CN109385472B - 一种血清miRNA标志物及其检测电离辐射损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种血清miRNA标志物，该miRNA标志物是miR‑134‑5p和miR‑155‑5p的组合。同时，本发明还公开了该血清miRNA标志物检测电离辐射损伤的方法。本发明血清miRNA标志物相比于传统的染色体畸变及蛋白质类生物标志物，在提取和保存过程中更加稳定，使检测结果更加可靠和准确；并经qRT‑PCR法验证，其表达水平和辐射剂量也存在密切的相关性，能为判断检测对象是否有受到电离辐射损伤的风险提供可靠和准确的评估依据。

Description

一种血清miRNA标志物及其检测电离辐射损伤的方法
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，尤其涉及一种血清miRNA（microRNA）标志物及其检测电离辐射损伤的方法。
背景技术
电离辐射广泛存在于空间环境和核相关设施中。电离辐射一方面可以直接作用于细胞的DNA、蛋白质分子和细胞器等，造成其结构损伤及功能破坏，另一方面，还可以作用于细胞及间充质中的水分子，产生大量具有强氧化性的自由基间接引起细胞的损伤。超过安全剂量限值的电离辐射可能造成皮肤坏死、视网膜和晶状体病变、消化系统损伤、造血及免疫系统损伤和器官衰竭等急性放射症状，另外，也会显著增加癌症的发病风险。随着核能利用，辐射医学以及空间探索的快速发展，电离辐射的危害将成为一个不可避免的问题，所以电离辐射损伤的检测及评估具有重要意义。
电离辐射的检测通常都使用物理剂量计，但是由于辐射的随机性和不同个体间的辐射敏感性差异，单纯使用物理剂量计进行检测已经难以全面准确地反映辐射对每个个体的影响。生物标志物能准确反映每个个体受到辐射损伤的情况，可以弥补物理剂量计的缺点。目前，电离辐射检测的主要生物标志物包括淋巴细胞染色体畸变、细胞微核、辐射敏感蛋白分子等，但是这些标志物依然存在不足之处，在及时性、便捷性、稳定性和灵敏性上不够理想。
microRNA（miRNA）是一类长度约为18~24nt的内源性非编码RNA，它们通过与信使RNA (mRNA)序列互补结合来实现基因表达的调控，在生物体的生长、发育、细胞分化、凋亡等一系列重要的生命过程中发挥作用。细胞受到外界环境的刺激之后，可以产生及分泌miRNA到细胞外，并进入循环血中。研究发现，血清中的miRNA大都以被磷脂双分子层结构的囊泡包裹的形式存在，这使得其可以稳定存在于循环系统当中，并且在提取和保存的过程中都具有很好的稳定性，另外，血清也是一种容易采集和检测的样本。因此，血清miRNA具有作为一种便捷、可靠、微创的生物标志物的优势和潜力。
目前，研究发现细胞中许多miRNA能响应电离辐射刺激。Jacob等人的研究（PLOSONE，2013，8 (2) : e57603）也发现，小鼠循环血中的miR-150在受到X射线和γ射线全身照射后呈现出明显的降低趋势，这些结果为血清miRNA作为电离辐射标志物的应用提供了支持。此外，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法可以快速、精确地检测血清中miRNA的表达变化。基于以上背景，电离辐射敏感的血清miRNA具有作为一种便捷、精确的生物标志物的潜力，有可能应用于电离辐射损伤的检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确、可靠的血清miRNA标志物。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该血清miRNA标志物检测电离辐射损伤的方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种血清miRNA标志物，其特征在于：该miRNA标志物是miR-134-5p和miR-155-5p的组合。
所述miR-134-5p的成熟序列为5’- UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG -3’。
所述miR-155-5p的成熟序列为5’-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3’。
如上所述的一种血清miRNA标志物检测电离辐射损伤的方法，包括以下步骤：
⑴从正常个体血清样本中提取总RNA；
⑵利用miR-134-5p反转录引物、miR-155-5p反转录引物、反转录预混液将血清miRNA标志物逆转录为cDNA；
⑶利用miR-134-5p正向扩增引物、miR-155-5p正向扩增引物，通过实时荧光定量PCR技术分别对cDNA中的miR-134-5p和miR-155-5p进行扩增，并利用2-△△Ct方法对所述miRNA标志物的相对变化量进行计算；
⑷将待测对象血清样本按所述步骤⑴~⑶进行操作，然后将待测对象血清样本与正常个体血清样本中所述miRNA标志物进行比较，当miR-134-5p相对表达变化量上升超过1.5倍，同时miR-155-5p相对表达变化量下降超过1.5倍时，则确定所述待测对象有受到电离辐射损伤的风险。
