CN109370910A - 一种短帚霉及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种短帚霉及其用途，其形态特征：短帚霉DLHA(Scopulariopsis brevicaulis)在PDA培养基上培养7天后产生白色菌落，生长较慢，菌丝分枝、有隔、透明、细长，分生孢子球形或柠檬形、壁厚、表面光滑，有帚状枝。本发明对地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾具有较好的防治效果，环境友好。

Description

一种短帚霉及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种短帚霉，同时还涉及该短帚霉在防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾幼虫方面的用途。
背景技术
地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾是农作物的主要鳞翅目害虫，它们能取食棉花、甘薯、大豆、烟草、甜菜等十字花科和茄科近300种植物的组织。通常造成作物断茎、缺苗、叶片缺损等危害症状，农作物被危害后，通常造成减产、商品价值下降、农民经济利益受损等。这些害虫分布广泛，在我国几乎所有农作物种植区都有发生与危害，局部地区一季会发生多代，且存在世代重叠的显现，严重威胁着农作物的生产，因此，对这些鳞翅目害虫的防治迫在眉睫。
长期以来，生产上主要靠化学防治药剂来防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾等鳞翅目害虫，主要药剂有菊酯类、有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂及其复配药剂等。多年连续大量使用化学药剂使得这些害虫对一些杀虫剂产生抗性,国内外已有它们对多种杀虫剂产生抗性的报道。杀虫微生物或害虫病原微生物能够寄生于害虫体内，随着害虫的生长发育，在害虫体内不断繁殖与扩增，感染害虫的体内组织器官，最后引起害虫发病，直至死亡。它们绿色、安全、环保、在作物害虫的防治中具有重要的应用价值。因此，寻找环境友好的、高效、安全的微生物菌剂，用于地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾等鳞翅目害虫的防治具有广阔的发展空间，同时也是农业安全可持续发展的需要。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾具有较好的防治效果，且有较长时间的预防作用，环境友好的短帚霉。
本发明的另一目的在于提供该短帚霉在防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾方面的用途。
一种短帚霉，其形态特征：在PDA培养基上培养7天后产生白色菌落，生长较慢，菌丝分枝、有隔、透明、细长，分生孢子球形或柠檬形、壁厚、表面光滑，有帚状枝。
该菌种已于2018年7月5日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏号：CCTCC M 2018453，名称为：短帚霉DLHA(Scopulariopsisbrevicaulis DLHA)，
本发明的一种短帚霉DLHA(Scopulariopsis brevicaulis DLHA)的分离，包括以下步骤：
(一)短帚霉DLHA(Scopulariopsis brevicaulis DLHA)的分离
采用“组织分离法”称取5g感病地老虎幼虫于洁净烧杯中，用无菌水冲洗5-10分钟，将洗净后的地老虎幼虫置于无菌滤纸上，充分吸干地老虎幼虫上的水分。无菌条件下将幼虫剪切成3-5mm的小段，将各段虫体组织置于添加有100mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的PDA平板上，28℃黑暗培养，待真菌长出后挑取单孢子纯化；
(二)培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。将制备好的培养基于121℃下高温灭菌20分钟后，待用。
(三)菌种的保种和传代
用18×180mm的试管，盛PDA培养基9ml，做成斜面，接种真菌，28℃培养7-10天，置4℃保存，3个月转种一次；
将纯化后的真菌在PDA培养基上培养，待真菌长出产孢后，用润湿无菌棉签蘸取真菌孢子，将蘸取孢子的棉签于盛有700μl 30％灭菌甘油的保存管中洗涤，洗下真菌孢子。将保存管置于-20℃冰柜中长期保存；
(四)菌种的形态特征
该菌形成的菌落在PDA平板上，28℃，培养7天后产生白色菌落，生长较慢，菌丝分枝、有隔、透明、细长，分生孢子球形或柠檬形、壁厚、表面光滑，有帚状枝。经真菌形态学观察，结合Biolog鉴定结果及ITS序列分析结果，将这一菌株记为短帚霉DLHA(Scopulariopsisbrevicaulis DLHA)。
(五)菌种的培养特性
该菌在15～35℃内均可生长，最适25～30℃；可培养培养初始pH 4.5～10.0，最适8.5～10.0；可培养盐浓度0.5～10％，最佳10％；可培养碳源有L-阿拉伯糖、L-脯氨酸、D-海藻糖、D-甘露糖、甜醇，其中L-阿拉伯糖最佳；可培养氮源有氨、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，其中L-谷氨酸最佳。
