CN105263489B - 抗微生物组合物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制造用于预防或治疗微生物感染的组合物的方法，适用于所述治疗的组合物和用于治疗或预防感染的方法。一种这样的组合物特别地用于治疗反刍动物的乳腺炎。通过乳房内输注将组合物施用于动物的乳房中作为乳腺炎的高度有效的治疗，或作为预防性治疗。在利用本发明的组合物和方法进行治疗期间，动物所产生的乳液不含残留物，例如抗生素、抗微生物剂或抗微生物蛋白，它们可影响其饮用的适用性或制造乳制品(例如奶酪或酸奶)的适用性。所述组合物和方法也用于治疗和预防肺感染；和烧伤和伤口的感染；以及生物膜引起的其它感染。组合物也可用于医用装置以防止感染。

Description

抗微生物组合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种用于制造用于预防或治疗微生物感染的组合物的方法，适用于所述治疗的组合物和用于治疗或预防感染的方法。所述组合物特别地用于治疗反刍动物的乳腺炎。通过乳房内输注将组合物施用于动物的乳房中作为乳腺炎的高度有效的治疗，或作为预防性治疗。在利用本发明的组合物和方法进行治疗期间，动物所产生的乳液不含残留物，例如抗生素、抗微生物剂或抗微生物蛋白，它们可影响其饮用的适用性或制造乳制品(例如奶酪或酸奶)的适用性。所述组合物和方法也用于治疗和预防肺感染；和烧伤和伤口的感染；以及生物膜引起的其它感染。组合物也可用于医用装置以防止感染。
背景技术
牛乳腺炎在兽医畜牧业中为最昂贵的医学症状。乳腺炎是由于乳房的细菌感染导致的。在所述感染中涉及三个元素：微生物、环境因素、和牛自身。葡萄球菌和链球菌为约90％感染的原因，但是其它例如大肠杆菌或假单胞菌也可引起感染。营养、垫料和挤奶技术都影响感染的可能性。并且，泌乳阶段造成影响(乳头破裂并随着泌乳循环进行而损坏)并且动物进行的泌乳次数将指示发炎的可能性(但不必感染)。乳房的感染将导致产乳量下降，以及乳液中体细胞计数(SCC)增加。SCC水平由奶农和乳处理器用作乳品质和存在细菌感染的间接量度。>800,000/ml的SCC，连同动物不适迹象(例如乳房肿胀、触痛)被视为乳腺炎的临床情况。在亚临床情况中，动物没有感染的外在迹象但是乳液中SCC计数增加。通常根据SCC计数向奶农支付他们的乳液，根据低SCC水平分类，更好品质的乳液，吸引奖金。
乳腺炎的常见治疗涉及使用抗生素疗法。使用抗生素通常排除在治疗期间及之后动物乳液的出售，长达9天之久。因为乳腺炎，所以在抗生素治疗期间需要丢弃或至少不能出售乳液对乳品制造商造成额外的巨大经济成本。无销售需求以：
(i)阻止抗生素残留物进入人类食物链：传统的抗生素疗法都需要在治疗期间以及治疗后将乳液丢弃数天。这是为了确保食物链中没有抗生素。食物链中的抗生素将产生两个重大影响-它们因持续地接触药物而增加细菌对药物耐受性的可能性。目前，在美国，因为头孢菌素是用于人病原体治疗的一类重要的药物，所以它们(继早期禁用氟喹诺酮后)已被禁用于畜牧业(Federal Register/第77卷,No.4/星期五,2012年1月6日)。其次，抗生素的存在会明显地影响人肠道的菌群，抑制重要的益生菌细菌，并允许在此环境下一般不能得到'立足'的潜在病原菌增殖。
(ii)确保用于奶酪和酸奶制造的细菌起子培养物没有受到抑制：抗生素残留物的存在将抑制用于制造奶酪和酸奶的起子培养物(例如乳酸杆菌)。这些培养物一般由对抗生素非常敏感的生物体组成，因此在抗生素使用后，需要长时间的弃奶期，以确保起子培养物没有受到抑制。在乳品的水平上，使用Delvo试验是一种用于筛选乳液中抗微生物残留物的相对简单的方法。其基于对抗微生物剂敏感的耐热微生素的使用，并在乳制品实践中被视为'黄金标准'。生物体受到抑制表明乳液中存在抗微生物剂。微生物的生长表明没有抗微生物剂存在。因为不适于后加工，所以丢弃含抗微生物剂的乳液，对奶农造成大损失。目前出售多种抗生素并所有都需要弃奶一段时间。例如，Tetra Delta在治疗期间需要弃奶两天以及在治疗后需要弃奶5天。Ubro Yellow在治疗期间需要弃奶三天以及在治疗后需要弃奶6天。Terrexine在治疗期间需要弃奶一天以及在治疗后需要弃奶6天。出售的所有抗生素都需要弃奶。弃奶被奶农视为乳腺炎引起的最大损失。
