液0.4ml，置分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。于435nm下测定吸光度，根据标准曲线计算得出样品中总生物碱含量。
6.测定方法考察
精密度考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液0.4ml，置分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。摇匀后于435nm处重复测定5次，记录吸光度值，计算RSD值。结果RSD为0.89％，表明仪器精密度良好。
稳定性考察：精密吸取2项下制得的对照品溶液0.4ml，置分液漏斗中，加1％酸性乙醇至1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。分别于0，15，30，60，120min在435nm下进行测定，记录吸光度值，计算RSD值。结果RSD为1.54％，表明供试品溶液在2h内稳定性良好。
重复性考察：精密称取制备例2所得白鲜皮活性部位5份，用1％酸性乙醇溶液溶解后转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线，精密吸取1ml供试品溶液，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。于435nm下测定吸光度，计算RSD。结果总蒽醌平均含量为85.3％，RSD为1.05％，表明本方法重现性良好。
加样回收率考察：采用加样回收法，精密称取精密称取制备例2所得白鲜皮活性部位5份，分别按照1∶0.8，1∶1.0，1∶1.2加入白鲜碱对照品，置分液漏斗中，用1％酸性乙醇溶液溶解后转移至10ml容量瓶中，稀释至刻度线，精密吸取1ml，加入pH＝5.4缓冲溶液5ml，溴甲酚绿指示液2ml，振摇1min，加入10ml三氯甲烷，振摇1min，静置30min。精密吸取供试品溶液2ml，回收溶液至干，残渣加入0.5％醋酸镁甲醇溶液溶解，定容至10ml，于435nm下测定吸光度。
该法专属性好，空白溶剂在435nm下对总生物碱吸光度无干扰；在3.27～26.16μg·mg/ml范围内线性关系良好，相关系数大于0.999；回收率良好，在98％～102％之间，RSD值低于2.0％；精密度符合规定，RSD小于1％；溶液在2h内稳定性好，供试品溶液与对照品溶液于室温下放置2h，吸光度均无明显变化。
白鲜皮抗癌活性部位主要成分含量测定方法
1溶液的制备
1.1混合对照品溶液
分别精密称取对照品：白鲜碱6mg、茵芋碱3mg、白鲜明碱2mg、r-崖椒碱2mg和前茵芋碱2mg，置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,制成浓度为白鲜碱0.236mg/ml、茵芋碱0.112mg/ml、白鲜明碱0.084mg/ml、r-崖椒碱0.088mg/ml和前茵芋碱0.196mg/ml的混合对照品溶液,备用。
1.2供试品溶液
取白鲜皮抗癌活性部位10mg,精密称定,用甲醇溶解并定容到10mL量瓶中,摇匀，微孔滤膜滤过后,取续滤液为供试品溶液。
2色谱条件系统适用性试验
色谱柱:Diamonsil C18柱(200mm×4.6mm),流动相：乙腈-水,按以下梯度，流速:1.0mLmin·-1,检测波长:240nm,进样量:20μL。
在此条件下以白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱计,理论塔板数不低于3000,且白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱、前茵芋碱与其他峰达到基线分离，色谱图见图2：
3线性关系考察
精密量取混合对照品溶液0.3、1.0、1.5、1.0、1.5、3.0、6.0、9.0mL分别置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制得系列对照溶液。以色谱峰面积(Y)为纵坐标,以质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线并计算回归方程。
4.方法学考察
4.1精密度试验
精密吸取混合对照品溶液3.0mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。按2所述色谱条件进样测定,重复6次。白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱色谱峰面积的RSD均小于3.0％(n＝6),表明仪器精密度良好。
4.2重复性试验
取白鲜皮供试品6份,按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件进样测定。白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱色谱峰面积的RSD均小于2.0％(n＝6),表明方法重复性良好。
4.3稳定性试验