本发明的一种短帚霉DLHA在防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾方面的用途。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明经室内叶片饲喂防治实验表明：该菌剂能够显著抑制地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫的生长发育，害虫被感染7-10天后出现死亡，它能够很好地防治地老虎、斜纹夜蛾和烟青虫。具有同化学杀虫剂氰戊菊酯、溴氰菊酯相当的防治效果。该菌剂用湿菌与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、及0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。该菌剂可以直接喷雾农作物叶片上，也可以与害虫诱饵混合置于田间地头。本发明是专门针对地老虎、斜纹夜蛾、及烟青虫害虫开发的生防菌剂。由于是微生物菌剂，对环境友好，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，有利于无公害生产、有机生产。
具体实施方式
一种短帚霉DLHA(Scopulariopsis brevicaulis DLHA)的分离，包括以下步骤：
(一)短帚霉DLHA(Scopulariopsis brevicaulis DLHA)的分离
采用“组织分离法”称取5g感病地老虎幼虫于洁净烧杯中，用无菌水冲洗5-10分钟，将洗净后的地老虎幼虫置于无菌滤纸上，充分吸干地老虎幼虫上的水分。无菌条件下将幼虫剪切成3-5mm的小段，将各段虫体组织置于添加有100mg/L链霉素和100mg/L氨苄青霉素的PDA平板上，28℃黑暗培养，待真菌长出后挑取单孢子纯化；
(二)培养基
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。将制备好的培养基于121℃下高温灭菌20分钟后，待用。
(三)菌种的保种和传代
用18×180mm的试管，盛PDA培养基9ml，做成斜面，接种真菌，28℃培养7-10天，置4℃保存，3个月转种一次；
将纯化后的真菌在PDA培养基上培养，待真菌长出产孢后，用润湿无菌棉签蘸取真菌孢子，将蘸取孢子的棉签于盛有700μl 30％灭菌甘油的保存管中洗涤，洗下真菌孢子。将保存管置于-20℃冰柜中长期保存；
从感病鳞翅目害虫地老虎体内分离得到。短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)DLHA在PDA培养基上培养7天后产生白色菌落，生长较慢，菌丝分枝、有隔、透明、细长，分生孢子球形或柠檬形、壁厚、表面光滑，有帚状枝。
将上述防治地老虎、斜纹夜蛾、及烟青虫的菌株DLHA在PDA培养基上培养10天，向培养皿中添加5ml无菌水，洗下孢子，收集孢子溶液。
取DLHA孢子液与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×103-1×106个/ml，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。所用PDA培养液配制方法为：马铃薯(去皮)200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。将制备好的培养基于121℃下高温灭菌20分钟后，待用。
试验例：短帚霉DLHA对地老虎、斜纹夜蛾及烟青虫的防治试验
菌株DLHA在PDA培养基上培养10天，向培养皿中添加5ml无菌水，洗下孢子，收集孢子溶液。
地老虎、斜纹夜蛾及烟青虫幼虫的准备：在实验室内用昆虫专用饲料或十字花科蔬菜叶片分别饲喂地老虎、斜纹夜蛾及烟青虫的幼虫。饲养条件为：15-27℃，RH 60％,12小时光照/12小时黑暗光周期。收集2龄期幼虫各30头，备用。
DLHA菌剂的制备：取DLHA孢子液与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×103-1×106个/ml，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。所用PDA培养液配制方法为：马铃薯(去皮)200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L。将制备好的培养基于121℃下高温灭菌20分钟后，待用。
设置以下处理饲喂地老虎、斜纹夜蛾及烟青虫幼虫，测定DLHA菌剂对各害虫的防治效果。生防菌处理组，将上述生防菌液均匀喷雾至甘蓝叶片表面，直至流失，晾干后饲喂地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾2龄幼虫；溴氰菊酯处理组，2.5％溴氰菊酯悬浮剂1500倍液喷雾甘蓝叶片，直至流失，晾干后饲喂地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾2龄幼虫；对照组，无菌水喷雾甘蓝叶片，直至流失，晾干后饲喂地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾2龄幼虫。每处理30头幼虫。处理后将害虫置于25±1℃，RH 60％,14小时光照/10小时黑暗光周期下培养，观察记录幼虫的生长发育情况，12天后调查害虫的死亡率，计算防效。
按照以下的方法统计，根据死亡率进行防效统计：
式中：
P2——防效，单位为百分率(％)；
P1——处理死亡率，单位为百分率(％)；
P0——空白对照死亡率，单位为百分率(％)。
甘蓝叶菌剂处理防效试验结果表明，DLHA菌剂处理组能够很好的防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾，其防治效果达到80.6％以上。
表1 DLHA菌剂施用12天后对地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾的防效
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1.一种短帚霉DLHA (Scopulariopsis brevicaulis)，其特征在于：所述菌种的保藏号为CCTCC M 2018453。
2.如权利要求1所述的短帚霉DLHA在防治地老虎、斜纹夜蛾、烟青虫、小菜蛾幼虫方面的用途。
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