提出使用除抗生素外的治疗乳腺炎的化合物，而不需消退期。美国专利号6794181描述了称为乳酸链球菌肽的醚抗生素类化合物的分离和用途。所述化合物具有抗微生物性质。乳酸链球菌肽，以及类似化合物(例如，美国专利07/317,627；5950269和20110269671)为抗微生物肽，而不是抗生素，因此在乳液中没有抗生素残留物。但是，在其它防腐方法不存在下，乳酸链球菌肽不抑制革兰氏阴性细菌、酵母、或霉菌。因此，乳酸链球菌肽主要用作食品防腐剂并不用作治疗剂，并与其它协同的食品防腐方法例如低pH和高盐浓度组合。并且，在乳液中的乳酸链球菌肽残留物也会抑制用于奶酪和酸奶制造的起子培养物并因此以与抗生素类似的方式干预乳液的下游加工。已发现，例如，如果在任何一个时间治疗大量动物，则在乳液中的乳酸链球菌肽残留物会在一定程度上干扰所培养的乳制品(某些奶酪、酸奶)。使用乳酸链球菌肽也表现出在治疗期间提高动物的体细胞计数，当根据SCC水平向奶农支付时，这是一个严重的缺点。也报道了病原菌对乳酸链球菌肽和类似分子的耐受性。
除了关注与人类医学相关的抗生素耐受性的发展，乳品业的一个主要问题是动物的抗微生物耐受性，这与抗生素使用历史相关。微生物对抗生素药物的耐受性将在重复使用后变得普遍，以使任何特定的抗生素在某个点作为治疗将变得完全无效-这被普遍地视为人类医学和兽医学的一个关键并迫切的挑战。用于乳腺炎的病原生物体包括细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳症支原体、乳房链球菌、和铜绿假单胞菌。其中，金黄色葡萄球菌因微生物的表型而为一个特别问题。细菌菌株能够感染乳房的上皮层，因此避免了抗生素。并且，发现生物体一般以生物膜生长。在生物膜表型中，微生物更加适应抗微生物剂的活动。因此，它们更难治疗。例如，奶牛中金黄色葡萄球菌感染的抗生素治疗通常涉及两个阶段。首先，抗生素将引起初始SCC降低，表明正杀死细菌。但是，抗生素不会到达上皮层的细胞。在短时间范围(例如，2-3周)内，因为在上皮层中生长的细菌细胞在乳房中再次脱落以在营养物富集的环境中增殖，所以感染将自己重新建立。目前，将此种情况分为'慢性乳腺炎'。因为重复使用抗生素导致细菌菌株因重复接触药物而极为可能发展耐受性，所以这些情况的治疗特别困难。这些种情况的治疗成功几率低，即使使用当前最有效的抗生素疗法。在此阶段，饲养动物一般在经济上是不可行的，因此，处死动物，奶农将以>€1,000($1,300)的价格卖掉动物。
因此，与发生乳腺炎相关的经济成本包括：乳产量减少、因所得乳品质不佳而导致收入降低、兽医费用、抗生素处方、因乳液保留和处死动物替换而导致收入降低。
微生物感染
本发明的另一个目的是多种其它细菌感染的预防和治疗。药物递送和对抗生素的耐受性为囊性纤维化(CF)、结核病(TB)和肺炎治疗的一个主要问题。通常因为只是亚抑制浓度的药物到达目标部位(即，肺部)而导致抗生素耐受性。慢性感染通常因此情况而产生，严重地影响患者的健康。添加碘化物和过氧化氢的组合物以预防的方式作用于诊断患有CF的患者，或可用于治疗已发展成肺感染的患者。以雾化喷雾递送，或以生理盐水组合物(或实际上将水用作载体)递送的该组合物可用于医院以最大程度减轻并控制感染，尤其是由细菌的抗生素抗性菌株引起的那些感染。在手术过程期间此为一个特定风险，其中体腔向环境敞开。
烧伤/皮肤/口