取白鲜皮供试品1份,按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件于12h内重复进样6次进样测定。白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱色谱峰面积的RSD均小于3.0％，表明白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱在12h内稳定。
4.4加样回收率试验
取已知含量的白鲜皮抗癌活性部位6份各10mg,精密称定,分别加入质量浓度为80.0mg·L-1和240.0mg·L-1对照品溶液1、1.3、1.6mL,用甲醇稀释至刻度，摇匀，制备低、中、高3种质量浓度的供试溶液,每个质量浓度制备3份样品。按1.2所述方法制备供试品溶液,按2所述色谱条件测定，计算回收率，RDS值均小于3％。
5.供试品含量测定
取各制备例中白鲜皮抗癌活性部位10mg,精密称定,用甲醇溶解并定容至10ml，按3所述条方法操作,在2所述色谱条件下测定,计算5种生物碱的含量，测定结果见下表。
表1：制备例中5种生物碱的含量测定
白鲜皮抗癌活性部位的活性检测
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。
1.MTT法评价白鲜皮抗癌活性部位对人胃癌SGC-7901细胞株的生长抑制作用。
1.1材料人胃癌SGC-7901细胞株，购自中国医学科学院上海研究所；RPMI1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司；四甲基偶氮唑(MTT)，Sigma公司；白鲜皮抗癌活性部位，采用本发明实施例一方法制备。
1.2方法收集对数生长期SGC-7901胃癌细胞，以2×104个/孔接种于96孔板中。共设置8组(对照组，及药物组7组)，每组设复孔8个。置于37℃、5％CO2浓度细胞培养箱中培养6h-8h后，各孔吸去原培养基，对照组加入空白RPMI1640培养基，药物组分别加入含有100mM，10mM，1mM，100μM，10μM，1μM和0.1μM白鲜皮活性部位的RPMI1640培养基，于5％CO2培养箱，37℃继续培养。培养12h后每孔加入5mg/mL TT30μL，继续培养4h后，吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO 200μL终止培养，置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解，酶标仪检测波长450nm的吸光值。
1.3.结果：
结果如表2所示，白鲜皮抗癌活性部位浓度为0.01μM-100μM时，对人胃癌SGC-7901细胞株的增殖均有抑制作用，并且呈现一定的量效关系，在浓度为10μM以上时，抑制率达到50％以上，说明其具有良好的抑制人胃癌SGC-7901细胞株增殖的作用。
表2白鲜皮抗癌活性部位对人胃癌SGC-7901细胞株增殖的抑制作用
2.MTT法评价白鲜皮抗癌活性部位对人胃癌MGC-803细胞株的生长抑制作用。
2.1材料人胃癌MGC-803细胞株，购自中国医学科学院上海研究所；RPMI1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，GIBCO公司；二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司；四甲基偶氮唑(MTT)，Sigma公司；白鲜皮抗癌活性部位，采用本发明实施例一方法制备。
2.2方法收集对数生长期MGC-803胃癌细胞，以2×104个/孔接种于96孔板中。共设置8组(对照组，及药物组7组)，每组设复孔8个。置于37℃、5％CO2浓度细胞培养箱中培养6h-8h后，各孔吸去原培养基，对照组加入空白RPMI1640培养基，药物组分别加入含有100μM，50μM，10μM，1μM，0.1μM，0.01μM和0.001μM的RPMI1640培养基，于5％CO2培养箱，37℃继续培养。培养12h后每孔加入5mg/mL MTT30μL，继续培养4h后，吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO200μL终止培养，置摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解，酶标仪检测波长450nm的吸光值。
2.3.结果：
结果如表2所示，白鲜皮抗癌活性部位各剂量组对人胃癌MGC-803细胞株的增殖均有抑制作用，并且呈现一定的量效关系，在浓度为1μM以上时，抑制率达到50％以上，说明其具有良好的抑制人胃癌MGC-803细胞株增殖的作用。
表3白鲜皮抗癌活性部位对人胃癌MGC-803细胞株增殖的抑制作用
3.白鲜皮抗癌活性部位对人SGC-7901胃癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用
3.1材料
SPF级Balb/c裸鼠，雌雄各半，体重18～22g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供；人胃癌SGC-7901细胞株，购自中国医学科学院上海研究所；RPMI1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，GIBCO公司；白鲜皮抗癌活性部位，采用本发明实施例一方法制备。
