CN109385403A - 靶向gpc3的car nk细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表达特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的NK细胞。进一步地，本发明涉及该NK细胞在预防和/或治疗癌症，优选GPC3表达癌症中的用途。本发明还涉及该NK细胞作为靶向细胞治疗剂和/或用于过继性癌症免疫治疗的用途。本发明还涉及用于产生该NK细胞的方法、用于鉴别该NK细胞的方法以及通过该方法获得或鉴别的NK细胞及其用途。

Description

靶向GPC3的CAR NK细胞
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及包含GPC3-CAR的NK细胞或细胞系。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和免疫细胞的活化基序相结合，通过基因转导可以赋予免疫细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的生命力。该项技术最先在T细胞中实施并在CD19阳性的B淋巴细胞性白血病患者取得了巨大的成功。但由于CAR-T细胞是通过采集患者的T细胞，并进行修饰后给药的，为单人单次制备，治疗成本较高，并且，T细胞在体内的大量扩增通常引发细胞因子风暴，因此存在安全性的风险。
NK细胞作为重要的广谱强力的肿瘤免疫细胞，也能够通过CAR技术改造赋予其靶向识别并摧毁肿瘤细胞的作用。NK细胞有多个成熟的永生化的细胞系，其中NK-92可在体外长期培养扩增，基因表型稳定，研究结果具有可重复性，已有一些研究人员尝试将NK-92细胞表达CAR(例如CN201580032729.X)，但由于肿瘤组织具有极复杂的微环境，CAR-NK-92细胞能否在体内实现对肿瘤细胞的杀伤会受到多种因素的影响，具有极大的不确定性。并且由于前期CAR-T研发积累了大量的设计策略和构建方法方面的经验，CAR-NK的研发大多是对CAR-T的直接模仿和改造。
因此，本发明急需有效的CAR-NK细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的NK细胞。
在具体的实施方式中，NK细胞可以是原代的NK细胞，也可以是NK92-细胞。例如，本发明提供一种表达特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的NK-92细胞或细胞系。
本发明的另一目的在于提供所述NK-92细胞或细胞系在预防和/或治疗癌症，优选GPC3表达癌症中的用途。
本发明还有的目的在于提供所述NK-92细胞或细胞系作为靶向细胞治疗剂和/或用于过继性癌症免疫治疗的用途。
本发明还有的目的在于提供用于产生该NK-92细胞或细胞系的方法、用于鉴别该NK-92细胞或细胞系的方法以及通过该方法获得或鉴别的NK-92细胞或细胞系及其用途。
在第一方面，本发明提供一种基因工程改造的NK细胞，其特征在于，所述细胞表达特异性识别GPC3的嵌合受体，所述的嵌合受体包含识别GPC3的胞外域、跨膜域、和/或细胞内结构域。
在具体的实施方式中，所述NK细胞是NK-92细胞。
在优选的实施方式中，所述胞外域具有SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3和/或及SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在具体的实施方式中，所述胞外域具有SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在具体的实施方式中，所述特异性识别GPC3的胞外域含有SEQ ID NO：13所示的重链可变区和SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。
在具体的实施方式中，所述特异性识别GPC3的胞外域具有SEQ ID NO：1所示的序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合受体具有SEQ ID NO：16、17、18、或19所示的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，
(i)所述的跨膜域选自以下蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链；CD28；CD3ε；CD45；CD4；CD5；CD8；CD9；CD16；CD22；CD33；CD37；CD64；CD80；CD86；CD134；CD137；CD154；KIRDS2；OX40；CD2；CD27；LFA-1(CD11a；CD18)；ICOS(CD278)；4-1BB(CD137)；GITR；CD40；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA1；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244、2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；SLAMF6(NTB-A、Ly108)；SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；NKG2D；和NKG2C；和/或
(ii)所述的细胞内结构域包括：转录因子结合域；一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：
(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ；CD3γ；CD3δ；CD3ε；常见FcRγ(FCER1G)；FcRβ(FcεR1b)；CD79a；CD79b；FcγRIIa；DAP10；和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或
(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27；CD28；4-1BB(CD137)；OX40；CD30；CD40；PD-1；ICOS；淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)；CD2；CD7；LIGHT；NKG2C；B7-H3；特异性结合CD83的配体；CDS；ICAM-1；GITR；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；CD4；CD8α；CD8β；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA4；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；TRANCE/RANKL；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；CD69；SLAMF6(NTB-A；Ly108)；SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；LAT；GADS；SLP-76；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；和NKG2D，或其组合。
在第二方面，本发明提供本发明第一方面所述的细胞用于制备预防和/或治疗癌症药物的用途，所述癌症表达GPC3，所述癌症优选自肝癌，肺癌，胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤。
在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的细胞在制备用作靶向细胞治疗剂和/或用于过继性癌症免疫治疗的药物中的用途。