身为本发明组合物和方法的适宜目标的其它感染为因烧伤和开放、或慢性伤口而导致的那些感染。关于安全性、效力、及对治疗的细菌耐受性的低风险，在CF或TB治疗中，与目前抗生素治疗方案相比使用所述组合物、治疗或方法的优点将类似于以上所述的那些。本发明者表明，所述组合物有效地治疗基于细胞的生物膜(附着到固体层的那些细胞)。在TB/CF患者肺部中，以及在开放伤口或烧伤中，这为最明显的细菌表型。生物膜表型向细菌赋予对大量抗生素的普遍耐受性。
本发明组合物也可用作具有多种目的的一般抗菌溶液。例如，包含抗菌组合物的漱口水可帮助阻止在口中形成生物膜。同样地，抗菌鼻洗液可用于帮助缓解鼻窦问题，例如鼻窦炎或过敏性鼻炎。目前，使用类固醇和盐水鼻洗液。但是，抗菌盐水洗液也利于阻止和应对鼻腔的细菌定植。
医用装置
使用本发明的抗菌组合物在治疗和预防植入医用装置的细菌感染中也具有多个优点。感染(以异常型生物膜形式)在多种装置例如导管中最常见。
抗真菌剂
感染可因酵母或真菌生长以及细菌产生。因此，能够发挥抗微生物活性(与抗菌活性不同，如利用抗生素的情况)的治疗方案是特别有利的。为此，组合物的所述实例能够清除多种真菌菌株，包括，但不限于：念珠菌(真菌菌株一般被描述成机会病原体。它们可引起多种皮肤病，以及外阴阴道炎和尿路感染)；酿酒酵母(常被称为发面酵母)在食品制造中为一种重要的生物体。其在饮料工业中也造成很大困扰，并在啤酒生产线上是一种典型的生物体，是饮料腐败的原因。
本发明也发现用作抗病毒剂。
过氧化氢用作表面的高浓度消毒剂，只在水溶液中，或与其它化学物组合。3％溶液也用作杀菌剂。因为高浓度(0.15％以上)的过氧化氢对哺乳动物组织造成损伤，所以这些应用不适用于人或动物体内的抗微生物治疗。并且，高浓度的过氧化氢表明妨碍愈合并因其破坏新形成的细胞而导致损伤组织结疤(例如在伤口和烧伤中)。
就在例如UV辐射的处理中作为副产物和作为乳过氧化物酶(或其它过氧化物酶)系统的产物而言，讨论了次碘酸盐(IO-)(EP 2510944Al、专利号US 2012/0021071 Al、专利号US 2012/0128650 Al、专利号5607681)。
次碘酸盐(IO-)，作为过氧化物、过氧化物酶和碘化物的反应产物，其可对在实验室培养基中生长的革兰氏阴性微生物具有杀菌性，但是文献教示了此方法在生理条件下无效，因为IO-的产生因硫氰酸盐的存在而受到抑制，硫氰酸盐化合物的浓度一般在唾液、乳液和其它生理环境中所见(Klebanoff等,1967,J Exp Med 1967126(6):1063-78；Tenovuo等2002Oral Diseases 8,23-29)。IO-一般被视为对革兰氏阳性生物体具有抑菌性(即，只是抑制生长)，作为天然抗微生物乳过氧化物酶系统的一部分。大肠杆菌和铜绿假单胞菌为革兰氏阴性生物体，而金黄色葡萄球菌和链球菌为革兰氏阳性生物体。
过氧化氢自身在高浓度下具有抗菌性，但主要对革兰氏阳性菌有效并被认为只对革兰氏阴性菌例如铜绿假单胞菌具有抑菌性。并且，细菌中存在过氧化氢酶得到甚至对革兰氏阳性菌不大有效的浓度低于3％的的过氧化氢溶液。以类似方式，组织中存在的过氧化氢酶可使过氧化氢在体内仍具有弱抗菌性。例如，在对水疱伤口的金黄色葡萄球菌的临床研究中，利用3％过氧化氢，细菌负荷没有减少。关于过氧化氢在伤口的多个研究中的用途的综述发现“总之，过氧化氢似乎没有负面地影响伤口愈合，但在减少细菌计数中也是无效的(In conclusion,hydrogen peroxide appears not to negatively influence woundhealing,but it is also ineffective in reducing the bacterial count)”(Drosou等,2003,Wounds；15(5))。因此，当前技术教示了将包含少于3％过氧化氢的组合物用于杀菌目的对于体内伤口应用是无效的。关于生理流体，报道了类似发现。例如，或者当将过氧化氢注入感染了多种生物体的患者体内时，没有发现与过氧化物相关的抗微生物活性。当将过氧化氢注感染了过氧化物敏感性大肠杆菌的兔子的血液中时，没有杀菌活性。并且，体外增加包含大肠杆菌的兔子或人血液中过氧化物的浓度没有得到杀菌活性的证据。高浓度的过氧化氢的抗微生物作用的缺乏直接归因于破坏过氧化物的酶(过氧化氢酶)的存在。