3.2方法
SGC-7901胃癌细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，待细胞生长至指数生长期，采用0.25％的胰酶消化后制备浓度为2×107个/ml的细胞悬液，每只小鼠200μL接种于左侧肋骨接近腋窝部位的脂肪垫。待肿瘤体积为100-130mm3时，将小鼠随机分为4组：对照组，白鲜皮低、中、高剂量组(剂量分别为12，36，109mg·kg-1)、灌胃给药，对照组给予等体积的PBS。自给药日起，第一周、第二周、第三周后分别用游标卡尺测定各组小鼠皮下移植瘤的长径(a)、短径(b)，计算肿瘤体积(V＝0.5a×b2)，观察各组小鼠的死亡情况并做记录，21d后脱颈椎处死小鼠，仔细剥离肿瘤称重，按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率＝(1－用药组平均瘤重/模型组平均瘤重)×100％。
3.3结果
表4结果显示，白鲜皮抗癌活性部位可以明显抑制人SGC-7901胃癌细胞裸鼠移植瘤体积的增加，低剂量组在第三周表现出明显抑制作用，中剂量和高剂量组在第一周到第三周均表现出明显抑制作用。
表5结果显示，白鲜皮抗癌活性部位各剂量组均可提高荷瘤小鼠的生存率。
表6结果显示，白鲜皮抗癌活性部位各剂量组均可抑制瘤体重量的增加，其中中、高剂量组具有显著性差异，并且抑瘤率达到50％以上。
表4白鲜皮抗癌活性部位对人SGC-7901胃癌细胞裸鼠移植瘤体积的影响
与对照组比较，*，P<0.05；**，P<0.01。
表5白鲜皮抗癌活性部位对荷瘤裸鼠生存率(％)的影响
表6白鲜皮抗癌活性部位对人SGC-7901胃癌细胞裸鼠移植瘤重量的影响
与对照组比较，*，P<0.05；**，P<0.01。
由上述实施例表明，本发明的白鲜皮活性部位在体外实验中对人胃癌细胞株MGC-803和SGC-7901的生长具有很好的抑制作用；在动物实验中，白鲜皮活性部位对人SGC-7901胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长具有明显抑制作用，并且能显著提高荷瘤小鼠的生存率。由此证明，本发明的白鲜皮活性部位具有抗胃癌活性，能用于制备抗胃癌药物。
包含白鲜皮抗癌活性部位的组合物制备
片剂
取白鲜皮抗癌活性部位12.2g，研成细粉，加入10％淀粉糊约8g，药用淀粉7g，微粉硅胶0.8g，混合，14目筛制粒，于80℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁0.05g，混匀，压制成100片，即得。每片重0.2g，口服，每次1片，一日三次。
硬胶囊
取白鲜皮抗癌活性部位16g，研成细粉，药用淀粉3.5g，硬脂酸镁0.01g，混合均匀，过筛，装入胶囊，制成100粒，即得。每粒内容物重0.2g，口服，每次1粒，一日两次。
软胶囊
取白鲜皮抗癌活性部位12.2g，加入丙二醇0.2g，卵磷脂0.9g，大豆油18g，振动磨超微20分钟，使混匀，制成软胶囊100粒，即得。每粒内容物重0.3g，口服，每次1粒，一日三次。
颗粒剂
取白鲜皮抗癌活性部位13.8g，研成细粉，加入糊精25g，乳糖458g，混合均匀，制粒，于80℃干燥，整粒，分装，制100包，即得。每包重5g，口服，每次1包，一日两次。
缓释片
取白鲜皮抗癌活性部位24.4g，研成细粉，过100目筛，HPMC10.3g，乳糖16g，十二烷基硫酸钠1g，过100目筛，混合均匀，加入2％聚维酮(95％乙醇)黏合剂制软材，过20目筛制粒，于50℃干燥，过18目筛整粒，干颗粒采用外加法加入2％硬脂酸镁，混匀，压片，制成缓释片100片，即得。每片重0.5g。口服，每次1片，一日一次。
滴丸
取白鲜皮抗癌活性部位12.2g，研成细粉，另取24.8g聚乙二醇4000加热熔融，加入白鲜皮抗癌活性部位，振动磨超微20分钟，使混合均匀，滴制成滴丸，即得。每丸重0.35g，口服，每次1粒，一日三次。
注射剂
取上白鲜皮抗癌活性部位12.2g，研成细粉，加入β环糊精4.5g，蔗糖500g，纯水适量(约390g)搅拌加热溶解，煮沸10分钟，稍冷后加入10％(W/V)尼泊金乙酯乙醇溶液搅匀，用水调整至100ml，过滤，分装，灭菌，即得。每支10ml。口服，每次1支，一日三次。
需要指出的是，上述包含白鲜皮有效部位的药物组合物，可根据药剂学领域的常用辅料，根据剂型和实际情况进行恰当选择，例如常见的辅料有淀粉、低取代羟丙基纤维素、微粉硅胶、硬脂酸镁、淀粉浆、蔗糖、糊精、羧甲基淀粉钠、滑石粉、聚山梨酯、聚乙二醇、注射用大豆磷脂和注射用甘油等；制备所需药物的各种剂型时，可以按照药剂学领域的常规生产方法制备，如将该化合物与一种或多种载体混合，然后制成相应的剂型。作为优选，所述药物制剂的剂型包括注射剂、片剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂与合剂等等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种白鲜皮抗癌活性部位，其特征在于，该活性部位总生物碱含量为60％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
