CN109364259A - 一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法,属于医药技术领域。本发明通过将利福平、外泌体和电穿孔缓冲液混合,在2~6℃下进行电穿孔处理,得到载有利福平的复合外泌体初体;将载有利福平的复合外泌体初体在35~40℃下孵育25~35min,得到载有利福平的复合外泌体。采用本发明提供的方法能够将利福平包载到外泌体内,使载有利福平的复合外泌体的药物浓度达到2497.5μg/mL。

Description

一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法。
背景技术
外泌体是由细胞的质膜经两次向内凹陷形成多泡体,多泡体再与细胞内膜融合,以胞吐的方式释放出来的直径在30-150nm的微囊泡。已被证明几乎所有的人体细胞均可分泌不同性质的外泌体,且广泛分布于各种体液。
利福平是所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物,对结核杆菌有较强抗菌作用,对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效。利福平为红色或暗红色的结晶状粉末,不溶于水。与其他抗结核药合用起协同作用,并延缓耐药菌株产生。主要用于治疗结核病、脑膜炎和金黄色葡萄球菌感染,外用可治疗沙眼等。但现有技术中的利福平一般为胶囊或者片剂口服药,还未出现相关采用外泌体包载的利福平。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法,能够有效地将利福平包载到外泌体内,且外泌体内的利福平浓度高。
为了解决上述问题,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了一种载有利福平的复合外泌体的制备方法,包括如下步骤:
1)将利福平、外泌体和电穿孔缓冲液混合,在2~6℃下进行电穿孔处理,得到载有利福平的复合外泌体初体;
2)将所述步骤1)的载有利福平的复合外泌体初体在35~40℃下孵育25~35min,得到载有利福平的复合外泌体。
优选的,所述步骤1)中利福平、外泌体和电穿孔缓冲液的质量体积比为9~11mg:95~105μg:100μL。
优选的,所述步骤1)中电穿孔缓冲溶液为海藻糖PBS溶液,所述海藻糖PBS溶液中海藻糖的浓度为50mmol/L;所述海藻糖PBS溶液的pH值为7.2~7.5。
优选的,所述步骤1)中电穿孔处理的条件包括:电压390~410v,电容140~160μF,放电时间0.9~1.1ms。
优选的,所述步骤2)孵育25~35min后还包括将孵育后得到的孵育液依次进行超滤、离心。
优选的,所述超滤用膜的截留分子量为100KDa。
优选的,所述离心的离心力为4500~5500g,离心的时间为25~35min。
本发明提供了一种上述方案所述的方法制备得到的载有利福平的复合外泌体;所述载有利福平的复合外泌体中利福平的浓度为2497.5μg/mL。
优选的,所述载有利福平的复合外泌体储存在PBS缓冲液中。
与现有技术相比,本发明提供的技术方案具有以下优点:
本发明提供了一种载有利福平的复合外泌体及其制备方法,采用本发明提供的方法能够将利福平包载到外泌体内,使载有利福平的复合外泌体中利福平的浓度达到2497.5μg/mL。同时,本发明将利福平包载到外泌体内,外泌体来源于细胞内源途径,是由内含多个囊泡的多泡体向外出芽和胞膜融合后释放到胞外环境中的运输膜泡,作为天然的胞间信息载体的外泌体,以其相对较小的分子结构、天然的分子转运特性和良好的生物相容性,增加穿过生理屏障(如血脑屏障、血睾屏障等)的能力,从而携带利福平更多的透过生理屏障,同时外泌体作为载体包载利福平后可以避免循环系统对利福平的清除,延长体内循环时间,从而能够有效地提高利福平在体液中的药物浓度。
附图说明
图1为外泌体的电镜图;
图2为实施例3中包载利福平后的复合外泌体电镜图;
图3为334nm下利福平的吸光值-浓度标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种载有利福平的复合外泌体的制备方法,包括如下步骤:
1)将利福平、外泌体和电穿孔缓冲液混合,在2~6℃下进行电穿孔处理,得到载有利福平的复合外泌体初体;
2)将所述步骤1)的载有利福平的复合外泌体初体在35~40℃下孵育25~35min,得到载有利福平的复合外泌体。
本发明将利福平、外泌体和电穿孔缓冲液混合,在2~6℃下进行电穿孔处理,得到载有利福平的复合外泌体初体。在本发明中,所述利福平、外泌体和电穿孔缓冲液的质量体积比优选为9~11mg:95~105μg:100μL;更优选为10mg:100μg:100μL。本发明对所述利福平的来源没有特殊限定,采用本领域常规市售产品即可,本发明实施例中购买自重庆华邦制药有限公司。在本发明中,所述外泌体优选为小鼠巨噬细胞系Raw264.7分泌,采用文献(Théry C,Amigorena S,Raposo G et al.Isolation and characterization of exosomesfrom cell culture supernatants and biological fluids.Curr Protoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3.22)所述方法进行分离纯化制备。在本发明中,分离纯化后,优选在电镜下检测是否提取出外泌体。在本发明中,所述电穿孔缓冲溶液优选为海藻糖PBS溶液,所述海藻糖PBS溶液中海藻糖的浓度为50mmol/L。在本发明中,所述海藻糖PBS溶液的pH值优选为7.2~7.5,更优选为7.4。
在本发明中,所述电穿孔处理时的温度为2~6℃,优选为4℃。所述电穿孔处理的条件优选包括:电压390~410v,电容140~160μF,放电时间0.9~1.1ms,更优选包括电压400v,电容150μF,放电时间0.9~1.0ms。在本发明中,所述放电处理后优选取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值,并与未穿孔的组做对比。RNA在260nm处有最大吸光值,穿孔后细胞膜破裂,RNA从细胞中逸出,溶液中RNA浓度增加,吸光值变大。本发明中,在260nm处的吸光值可以反映穿孔的成功与否。