在具体的实施方式中，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物的使用说明书中记载了所述预防和/或治疗癌症药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物与化疗药物或放射治疗同时给予。
在优选的实施方式中，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物还包含化疗药物。
在具体的实施方式中，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物用于治疗肝癌。
在具体的实施方式中，所述化疗药物是治疗肝癌的化疗药物；优选式I或者式II所示的化合物：
在具体的实施方式中，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物的使用说明书中记载了在给予细胞之前，对要给药的个体进行预处理。
在优选的实施方式中，所述预处理为给予化疗药物或者放射治疗，控制肿瘤负荷的增加。
在具体的实施方式中，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物还包含淋巴细胞消耗剂作为进行预处理的试剂，以便消耗所述个体的淋巴细胞。
在具体的实施方式中，所述淋巴细胞消耗剂为氟达拉滨、环磷酰胺。
在第四方面，本发明提供本发明的NK细胞的制备方法，包括：制备得到表达嵌合抗原受体的NK细胞，对表达嵌合抗原受体的NK细胞采用照射的方法进一步处理；优选地，采用γ射线照射预处理表达嵌合抗原受体的NK细胞。
在具体的实施方式中，所述NK细胞是NK-92细胞。
在第五方面，本发明提供预防和/或治疗对象的癌症的方法，所述癌症表达GPC3，包括将本发明的细胞给予需要治疗癌症的对象。
在优选的实施方式中，所述癌症优选自肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤；优选肝癌。
在优选的实施方式中，本发明的预防和/或治疗对象的癌症的方法包括同时给予需要治疗癌症的对象本发明的细胞与化疗药物或放射治疗。
在优选的实施方式中，所述化疗药物是治疗肝癌的化疗药物；优选式I或者式II所示的化合物：
在优选的实施方式中，本发明的预防和/或治疗对象的癌症的方法包括在给予本发明的细胞之前，对要给药的个体进行预处理。
在优选的实施方式中，所述预处理为给予化疗药物或者放射治疗，控制肿瘤负荷的增加。
在优选的实施方式中，所述预处理为利用淋巴细胞消耗剂消耗所述个体的淋巴细胞。
在优选的实施方式中，所述淋巴细胞消耗剂为氟达拉滨、环磷酰胺。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是NK-92/9.28.z细胞的流式检测结果；
图2A比较了亲代(Parental)NK-92、Mock和NK-92/9.28.z细胞的体外杀伤活性；图2B显示了在低效靶比下NK-92/9.28.z细胞的体外杀伤结果；图2C显示了在缺氧状态下NK-92/9.28.z细胞的体外杀伤结果；图2D显示了在TGF-β存在下NK-92/9.28.z细胞的体外杀伤结果；图2E显示了血清水平的GPC3对NK-92/9.28.z细胞的体外杀伤影响结果；
图3A显示了NK-92/9.28.z细胞脱颗粒酶的释放情况；图3B显示了IFN-gama的分泌结果；图3C显示了NK-92/9.28.z IFN-gamma分泌量与肿瘤细胞表面GPC3表达值呈正比；
图4A显示了SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3移植瘤模型中，NK-92/9.28.z细胞的抑瘤作用；图4B显示了NK-92/9.28.z细胞浸润肿瘤局部发挥抗肿瘤作用的结果；图4C显示了NK-92/9.28.z细胞浸润肿瘤局部的免疫组化结果；
图5显示了NK-92/9.28.z细胞治疗对重要脏器器官的影响；
图6A显示了NK-92/9.28.z对内源性中高表达GPC3Huh-7皮下移植瘤的抑瘤情况；图6B显示了NK-92/9.28.z对原位肿瘤的抑瘤情况；图6C为Huh-7原位移植瘤的生长情况统计图；图6D显示了原位移植瘤模型中各组小鼠体重变化情况；图6E显示了原位移植瘤模型中NK-92/9.28.z的浸润情况；
图7A显示了PLC/PRF/5皮下移植瘤模型的肿瘤体积变化情况；图7B显示了PLC/PRF/5皮下移植瘤模型的肿瘤重量变化情况；图7C显示了PLC/PRF/5皮下移植瘤模型中小鼠体重变化情况；
图8A显示了在杀伤过程中细胞因子的释放情况；图8B显示了NK-92/9.28.z杀伤靶细胞后单核细胞释放IL-6的结果；
图9A显示了PBNK/9.28.z的体外细胞杀伤情况，图9B显示了PBNK/9.28.z的干扰素释放水平；
图10显示了PBNK/9.28.z对正常细胞的杀伤情况；
图11显示了索拉菲尼和NK-92/9.28.z细胞联用的细胞杀伤情况。
具体实施方式
在下面更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于本文中描述的特定的方法、方案和试剂，因为这些是可以变化的。还应理解，本文中使用的方法是仅用于描述特定实施方式的目的，且不意图限制本发明的范围，其仅由所附权利要求限定。除非另外说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。
术语
所述的“天然杀伤(NK)细胞”，是用于过继性癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。与T细胞类似，NK细胞可以被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)来增强抗肿瘤活性，但关于CAR-工程化NK细胞的经验是有限的，且缺乏临床开发的数据。。除了原代细胞之外，NK细胞有许多成熟的细胞系，包括NK-92、NKG、YT、NK-YS、HANK-1、YTS和NKL等等。在本发明的具体实施方式中，采用NK-92细胞系或者原代NK细胞时，用本发明的嵌合抗原受体修饰的NK细胞的效果最佳。
“细胞治疗剂”，特别是"靶向细胞治疗剂"或"靶向同种异基因细胞治疗剂"是指适合施用以用于过继性癌症免疫治疗的免疫细胞，其经遗传修饰以表达特异性识别在靶肿瘤细胞的表面上表达的限定抗原的抗原受体。“过继性、靶细胞特异性免疫治疗”或“过继性癌症免疫治疗”或“过继性细胞治疗(ACT)”是指其中免疫细胞转移到携带肿瘤的宿主的治疗形式。免疫细胞具有抗肿瘤反应性且可以介导直接或间接的抗肿瘤作用。
术语“GPC3”为磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)，是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端(C末端)肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。
本文所用的“嵌合抗原受体”、“嵌合受体”或“CAR”是指这样的多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域(也称跨膜区或跨膜域)和细胞内结构域(本文中也称为“胞内区”或“胞内域”)。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。
所述的“嵌合抗原受体”能够特异性识别GPC3。
在具体实施方式中，所述的细胞内结构域包括一级信号传导结构域、或共刺激信号传导结构域、或者一级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
在具体实施例中，一级信号传导结构域可以选自：CD3ζ；CD3γ；CD3δ；CD3ε；常见FcRγ(FCER1G)；FcRβ(FcεR1b)；CD79a；CD79b；FcγRIIa；DAP10；和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域。在一实施例中，可以选择人CD3ζ(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)。