所述步骤⑵中miR-134-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCCCTC-3’。
所述步骤⑵中miR-155-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCT-3’。
所述步骤⑵中反转录预混液是指商品化的miRNA反转录反应预混液。
所述步骤⑶中miR-134-5p正向扩增引物序列为5’-TGTGACTGGTTGACCA -3’。
所述步骤⑶中miR-155-5p正向扩增引物序列为5’-TTAATGCTAATTGTGAT-3’。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明中血清miRNA大都以被磷脂双分子囊泡包裹的形式存在，相比于传统的蛋白类、脂类和大分子核酸标志物，在提取和保存过程中更加稳定，使检测结果更加可靠和准确。
2、本发明采用的qRT-PCR技术对miRNA的检测精度很高，相比于传统的染色体畸变检测技术和蛋白质检测技术，可以大大提高标志物在进行辐射检测中的特异性和敏感性。
3、本发明血清miRNA作为一种新型生物标志物，能为开发更加便捷、灵敏、有效的电离辐射检测方法提供支持。
4、本发明所采用的血清miR-134-5p和miR-155-5p组合经qRT-PCR法验证，对电离辐射很敏感，其表达水平和辐射剂量也存在密切的相关性，能为判断检测对象是否有受到电离辐射损伤的风险提供可靠和准确的评估依据。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1 显示利用qRT-PCR技术验证血清miR-134-5p在碳离子射线和X射线照射后的表达变化情况。（*，#表示P<0.05, **，##表示P<0.01，采用Students’t test 对显著性进行分析）
图2显示利用qRT-PCR技术验证血清miR-155-5p在碳离子射线和X射线照射后的表达变化情况。（*，#表示P<0.05, **，##表示P<0.01，采用Students’t test 对显著性进行分析）
图3显示利用ROC曲线分析血清miR-134-5p在区分未照射组和照射组时的特异性和敏感性。
图4显示利用ROC曲线分析血清miR-155-5p在区分未照射组和照射组时的特异性和敏感性。
具体实施方式
一种血清miRNA标志物，该miRNA标志物是miR-134-5p和miR-155-5p的组合。
其中：miR-134-5p的成熟序列为5’- UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG -3’。
miR-155-5p的成熟序列为5’-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3’。
该血清miRNA标志物检测电离辐射损伤的方法，包括以下步骤：
⑴从正常个体血清样本中提取总RNA。
由于血清样品中RNA的丰度较低，可以采用QIAGENE公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒纯化。在提取之前，加入外源线虫cel-miR-39作为内参，用于PCR反应后数据的归一化处理。具体操作过程如下：
①融化血清样品，加入5倍于样品体积的QIAzol Lysis Reagent，涡旋混匀。如200ul血清需加入1mL QIAzol Lysis Reagent。
②室温下静置5min，加入3.5ul cel-miR-39 (1.6×108copies/ul)。
③加入和开始样品等体积氯仿，盖上盖子，用力摇晃15s。
④在室温下孵化2~3min。4℃，12000 r/min 离心15min。
⑤移取上清到新的EP管中，并避免吸到任何中间相。加入1.5倍体积的100%酒精，吹打混匀。
⑥最多吸取700uL样本，加入到RNeasy MinElute spin column(用于聚集溶液中的核酸，试剂盒有提供)，室温，≥8000 r/min离心1min，弃掉流出液。
⑦剩余的样本重复上一步。
⑧加入700uL BufferRWT 到RNeasy MinElute spin column。室温，≥8000 r/min离心30s，弃掉流出液。
⑨吸取500uL Buffer RPE到RNeasy MinElute spin column。室温，≥8000 r/min离心30s，弃掉流出液。
⑩加入500uL 80% 酒精到RNeasy MinElute spin column。室温，≥8000 r/min，离心1.5min。
⑪把RNeasy MinElute spin column放入新的收集管中，满速下离心5min，再打开盖子晾干5min。
⑫把RNeasy MinElute spin column放入新的1.5mL无RNA酶EP管中。将20ulRNase-free water直接加入到spin column膜的中心。轻轻关上盖子，满速下离心2min洗提RNA。