得到载有利福平的复合外泌体初体后,本发明将所述载有利福平的复合外泌体初体在35~40℃下孵育25~35min,得到载有利福平的复合外泌体。在本发明中,所述孵育的温度优选为37℃;所述孵育的时间优选为30min。在本发明中,所述孵育可以促进被穿破的外泌体膜修复。在本发明中,在孵育25~35min后优选还包括将孵育后得到的孵育液依次进行超滤、离心。在本发明中,所述超滤用膜的截留分子量优选为100KDa。在本发明中,所述离心的离心力优选为4500~5500g,更优选为5000g;所述离心的时间优选为25~35min,更优选为30min。本发明中所述超滤、离心的作用为除去游离的利福平。
本发明提供了一种上述方案所述的方法制备得到的载有利福平的复合外泌体。在本发明中,所述载有利福平的复合外泌体的药物浓度优选为2497.5μg/mL。
在本发明中,所述载有利福平的复合外泌体优选储存在PBS缓冲液中。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将9mg利福平、105μg外泌体(外泌体在电镜下的检测结果如图1所示)和100μL电穿孔缓冲液混合,在2℃下进行电穿孔处理(电压410v,电容140μF,放电时间1.1ms,放电处理后取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值,并与未穿孔的组做对比,在穿孔前的吸光度值为0.87±0.06,穿孔后的吸光度值为:2.25±0.13),得到载有利福平的复合外泌体初体。
将载有利福平的复合外泌体初体在35℃下孵育35min,得到载有利福平的复合外泌体。采用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤后,再以4500g的离心力离心35min,得到纯化的载有利福平的复合外泌体。
实施例2
将11mg利福平、95μg外泌体(外泌体在电镜下的检测结果如图1所示)和100μL电穿孔缓冲液混合,在6℃下进行电穿孔处理(电压390v,电容160μF,放电时间0.9ms,放电处理后取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值,并与未穿孔的组做对比,在穿孔前的吸光度值为0.87±0.06,穿孔后的吸光度值为:2.25±0.13),得到载有利福平的复合外泌体初体。
将载有利福平的复合外泌体初体在40℃下孵育25min,得到载有利福平的复合外泌体。采用分子截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤后,再以5500g的离心力离心25min,得到纯化的载有利福平的复合外泌体。
实施例3
将10mg利福平、100μg外泌体(外泌体在电镜下的检测结果如图1所示)和100μL电穿孔缓冲液混合,在4℃下进行电穿孔处理(电压400v,电容150μF,放电时间1.0ms,放电处理后取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值,并与未穿孔的组做对比,在穿孔前的吸光度值为0.87±0.06,穿孔后的吸光度值为:2.25±0.13),得到载有利福平的复合外泌体初体。
将载有利福平的复合外泌体初体在37℃下孵育30min,得到载有利福平的复合外泌体。采用分子截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤后,再以5000g的离心力离心30min,得到纯化的载有利福平的复合外泌体。将得到的纯化的载有利福平的复合外泌体在电镜(4万倍:40K)下进行检测,具体结果如图2所示。由图2可以看出,外泌体基本保持原来的形貌、大小和密度,其内可见点状黑色内容物,符合利福平表现。
同时,用紫外可见光分光光度法(UV法)测定外泌体负载的利福平浓度:首先在334nm下做出“吸光值-浓度”标准曲线,具体如图3所示。再以334nm处吸光值为准,参照标准曲线及对应方程式(图3),计算出对应药物浓度为2497.5μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种载有利福平的复合外泌体的制备方法,包括如下步骤:
1)将利福平、外泌体和电穿孔缓冲液混合,在2~6℃下进行电穿孔处理,得到载有利福平的复合外泌体初体;
2)将所述步骤1)的载有利福平的复合外泌体初体在35~40℃下孵育25~35min,得到载有利福平的复合外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中利福平、外泌体和电穿孔缓冲液的质量体积比为9~11mg:95~105μg:100μL。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中电穿孔缓冲溶液为海藻糖PBS溶液,所述海藻糖PBS溶液中海藻糖的浓度为50mmol/L;所述海藻糖PBS溶液的pH值为7.2~7.5。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中电穿孔处理的条件包括:电压390~410v,电容140~160μF,放电时间0.9~1.1ms。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤2)孵育25~35min后还包括将孵育后得到的孵育液依次进行超滤、离心。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述超滤用膜的截留分子量为100KDa。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述离心的离心力为4500~5500g,所述离心的时间为25~35min。
8.权利要求1~7任意一项所述的方法制备得到的载有利福平的复合外泌体;所述载有利福平的复合外泌体中利福平的浓度为2497.5μg/mL。
9.根据权利要求8所述的载有利福平的复合外泌体,其特征在于,所述载有利福平的复合外泌体储存在PBS缓冲液中。
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