在具体实施例中，共刺激信号传导结构域可以选自如下的蛋白质的信号传导结构域：CD27；CD28；4-1BB(CD137)；OX40；CD30；CD40；PD-1；ICOS；淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)；CD2；CD7；LIGHT；NKG2C；B7-H3；特异性结合CD83的配体；CDS；ICAM-1；GITR；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；CD4；CD8α；CD8β；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA4；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；TRANCE/RANKL；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；CD69；SLAMF6(NTB-A；Ly108)；SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；LAT；GADS；SLP-76；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；和NKG2D，或其组合。
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。在一实施例中，可以选择人CD137的胞内域(氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示)、或者人CD28胞内域(氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示)，或者人CD137的胞内域和人CD28胞内域的组合。
所述的跨膜域选自以下蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28；CD3ε；CD45；CD4；CD5；CD8；CD9；CD16；CD22；CD33；CD37；CD64；CD80；CD86；CD134；CD137；CD154；KIRDS2；OX40；CD2；CD27；LFA-1(CD11a；CD18)；ICOS(CD278)；4-1BB(CD137)；GITR；CD40；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA1；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；SLAMF6(NTB-A；Ly108)；SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；NKG2D；和NKG2C；所述的细胞内结构域包括：转录因子结合域；一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ；CD3γ；CD3δ；CD3ε；常见FcRγ(FCER1G)；FcRβ(FcεR1b)；CD79a；CD79b；FcγRIIa；DAP10；和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27；CD28；4-1BB(CD137)；OX40；CD30；CD40；PD-1；ICOS；淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)；CD2；CD7；LIGHT；NKG2C；B7-H3；特异性结合CD83的配体；CDS；ICAM-1；GITR；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；CD4；CD8α；CD8β；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA4；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；TRANCE/RANKL；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；CD69；SLAMF6(NTB-A；Ly108)；SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；LAT；GADS；SLP-76；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；和NKG2D，或其组合。作为示例，可以选择CD28的跨膜域(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)、CD8的跨膜域(氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示)。
在具体实施方式中，嵌合抗原受体还含有铰链区。在一实施例中，可以选择CD8的铰链区，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在具体的实施方式中，本发明的嵌合受体具有SEQ ID NO:16、17、18、或19所示的氨基酸序列。
GPC3-特异性NK-92细胞或原代NK细胞
本发明的GPC3-特异性NK-92细胞或原代NK细胞含有编码嵌合抗原受体的慢病毒载体，该嵌合抗原受体包含GPC3-特异性scFv抗体片段、铰链区、CD28的跨膜和细胞内结构域及CD3ζ的细胞内结构域。
本发明的NK-92细胞或原代NK细胞特征在于：显示降低的天然细胞毒性或不显示天然细胞毒性，即：与GPC3阳性的细胞相比，对GPC3-阴性细胞具有降低的细胞毒性或没有细胞毒性。
所述降低的天然细胞毒性构成本发明的细胞或细胞系的重要安全性特征，特别是在临床应用方面。
本发明的NK-92细胞或或原代NK细胞与未修饰的NK-92细胞或原代NK细胞相反-以高效率裂解GPC3-表达肿瘤细胞，但与未修饰NK-92细胞或原代NK细胞相比较少可能攻击GPC3-阴性非靶细胞。
进一步的特征：在一个实施方式中，GPC3-特异性scFv抗体片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由其组成。
嵌合抗原受体(CAR)是本领域中已知的。本发明中使用的GPC3-特异性CAR包含：
(i)GPC3-特异性scFv抗体片段，
(ii)铰链区，
(iii)跨膜域，在一具体实施方式中，可选择CD28的跨膜域或者CD8的跨膜域，也可以选择制备CAR的技术中，常用的其他的跨膜域。
(iv)胞内域，在一具体实施方式中，胞内域具有CD3ζ的细胞内结构域，和/或共刺激信号域，可选的，共刺激信号域可以为CD28的共刺激信号域或者CD137的共刺激信号域。本发明的CAR-NK-92细胞，可以采用γ-照射阻止细胞的复制，以作为对于临床应用的潜在安全性措施，而体外和体内抗肿瘤活性被保持。
考虑到NK-92可能存在致瘤性。在利用本发明的CAR NK-92细胞进行治疗时，优选包括通过照射，优选γ-照射进行细胞的预处理。
本领域技术人员应理解，所述照射是一种安全性措施，可采用各种常规的方式进行。
靶向GPC3 NK-92/9.28.z细胞的细胞毒性分析
对于GPC3阴性的肝癌细胞，NK-92/9.28.z没有增强的杀伤作用；当过表达GPC3后，这些细胞对NK-92/9.28.z敏感性增强，体现了NK-92/9.28.z细胞靶向性杀伤的作用。细胞治疗实体瘤的一个障碍是进入局部微环境的效应细胞太少，达不到一个有效的效靶比去杀伤细胞，当大幅度降低效靶比，如果延长共孵时间，也能够达到一个很好的特异性杀伤；微环境中低氧和TGF-β是制约细胞治疗发挥效应的因素，而本发明显示在二者存在的情况下，NK-92/9.28.z也还是存在很好的特异性杀伤效果；血液存在分泌性GPC3，但在本发明中并不会影响NK-92/9.28.z细胞对肿瘤细胞的毒性作用。我们的数据表明编码GPC3-CAR的NK-92细胞可以耐受多种恶劣条件发挥作用，对于各种GPC3-阳性恶性肿瘤的治疗是临床上可用的。
NK-92/9.28.z细胞脱颗粒和细胞因子分泌情况