2.根据权利要求1所述的活性部位，其特征在于，该活性部位总生物碱含量为75％以上，并含有白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱。
3.根据权利要求1-2任一项所述的活性部位在制备抗癌药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的活性部位，其特征在于，该活性部位在制备抗胃癌药物中的应用。
5.根据权利要求1-2任一项所述一种白鲜皮抗癌活性部位的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)提取：取白鲜皮粉碎，加入乙醇水溶液回流提取3～5次，过滤，合并滤液，浓缩，得到浓缩浸膏。
(2)萃取：将上述浓缩浸膏加水混悬后，加稀酸将pH值调节至2～4，放置过夜，取上清液过滤，用10％NaOH溶液将上述滤液pH调至9～10后，用有机溶剂萃取3～5次，合并有机溶剂层，浓缩后得到萃取部位浓缩浸膏。
(3)除杂：大孔树脂柱层析，将上述萃取部位浓缩浸膏用1:1～1:2的纯水溶解后，进行大孔树脂吸附，然后先用3～5倍柱体积的纯水洗脱除去水溶性杂质；再用1～3倍柱体积的体积分数为20～40％的乙醇水溶液洗脱除杂；最后用3～5倍柱体积的体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱；收集体积分数为60～80％的乙醇水溶液洗脱部位，浓缩干燥得大孔树脂柱层析活性部位。
(4)纯化：用制备液相色谱继续分离得到的洗脱液，分离条件：色谱柱为Agilent制备柱Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm，流动相为甲醇-0.1％三氟乙酸水溶液，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：0-30min，甲醇相从30％升为50％，30-47min，甲醇相从50％升为60％，47-60min，甲醇相从60％升为95％。流速为10ml/min，柱温为室温；样品用色谱级甲醇溶解，经制备液相色谱分离，在时间段8-18分钟收集溶液，收集液浓缩干燥后得到白鲜皮抗癌活性部位。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，提取步骤中的乙醇溶液为70％～85％乙醇水溶液，用量为生药重量体积比2.5～3倍量，加热回流时间为2～4小时，浸膏浓缩至无醇味。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，萃取步骤中水的用量为浸膏的2～3倍量，萃取用有机溶剂用量与水等体积；萃取步骤中稀酸为0.1％～l％的硫酸或盐酸溶液；萃取步骤中有机溶剂为二氯甲烷或氯仿。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，除杂步骤中大孔树脂柱型号为DH101。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，纯化步骤为：将步骤(4)的制备液相色谱替换为硅胶柱层析，即将除杂步骤中制备得到大孔树脂柱层析活性部位上硅胶柱进行层析柱分离，先用3～5倍柱体积的氯仿洗脱除杂；然后再用3～6倍柱体积的体积比为98:2～85:15的氯仿和甲醇组成的混合溶剂体系进行洗脱并收集该洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的白鲜皮抗癌活性部位。
10.一种白鲜皮中抗癌活性部位的主成分含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品制备：精密称取10.0mg白鲜皮中抗癌活性部位，用色谱纯甲醇溶解且定容至10ml容量瓶中，用0.45微米微孔滤膜过滤，即得到白鲜皮抗癌活性部位供试品；
(2)：对照品溶液制备：精密称定经干燥过的白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱对照品各5.0mg，置10mL的量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成白鲜皮生物碱混合对照品储备液，-4℃冰箱放置，备用。
(3)：对步骤(1)制备的供试品进行高效液相色谱测定，并以步骤(2)制备白鲜碱、茵芋碱、白鲜明碱、r-崖椒碱和前茵芋碱对照品进行含量测定；HPLC条件为：色谱柱填料为Aglient C18，规格为250mm×4.6mm5μm，波长为240nm，流动相为乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液，梯度洗脱为：0-30min，乙腈相从15％升为30％，30-47min，乙腈相从30％升为40％，47-60min，乙腈相从40％升为95％，60-70min，乙腈相95％等度洗脱；流速为1ml/min，柱温为30℃。
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