⑬使用Nanodrop2000紫外分光光度计检测提纯的RNA纯度及浓度，-80℃保存。
⑵利用miR-134-5p反转录引物、miR-155-5p反转录引物、反转录预混液将血清miRNA标志物逆转录为cDNA。
miRNA的反转录引物设计采用Oligo 7软件，设计的引物序列如下所示：
miR-134-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCCCTC-3’。
miR-155-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCT-3’。
将设计的序列提供给广州复能生物科技公司，由该公司合成引物。
反转录预混液是指商品化的miRNA反转录反应预混液，包括：反转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸底物和Mg离子缓冲液。
采用All-in-one First-stand cDNA Sythesis Kit反转录试剂盒（购自广州复能生物科技公司）进行反转录，得到cDNA聚合物用于下游的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。反应体系如表1：
表1 反转录体系加样量表
Figure 685508DEST_PATH_IMAGE001
反转录程序为37℃下反应60min，85℃下灭火5min。
⑶利用miR-134-5p正向扩增引物、miR-155-5p正向扩增引物，通过实时荧光定量PCR技术分别对cDNA中的miR-134-5p和miR-155-5p进行扩增。
miRNA的正向扩增引物设计采用Oligo 7软件，其中：miR-134-5p正向扩增引物序列为5’-TGTGACTGGTTGACCA -3’；miR-155-5p正向扩增引物序列为5’-TTAATGCTAATTGTGAT-3’。
将设计的序列提供给广州复能生物科技公司，由该公司合成引物。
采用All-in-oneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit试剂盒（购自广州复能生物科技公司）进行血清miR-134-5p和miR-155-5p的定量检测，具体操作过程如下：
融解All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit 中的2×All-in-One qPCRmix， 混匀、短暂离心后置冰上待用。反应体系如表2：
表2实时定量PCR反应体系加样量表
Figure 445654DEST_PATH_IMAGE002
反应程序如表3：
表3实时定量PCR反应程序
Figure 712687DEST_PATH_IMAGE003
为保证准确性，每个样本加3个复孔。
反应得到血清miRNA的Ct值，利用2-△△Ct法进行分析，公式如下：
变化倍数（Fold change）=2-△△Ct，△△Ct=△Ct(待测组)-△Ct(正常组)
其中，△Ct =Ct(miRNA)-Ct(内参)，Ct(miRNA)为本发明标志物miRNA的Ct值，Ct(内参)为外加线虫cel-miR-39（内参）的Ct值。
对miRNA标志物的相对变化量进行计算。
⑷将待测血清样本按步骤⑴~⑶进行操作，然后将待测血清样本与正常个体血清样本中miRNA标志物进行比较，当miR-134-5p相对表达变化量上升超过1.5倍，同时miR-155-5p相对表达变化量下降超过1.5倍时，则确定待测血清样本有受到电离辐射损伤的风险。
【本发明所得的标志物验证】
①待测样品的制备：
利用Faxitron R650 型X射线仪产生的X射线作为低LET电离辐射的代表，以兰州重离子加速器冷却储存环（HIRFL-CSR）生物辐照终端产生的碳离子束作为高LET电离辐射的代表，对模式实验动物昆明小鼠进行全身照射。照射剂量为0Gy、0.5Gy和2Gy，每个剂量组3只小鼠。
在辐射后24小时，抽取不同照射剂量小鼠的全血至无RNA酶的EP管中，整个过程避免剧烈晃动，并且不要让杂质落入管中，以防溶血。将全血在室温下放置1h，5000 r/min离心10分钟，吸取上层澄清的血清，放入新的无RNA酶管中，再5000 r/min离心10分钟，吸取上清，即可分离得到检测所需的血清样品，储存于-80℃保存。
②miRNA PCR芯片检测操作：
所用芯片为MiRCURY LNAe Universal RT microRNA PCR芯片，购自Exiqon公司。miRNA芯片表达谱的检测按照芯片试剂盒说明书进行。
③miRNA芯片检测结果：
使用GenEx qPCR分析软件（www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis）对芯片数据进行标准化和深入的数据分析。
④qRT-PCR实验结果统计和分析：
反应得到所述血清miRNA的Ct值，利用2-△△Ct法进行分析，公式如下：
变化倍数（Fold change）=2-△△Ct， △△Ct=△Ct(照射组)- △Ct(未照射组)
其中，△Ct =Ct(miRNA)-Ct(内参)，Ct(miRNA)为本发明标志物miRNA的Ct值，Ct(内参)为外加线虫cel-miR-39（内参）的Ct值。