NK细胞起快速的毒性杀伤作用依赖于溶酶体释放颗粒酶，CD107a是溶酶体上的一个蛋白，在释放颗粒酶的时候能指示溶酶体与细胞膜的融合情况，是NK-92细胞上的一个活化指标。我们可以从NK细胞活化层面揭示了CAR的靶向性，有实施例显示NK-92/9.28.z与GPC3阳性的肝癌细胞共孵有显著增强的CD107a表达，而与GPC3阴性的肝癌细胞共孵则没有观察到这个现象；对NK本身敏感的K562细胞，两组的CD107a表达一致，说明CAR修饰不会影响NK细胞内源性杀伤功能；NK-92/9.28.z和对照组细胞分别与肿瘤细胞共孵育时，NK-92/9/28.z组明显分泌更多的IFN-gama，并且NK-92/9.28.z组IFN-gama分泌量与肿瘤细胞表面GPC3表达值呈正比，因此，本发明从细胞因子层面提示了CAR的靶向特性。
NK-92/9.28.z细胞对移植瘤的治疗效果
CAR-NK介导多种内源性细胞毒受体引起的靶细胞裂解，面对抗原不均一表达的肿瘤可能比CAR-T更有优势。NK细胞异体输注不会引起移植物抗宿主病，其基于KIR-MHC错配的异体模式还可以避免或减少KIR介导的抑制性信号，使得商业化通用型高效“NK血液制品”成为可能。
本发明的实施例表明NK-92/9.28.z在体内也存在抗原依赖性地抑瘤作用，通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制增殖来发挥作用的；且不会浸润重要的脏器组织诱导细胞毒性作用；不会引起治疗相关体重下降副作用。
NK-92细胞是一个肿瘤来源的杀伤细胞系，输入体内有成瘤风险，临床上往往需要辐照后再进行输注，本动物实验设立了一组NK-92/9.28.z细胞的辐照组，结果提示其效果跟未辐照组的NK-92/9.28.z基本一致，为其临床安全应用提供了动物实验依据。
本发明证明NK-92/9.28.z细胞在体内保留靶细胞特异性，且能够穿透组织和归巢到远处肿瘤位点。重要地，经照射的NK-92/9.28.z细胞的体内抗肿瘤活性与非照射的细胞相同。这对于NK-92/9.28.z的未来临床应用可能是有意义的，其中细胞的照射可以如之前在未修饰的NK-92细胞的I期临床实验中所进行的(Arai等,2008；Tonn等,2013)作为安全性措施包括。
肿瘤患者中的免疫细胞通常由于癌症的免疫抑制活性而功能上受损。因此，对于采用NK细胞的过继性癌症免疫治疗，供体来源的同种异基因细胞是优选的，因为它们不识别肿瘤细胞为“自身的”，从而规避抑制性信号(Geller和Miller；2011)。我们已经证明，这一优势可以扩展到CAR-工程化的NK-92细胞。这样的细胞对于各种GPC3-阳性恶性肿瘤的治疗是临床上可用的。
CAR修饰增强原代NK细胞抗肿瘤效果
来自外周血培养得到的原代NK细胞(PBNK细胞)经CAR修饰后，能够特异性杀伤GPC3阳性的肝癌细胞系分泌IFN-γ，而Mock和未转染的NK细胞明显杀伤效应更弱，胞内IFN-γ的表达也更低，体外毒性实验提示，修饰后的原代NK细胞对正常的组织细胞没有明显的毒性作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.CAR-NK92细胞的制备
作为示例性的，本实施例选择靶向GPC3的抗体AB1(scFv的序列如SEQ ID NO：1所示)作为嵌合抗原受体的胞外域。预制备的CAR具有SEQ ID NO：17所示的序列。
1、质粒构建
以PRRLSIN-cPPT.EF-1α为载体，构建了表达抗体AB1的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒，PRRLSIN-cPPT.EF-1α-AB1-28Z。AB1-28Z序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO：2)、AB1的scFv(SEQ ID NO：30)、CD8 hinge(SEQ ID NO：15)、CD28跨膜区(SEQID NO：20)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：21)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO：22)组成。
2、慢病毒包装、病毒浓缩及滴度测定
a.慢病毒包装
1)以5×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜，培养基为含10％胎牛血清(Gibico)的DMEM；
2)分别将目的基因质粒PRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP(Mock)和PRRLSIN-cPPT.EF-1α-AB1-28Z 5.4μg与包装质粒pRsv-REV 6.2μg、RRE-PMDLg 6.2μg、Vsvg 2.4μg溶入800μL空白DMEM培养液，混匀室温孵育5min；将60μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀(或1000rpm涡旋5秒钟)；将质粒混合液加入PEI混合液中，加入后轻轻混匀，室温下孵育20min，得到转染复合物；
3)将转染复合物1.6ml滴加入含11ml DMEM培养基的10cm培养皿中培养，得到慢病毒AB1-28Z，收集病毒液上清，进行浓缩，并测定滴度。
浓缩后的病毒滴度分别为：慢病毒AB1-28Z：2.4×108U/ml，慢病毒Mock：2×108U/ml。
3、CAR-NK-92细胞系的制备
1)Retronectin包被24孔板：每孔加入380μl 5μg/ml的retronectin溶液(PBS)，4度孵育过夜后弃去24孔板中的retronectin溶液(PBS)，PBS洗两次；
2)将NK-92细胞接种于包被了retronectin的24孔板内，每孔细胞数目5×105，培养液体积500μl；按照MOI＝30在PBMC细胞中加入浓缩后的慢病毒(慢病毒AB1-28Z或者慢病毒Mock)，32度，1800rpm，离心40min后，转移至细胞培养箱中；
3)扩增培养：感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度500U/mL的重组人IL-2。
得到表达空载体的Mock NK-92细胞(命名为Mock)或者表达CAR的NK-92细胞(命名为NK-92/9.28.z)。
4、流式分选仪FACSAriaII分选CAR阳性表达的NK-92细胞系(NK-92/9.28.z)
1)准备1×107-2×107个细胞，4度，5000rpm，离心5min，弃上清，PBS洗两次；
2)对照组细胞加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min，PBS(2％NBS)洗两次，重悬后作为对照；
3)检测组细胞+50μl 1:50稀释的生物素-山羊抗人IgG，F(ab’)2抗体，冰上孵育45min；PBS(2％NBS)洗两次；加入50μl PE-SA(1:200稀释)抗体冰上孵育45min；
4)重悬于1ml PBS(10％FBS+1％青链霉素)；
5)充分混匀细胞后分选取300ul细胞悬液进行细胞计数和流式分选仪FACSAriaII机器调试；
6)调节机器电压、设置门的位置，控制分选进样速率为4000-5000个细胞/s，分选出实验组PE阳性的细胞；
7)分选接收管接收的细胞置于37度，5％CO2孵箱进行培养；
流式细胞仪检测NK-92/9.28.z的阳性率，结果如图1所示；经过流式分选的NK-92/9.28.z细胞，相对于Mock组和Parental NK-92组，其表面有显著增强的CAR的表达。其中，Mock组为转染了Mock质粒的NK-92细胞，Parental NK-92就是原始的NK-92细胞。
实施例2.靶向GPC3 NK-92/9.28.z细胞的细胞毒性测定
采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)测定细胞毒性。具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书，检测时间为第6h。
靶细胞：分别接种50μL 2×105/mL的HepG2；Huh-7；Hep3B；PLC/PRF/5；SK-HEP-1；SK-HEP-1/GPC3；SMMC7721；SMMC7721/GPC3细胞于96well板(GPC3阳性的肝癌细胞系：HepG2、Huh-7、SK-HEP-1/GPC3、PLC/PRF/5、SMMC7721/GPC3，GPC3阴性的肝癌细胞系：SK-HEP-1、SMMC7721)。
效应细胞:按效靶比3:1、1.5:1或0.75:1加实施例1所述的Mock；NK-92及NK-92/9.28.z细胞。
实验结果如图2A所示，对于GPC3阳性的肝癌细胞，相比Mock组和Parental NK-92组，NK-92/9.28.z的体外毒性明显更强，对于GPC3阴性的肝癌细胞，NK-92/9.28.z没有增强的杀伤作用；当过表达GPC3后，这些细胞对NK-92/9.28.z敏感性增强，体现了NK-92/9.28.z细胞靶向性杀伤的作用。
为了进一步确认肿瘤微环境对NK-92/9.28.z的影响，还检测了NK-92/9.28.z在不同状态和条件下对肝癌细胞系的毒性作用。
(1)、要想达到良好的抗肿瘤效果，往往需要足够数量的效应细胞去杀伤肿瘤细胞。然而，细胞治疗实体瘤的一个障碍就是进入局部微环境的效应细胞太少，往往达不到有效的效靶比杀伤肿瘤。为了模拟这种体内环境，我们以Huh-7作为靶细胞，降低效靶比后，共孵24小时，进行检测，结果如图2B所示，均能够达到很好对杀伤。
(2)、由于绝大多数实体瘤内存在缺氧微环境，缺氧微环境是重要的抑制免疫治疗效果的因素，因此利用缺氧培养箱模拟缺氧环境，以Huh-7作为靶细胞，检测了在不同含氧状态下(低氧环境的氧气浓度为1％，正常含氧环境的氧气浓度为20％)不同效靶比NK-92/9.28.z的体外毒性情况，结果如图2C所示，在低氧环境下NK-92/9.28.z的杀伤功能并未被显著影响。
(3)、TGF-β是制约细胞治疗发挥效应的另一个重要因素，以Huh-7作为靶细胞，我们在杀伤体系中加入了5-20ng/mL的TGF-β，在效靶比为3:1的条件下，孵育24h，结果如图2D所示，TGF-β能够相对明显地抑制CAR-T/9.28.z的杀伤功能，而NK-92/9.28.z细胞表对TGF-β却表现了相当程度的抵抗，其杀伤功能没有明显地被TGF-β影响。
其中，CAR-T/9.28.z为表达SEQ ID NO：17所示的CAR的T细胞，该T细胞来自外周血，经本领域常规的分子生物学，将慢病毒AB1-28Z感染T细胞得到，具体制备方法可参考CN104140974A、CN106397593A等所示。
(4)、GPC3是一种细胞表面标记物，但GPC3蛋白N端的肽段可被切断入血(GPC3N)，还可以被notum酶在GPI位点剪切形成一个可溶性的GPC3蛋白(GPC3△GPI)释放入血。血清水平的GPC3可能与肝癌细胞膜表面的GPC3竞争，影响NK-92/9.28.z的杀伤效果。我们通过蛋白重组方法表达了GPC3N和GPC3△GPI蛋白，在杀伤体系中加入不同浓度的上述可溶性GPC3蛋白，以Huh-7作为靶细胞，在效靶比为3:1的条件下，孵育6h，结果如图2E所示，二者在各个浓度下均不会显著影响NK-92/9.28.z细胞的杀伤功能。
实施例3.NK-92/9.28.z细胞脱颗粒和细胞因子分泌情况
由于NK细胞起快速的毒性杀伤作用依赖于溶酶体释放颗粒酶，CD107a溶酶体上的一个蛋白，在释放颗粒酶的时候能指示溶酶体与细胞膜的融合情况，因此我们检测了NK-92/9.28.z和Parental NK-92细胞与肿瘤共孵育时脱颗粒情况。通过流式细胞技术，把NK-92/9.28.z细胞与对照组NK-92细胞与SK-HEP-1、SK-HEP-1/GPC3与K562细胞按照不同比例共培养后检测NK细胞表面的CD107a表达情况。培养基作为阴性对照，PMA+IONO刺激作为阳性对照。具体如下：将3×105的NK-92/9.28.z细胞接种到24孔板，同时接种2×105的靶细胞，终体积为400ul，不添加外源性的IL-2，放培养箱培养6小时候收集悬浮细胞；采用流式方式检测表明CD107a的表达，结果如图3A所示，相比对照组(Parental NK-92)，NK-92/9.28.z与GPC3阳性的肝癌细胞(SK-HEP-1/GPC3)共孵有显著增强的CD107a表达，而对GPC3阴性的肝癌细胞没有观察到这个变化，从NK细胞活化层面揭示了CAR的靶向性。对NK本身敏感的K562细胞，两组的CD107a表达一致，说明CAR修饰不会影响NK细胞内源性杀伤功能。PMA+IONO可以非特异性激活免疫细胞，PMA+IONO作用后，NK-92和NK-92/9.28.z上CD107a表达均显著升高，差别无统计学差异，提示嵌合抗原受体修饰NK-92细胞不会影响细胞内源性的杀伤功能。
IFN-γ是NK细胞分泌的最重要细胞因子之一，我们还比较了在效靶比1.5:1的情况下，NK-92/9.28.z和NK-92细胞杀伤常见肝癌细胞系过程中分泌的IFN-γ水平。具体如下：1)将5×104的NK-92/9.28.z细胞接种到24孔板，同时接种5×104的靶细胞，终体积为400ul，不添加外源性的IL-2，放培养箱培养24小时候收集上清；2)采用ELISA的方法检测IFN-gama的表达；
结果如图3B和3C所示，，图3B显示NK-92/9/28.z明显分泌更多的IFN-gama；图3C提示NK-92/9.28.z IFN-gama分泌量与肿瘤细胞表面GPC3表达值呈正比，从细胞因子层面提示了CAR的靶向特性。
实施例4.NK-92/9.28.z细胞对SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3移植瘤的治疗效果
a.NOD/SCID小鼠接种SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3移植瘤
通过皮下接种上述细胞，2×106/只，约15天后瘤体积达到30-50mm3；
b.扩增Mock、NK-92/9.28.z和Parental NK-92细胞；
c.对SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3移植瘤进行NK-92/9.28.z细胞过继免疫治疗
1)d16天，对Nod-Scid小鼠通过腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg)；
2)d17天，测量Nod-Scid小鼠移植瘤体积并进行分组。小鼠共分为3组，包括：生理盐水对照组、Mock对照组、NK-92/9.28.z组，每组小鼠6-8只；
3)d17天，对分组后的Nod-Scid小鼠细胞过继免疫治疗。通过尾静脉注射200ul生理盐水或200ul NK-92、Mock和NK-92/9.28.z细胞，每5天一次；
每隔3-4天测量SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变化，并绘制瘤体积随时间的生长曲线。
取SK-HEP-1/GPC3移植瘤小鼠肿瘤组织，通过流式方式检测NK-92/9.28.z细胞浸润，通过免疫组化方式检测NK-92/9.28.z浸润和检测肿瘤组织增殖及凋亡指标；取SK-HEP-1/GPC3移植瘤小鼠重要脏器，做HE及免疫组化染色。
结果是如图4A所示，对于GPC3阴性表达的SK-HEP-1，NK-92/9.28.z与对照组均没有明显效果；而对SK-HEP-1/GPC3，NK-92/9.28.z治疗组肿瘤要明显小于对照组，提示NK-92/9.28.z在体内也存在抗原依赖性地抑瘤作用。在SK-HEP-1/GPC3这个动物模型中通过流式方法检测了浸润，结果如4B图所示，在接受NK-92/9.28.z治疗的SK-HEP-1/GPC3肿瘤模型中检测到了强荧光，而接受NK-92治疗的SK-HEP-1/GPC3模型和接受以上两种治疗的SK-HEP-1肿瘤模型组都没有检测到明显增强的荧光，提示NK-92/9.28.z可以靶向性浸润GPC3阳性肿瘤；取SK-HEP-1/GPC3模型残余肿瘤组织进行免疫组化染色，结果如图4C所示，CD56在NK-92/9.28.z治疗后切片中弥漫存在，而在NK-92治疗后切片中CD56表达含量很低，从免疫组化层面提示了NK-92/9.28.z靶向性浸润GPC3阳性肿瘤的作用。免疫组化结果进一步提示，相比NK-92细胞，SK-HEP-1/GPC3动物模型在接受NK-92/9.28.z治疗后的肿瘤组织切片Ki67显著降低而剪切型Caspase-3明显升高，提示NK-92/9.28.z是通过抑制肿瘤细胞增殖及促进肿瘤细胞凋亡起效。