通过对受到电离辐射小鼠的血清miR-134-5p和miR-155-5p进行qRT-PCR相对定量检测可以发现，血清miR-134-5p在受到0.5Gy和2Gy的碳离子和X射线照射后相对表达变化显著升高且变化量超过了1.5倍（图1），血清miR-155-5p相对表达变化显著降低且变化量超过了1.5倍（图2），说明血清miRNA标志物对低LET和高LET电离辐射都具有较强敏感性，可作为电离辐射标志物。
为了进一步保证本发明miRNA标志物在应用于电离辐射检测中的准确性，可以结合两种miRNA进行判断，即当miR-134-5p相对表达变化量上升超过1.5倍，同时miR-155-5p相对表达变化量下降超过1.5倍时，可以判断检测对象有受到电离辐射损伤的风险。
【分析本发明miRNA标志物应用于电离辐射检测的评估效果】
利用ROC曲线（受试者工作特征曲线）分析本发明血清miRNA应用于电离辐射检测的特异性和敏感性，其中，AUC（曲线下面积）值表示该标志物的评估效果，AUC值在0到1之间，AUC值越大说明该标志物在检测电离辐射时的特异性和敏感性越好。ROC曲线分析显示，血清miR-134-5p在区分未照射组和照射组（0.5Gy和2Gy）时，对于碳离子辐射，其AUC值达到0.917，对于X射线辐射，其AUC值达到0.875（图3）。血清miR-155-5p在区分未照射组和照射组（0.5Gy和2Gy）时，对于碳离子辐射，其AUC值达到0.889，对于X射线辐射，其AUC值达到0.806（图3）。通常，ROC曲线分析中AUC值达到0.80以上说明该标志物具有较好的评估效果。
本发明中，血清miR-134-5p和miR-155-5p在进行不同LET的电离辐射检测时，其AUC值都大于0.80，说明两种血清miRNA作为电离辐射标志物具有较好的评估效果，结合两种血清miRNA标志物判断电离辐射损伤风险的方法具有较好的准确性和敏感性。
应当指出，上述实施例只是用于理解本发明的方法及其核心思想，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：该miRNA标志物是miR-134-5p和miR-155-5p的组合；所述miR-134-5p的成熟序列为5’-UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG -3’；所述miR-155-5p的成熟序列为5’-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3’。
2.如权利要求1所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，包括以下步骤：
⑴利用miR-134-5p反转录引物、miR-155-5p反转录引物、反转录预混液将血清miRNA标志物逆转录为cDNA；
⑵利用miR-134-5p正向扩增引物、miR-155-5p正向扩增引物，通过实时荧光定量PCR技术分别对cDNA中的miR-134-5p和miR-155-5p进行扩增，并利用2-△△Ct方法对所述miRNA标志物的相对变化量进行计算；
⑶将待测血清样本与正常血清样本中所述miRNA标志物进行比较，当miR-134-5p相对表达变化量上升超过1.5倍，同时miR-155-5p相对表达变化量下降超过1.5倍时，则确定待测对象有受到电离辐射损伤的风险。
3.如权利要求2所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：所述步骤⑵中miR-134-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCCCCTC-3’。
4.如权利要求2所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：所述步骤⑵中miR-155-5p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCT-3’。
5.如权利要求2所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：所述步骤⑵中反转录预混液是指商品化的miRNA反转录反应预混液。
6.如权利要求2所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：所述步骤⑶中miR-134-5p正向扩增引物序列为5’-TGTGACTGGTTGACCA -3’。
7.如权利要求2所述的一种血清miRNA标志物在制备诊断电离辐射损伤试剂中的应用，其特征在于：所述步骤⑶中miR-155-5p正向扩增引物序列为5’-TTAATGCTAATTGTGAT-3’。
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CN109385472A (zh) 2019-02-26

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