取了SK-HEP-1/GPC3移植瘤小鼠心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胰脏，进行HE染色，结果如图5所示，各组无明显区别且均没有观察到病理性改变；提示这个细胞治疗安全性高，不会浸润重要的脏器组织诱导细胞毒性作用。
实施例5.NK-92/9.28.z对内源性中高GPC3 Huh-7皮下和原位移植瘤的治疗效果
采用NOD/SCID小鼠接种Huh-7皮下和原位移植瘤。
皮下移植瘤模型的建立：通过皮下接种Huh-7细胞，2×106/只，约14天后瘤体积达到30-50mm3，得到小鼠皮下移植瘤模型。
原位动物模型更能模拟病人体内真实情况，接种建立了原位Huh-7肝癌的动物模型，通过随机分组方式，每组四只小鼠。
采用NK-92/9.28.z和Parental NK-92细胞，对皮下和原位移植瘤进行过继免疫治疗，具体方法为：皮下和原位移植瘤分别在12、13天进行腹腔环磷酰胺注射(100mg/kg)。D15天，测量Nod-Scid小鼠移植瘤体积并进行分组。皮下移植瘤小鼠共分为3组，包括：生理盐水对照组、NK-92组、NK-92/9.28.z组，每组小鼠6-8只；原位肿瘤组共分为两组，包括：NK-92组和NK-92/9.28.z组，每组4只小鼠。D15和17天，对分组后的NOD/SCID小鼠细胞过继免疫治疗。通过尾静脉注射200ul生理盐水或200ul NK-92、Mock和NK-92/9.28.z细胞，每5天一次；
每隔3-4天测量Huh-7皮下移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变化，并绘制瘤体积随时间的生长曲线，结果如图6A所示。显示了Huh-7皮下移植瘤的生长情况，NK-92/9.28.z治疗组肿瘤体积和肿瘤重量均明显低于其他两组。
对于原位移植瘤，开始进行NK-92/9.28.z或NK-92细胞治疗后，每周进行动物成像，研究结果如图6B所示，NK-92/9.28.z治疗组小鼠肿瘤荧光强度明显弱于NK-92组，说明NK-92/9.28.z对Huh-7原位移植瘤也具有显著疗效，图6C显示了Huh-7原位移植瘤的生长情况，通过总生物体荧光强度进行分析，与parental NK-92细胞治疗组相比，NK-92/9.28.z对Huh-7原位移植瘤也有很好的抑瘤作用(***p<0.001)。
每隔一周通过Luciferase检测肝脏原位肿瘤的生长情况，结果如图6D所示。实验结束时取其肝脏进行免疫组化检测，结果如图6E所示。图6D显示了各组小鼠体重呈可比性的增加趋势，提示NK-92/9.28.z不会引起治疗相关体重下降副作用；同时残余组织进行检测，结果如6E所示，发现了肿瘤组织中浸润型NK-92/9.28.z明显高于对照组，而在肝脏中检测不到其表达，提示NK-92/9.28.z不会引起肝脏的浸润，显示NK-92/9.28.z安全性好。
实施例6.NK-92/9.28.z细胞对内源性低表达GPC3PLC/PRF/5皮下移植瘤的治疗效果
NOD/SCID小鼠接种PLC/PRF/5皮下移植瘤，通过皮下接种上述细胞，2×106/只，约15天后瘤体积达到30-50mm3；
皮下移植瘤分别在12、13天进行腹腔环磷酰胺注射(100mg/kg)；
8)d17天，测量Nod-Scid小鼠移植瘤体积并进行分组。小鼠共分为3组，包括：生理盐水对照组、Mock对照组、NK-92/9.28.z组和NK-92/9.28.z辐照组，每组小鼠6-8只；
9)d17天，对分组后的Nod-Scid小鼠细胞过继免疫治疗。通过尾静脉注射200ul生理盐水或200ul NK-92、Mock和NK-92/9.28.z细胞，每5天一次。
实验结果如图7所示，图7A和7B提示其也有很好的体内抑瘤作用。图7C提示各小鼠体重均衡可比，提示NK-92/9.28.z治疗不会引起体重下降副作用；
NK-92细胞是一个肿瘤来源的杀伤细胞系，输入体内有成瘤风险，临床上往往需要辐照后再进行输注，本动物实验设立了一组NK-92/9.28.z细胞的辐照组(Irradiated NK-92/9.28.z)，结果提示其效果跟未辐照组的NK-92/9.28.z基本一致，为其临床安全应用提供了动物实验依据。
实施例7.NK-92/9.28.z在杀伤靶细胞过程中的细胞因子释放
CRS是CAR-T细胞治疗的常见并发症，甚至可危及生命，CRS的发生可能存在多种机制交叉反应和激活，据报道，IL6、IL-1β、IL-2也都是参与引起或扩大细胞因子释放综合征的重要细胞因子。
因此，我们比较了在效靶比1.5:1的情况下，NK-92/9.28.z和NK-92细胞杀伤SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3过程中分泌的细胞因子水平，检测了NK-92/9.28.z分泌IL6、IL-1β、IL-2的情况，结果如图8A所示，在杀伤过程中，NK-92/9.28.z细胞不会释放IL-1β、IL-2和IL-6。
为了进一步分析NK-92/9.28.z诱发细胞因子风暴的风险，分析了NK-92/9.28.z杀伤靶细胞后能否诱导单核细胞释放IL-6。我们将NK-92/9.28.z和CAR-T/9.28.z和肿瘤细胞Huh-7和单核细胞共孵育36h后，通过ELISA检测培养体系中IL-6的分泌情况。具体的，将用5×103单核细胞接种到96孔板，同时接种3×104NK-92/9.28.z或CAR-T/9.28.z细胞，再加入2×104靶细胞Huh-7，终体积为400μL，不添加外源性的IL-2，放培养箱培养36h后收集上清。对照组包括任意一种细胞和细胞之间两两共培养组，收集上清后通过ELISA方法检测IL-6分泌情况。结果如图8B所示(*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001)，只有CAR-T/9.28.z与Huh-7和单核细胞共存的情况下，IL-6的释放量明显增加，而NK-92/9.28.z与Huh-7共存下，不会引起单核细胞释放IL-6。说明与CAR-T细胞相比，NK-92/9.28.z在杀伤肿瘤细胞的过程中不会刺激单核细胞释放IL-6，是一个非常安全的效应细胞。
实施例8.CAR修饰增强原代NK细胞抗肿瘤效果
采用本领域常规的细胞培养技术，取PBMC，与K562-mbIL21细胞(在K562细胞表面过表达白介素-21(membrane bound interleukin-21)和IL-2共培养、体外扩增NK细胞，磁珠(购自美天旎)分选，得到原代NK细胞，命名为PBNK细胞。
参照实施例1的操作，采用AB1-28Z的慢病毒感染PBNK细胞，得到表达CAR的原代NK细胞，命名为PBNK/9.28.z。采用空质粒感染PBNK细胞，得到Mock’细胞。
参照实施例2的操作，以Huh-7细胞和HepG2细胞为靶细胞，采用LDH试剂盒，进行体外细胞毒性测定，不同效靶比下孵育24h，结果如图9A所示。检测IFN-γ的分泌水平，结果如图9B所示。
以正常的PBMC为靶细胞，检测Mock’细胞和PBNK/9.28.z的细胞杀伤能力，结果如图10所示，显示修饰后的原代NK细胞对正常的组织细胞没有明显的毒性作用。
实施例9.靶向GPC3嵌合抗原受体修饰NK细胞与索拉菲尼联合用于肝细胞肝癌
接种肝癌Huh-7细胞(靶细胞)，24h后加入不同浓度索拉菲尼(浓度分别为2μM、5μM和10μM)或DMSO，加或不加不同效靶比的NK-92/9.28.z细胞(1:1、1:5和1:10)，孵育24h后，采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒测定细胞毒性。实验结果如表1所示，NK-92/9.28.z细胞对Huh-7有显著的杀伤，并呈效靶比依赖性，效靶比越大，NK-92/9.28.z细胞杀伤效应越强，效靶比1:1、1:5、1:10时，细胞杀伤毒性分别为69.2％±3.5％、36.8％±6.5％、22.2％±4.6％；索拉菲尼浓度为10μM、5μM和2μM时，细胞杀伤毒性分别为63.3.3±7.9％、45.6±5.6％和25.3±4.6％；而二者联合组的细胞毒性分别为88.1％±8.9％、56.2％±5.8％和38.3％±2.4％，三组的协同指数分别为：0.42、0.54和0.36，提示索拉菲尼和NK-92/9.28.z细胞联合在一定浓度和效靶比可以协同杀伤肝癌细胞。
表1.NK-92/9.28.z细胞与索拉菲尼联合对肝癌细胞Huh-7杀伤率比较
备注：与单一给予NK-92/9.28.z或者索拉菲尼的组别相比，具有显著性差异，*p<0.05or^p<0.05。
为模拟抗原异质性，将SK-HEP-1和SK-HEP-1/GPC3混合各50％，制备SK-HEP-1/GPC3(50％)群异质性混合细胞。采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒测定索拉菲尼、NK-92/9.28.z细胞、或者其组合的细胞毒性。实验结果如图11所示，索拉菲尼5μM作用48h对SK-HEP-1/GPC3和SK-HEP-1/GPC3(50％)异质性混合细胞有大致相同的杀伤作用，杀伤率分别为54.5％±6.7％和56.8％±5.6％。单用NK-92/9.28.z细胞对SK-HEP-1/GPC3有显著的杀伤，效靶比3:1杀伤率为73.2％±9.2％。对50％SK-HEP-1+50％SK-HEP-1/GPC3这群异质性混合细胞，单用NK-92/9.28.z细胞，效靶比3:1时杀伤率为39.8％±5.6％。对前者细胞，索拉菲尼联合NK-92/9.28.z细胞后对肝癌的抑制作用明显增强，最高达93.6％±10.2％，是NK-92/9.28.z组的1.28倍，是索拉菲尼单药组的1.72倍；对后者异质性混合细胞，二者联用后产生的杀伤毒性最高达88.9％±7.8％，是NK-92/9.28.z组的2.23倍，是索拉菲尼单药组的1.56倍。这一结果显示索拉菲尼和NK-92/9.28.z细胞联用可以更大程度增加异质性细胞群体的杀伤率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明所用的序列信息总结如下：
序列表
<110> 科济生物医药（上海）有限公司
上海市肿瘤研究所
<120> 靶向GPC3的CAR NK细胞
<130> P2018-1292
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370 375 380
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
385 390 395 400
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
405 410 415
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
420 425 430
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
435 440 445
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Arg
465
<210> 19
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
130 135 140
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
145 150 155 160
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
180 185 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
210 215 220
Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
245 250 255
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
260 265 270
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
275 280 285
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
290 295 300
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly
325 330 335
Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala
340 345 350
Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
355 360 365
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
370 375 380
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
385 390 395 400
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
405 410 415
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
420 425 430
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
435 440 445
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
450 455 460
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
465 470 475 480
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
485 490 495
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505 510
<210> 20
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 21
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggccaaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 22
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
acc 63
<210> 25
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 26
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 27
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcagc gactacgaga tgcactgggt gcggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcgcc atccaccccg gcagcggcga caccgcctac 180
aaccagcggt tcaagggccg ggtgaccatc accgccgaca agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggttctac 300
agctacgcct actggggcca gggcaccctg gtgaccgtga gcgccggtgg aggcggttca 360
ggcggaggtg gttctggcgg tggcggatcg gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc 420
ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc atcagctgcc ggagcagcca gagcctggtg 480
cacagcaacg gcaacaccta cctgcagtgg tacctgcaga agcccggcca gagcccccag 540
ctgctgatct acaaggtgag caaccggttc agcggcgtgc ccgaccggtt cagcggcagc 600
ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc agccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg 660
tactactgca gccagagcat ctacgtgccc tacaccttcg gccagggcac caagctggag 720
atcaaacgt 729

Claims (17)

1.一种基因工程改造的NK细胞，其特征在于，所述细胞表达特异性识别GPC3的嵌合受体，所述的嵌合受体包含识别GPC3的胞外域、跨膜域、和/或细胞内结构域。
2.如权利要求1所述的基因工程改造的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞是NK92细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述胞外域为识别GPC3的抗体，具有SEQ ID NO：7、8、9所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，以及SEQ ID NO：10、11、12所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
4.根据权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述抗体含有SEQ ID NO：13所示的重链可变区和SEQ ID NO：14所示的轻链可变区。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO：1所示的序列。
6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述嵌合受体具有SEQ ID NO：16、17、18、或19所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，
(i)所述的跨膜域选自以下蛋白的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链；CD28；CD3ε；CD45；CD4；CD5；CD8；CD9；CD16；CD22；CD33；CD37；CD64；CD80；CD86；CD134；CD137；CD154；KIRDS2；OX40；CD2；CD27；LFA-1(CD11a；CD18)；ICOS(CD278)；4-1BB(CD137)；GITR；CD40；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA1；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244、2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；SLAMF6(NTB-A、Ly108)；SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；NKG2D；和NKG2C；和/或
(ii)所述的细胞内结构域包括一级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中：
(1)所述一级信号传导结构域包含选自：CD3ζ；CD3γ；CD3δ；CD3ε；常见FcRγ(FCER1G)；FcRβ(FcεR1b)；CD79a；CD79b；FcγRIIa；DAP10；和DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域，或其组合；和/或
(2)所述共刺激信号传导结构域包含选自如下的蛋白质的功能信号传导结构域：CD27；CD28；4-1BB(CD137)；OX40；CD30；CD40；PD-1；ICOS；淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)；CD2；CD7；LIGHT；NKG2C；B7-H3；特异性结合CD83的配体；CDS；ICAM-1；GITR；BAFFR；HVEM(LIGHTR)；SLAMF7；NKp80(KLRF1)；CD160；CD19；CD4；CD8α；CD8β；IL2Rβ；IL2Rγ；IL7Rα；ITGA4；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CD11d；ITGAE；CD103；ITGAL；CD11a；LFA-1；ITGAM；CD11b；ITGAX；CD11c；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；LFA-1；ITGB7；TNFR2；TRANCE/RANKL；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAM1；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；CD69；SLAMF6(NTB-A；Ly108)；SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；LAT；GADS；SLP-76；PAG/Cbp；NKp44；NKp30；NKp46；和NKG2D，或其组合。
8.根据权利要求1-7任一项的细胞用于制备预防和/或治疗癌症的药物的用途，所述癌症表达GPC3，所述癌症优选自肝癌，肺癌，胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤。
9.根据权利要求1-7任一项的细胞在制备用作靶向细胞治疗剂和/或用于过继性癌症免疫治疗的药物中的用途。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物的使用说明书中记载了所述预防和/或治疗癌症药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物与化疗药物或放射治疗同时给予。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物用于治疗肝癌。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述化疗药物是治疗肝癌的化疗药物；优选式I或者式II所示的化合物：
13.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物的使用说明书中记载了在给予细胞之前，对要给药的个体进行预处理。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述预防和/或治疗癌症的药物、靶向细胞治疗剂或用于过继性癌症免疫治疗的药物还包含淋巴细胞消耗剂作为进行预处理的试剂，以便消耗所述个体的淋巴细胞。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述淋巴细胞消耗剂为氟达拉滨、环磷酰胺。
16.如权利要求1所述的NK细胞的制备方法，包括：制备得到表达嵌合抗原受体的NK细胞，对表达嵌合抗原受体的NK细胞采用照射的方法进一步处理；优选地，采用γ射线照射预处理表达嵌合抗原受体的NK细胞。
17.如权利要求16所述的NK细胞的制备方法，其特征在于，所述NK细胞是NK-92细胞。
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