多种病原菌(包括金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)表达使过氧化物失活的过氧化氢酶。设计作为用于食物防腐的抗微生物剂、洁齿剂等的过氧化物酶系统的基础为需要过氧化物酶与细菌竞争以将亚毒性浓度的过氧化氢(或其它形式的过氧化物，例如过氧化钠)转化成抗微生物剂，然后过氧化物被细菌清除掉。
文献教示了将过氧化物酶用于催化碘化物与过氧化物之间的反应的固有重要性，过氧化物分子的浓度对哺乳动物无毒。因此，过氧化物酶(以及底物和过氧化物)被认为是使天然抗微生物系统工作的关键-“为了有效，构成系统的三个元素需要同时存在(Inorder to be efficient,the three elements which make up the system need topresent simultaneously)”-Poutrel等(Ann.Rech Vet,1982,13(1),85-89)。Magnusson等(J of Biological Chemistry,第259卷,No.22,1984)详细描述了乳过氧化物酶在将一个氧分子从可利用的过氧化物转移到可利用的碘化物分子中的重要作用。他们教示了过氧化物酶对于调节反应至关重要并对主要产物IO-和IOH(次碘酸)、I2(碘)以及也因过氧化物和碘化物反应而得到的其它亚碘化合物的产生有巨大影响。
碘长时间用作杀死细菌的一种方法。最常见的形式为聚乙烯吡咯烷酮的碘，PVP-I，也称为聚维酮-碘。使其络合以协助其稳定性，否则碘(I2)将快速地消散。其具有显著的红棕色，并在手术期间常被用作局部杀菌剂，或在乳牛场用作乳头浸液，最大程度地减小乳腺炎感染转移的机会。其限制被充分地表征为其与有机物反应不佳，并且如果在血流中具有毒性。
IO-具有几个小时的相对短的半衰期，表明其在治疗中可只发挥暂时静态作用。这通过描述了以下的现有技术报道支持：(i)杀死革兰氏阳性生物体的有效性不佳('因为系统主要的抑菌效果，所以不能掩盖不好的乳液质量(Due to mainly bacteriostaticeffect of the system it is not possible to disguise poor milk quality)'，使用乳过氧化物酶系统用于牛乳防腐的指南(Guidelines for the Preservations of RawMilk by the use of the Lactoperoxidase System),CAC/GL 13-1991,WHO"原料乳防腐的乳过氧化物酶系统(Lactoperoxidase System of Raw Milk Preservation)-Call fordata,2005；Reiter和Harnulv 1984)；(ii)暂时的抑菌效果，其中短时间的延迟后，细菌再次开始增殖(Ishido等,2011Milchwissenschaft66(1)2011；Thomas等,1994,Infectionand Immunity,第62卷,No.2第529-535页；Marks等,2001J Appl.Micro.91,735-741；Kamau等,1990Appl and Env.Micro.第56卷,No.9；McLay等,2002,Int Jour of Food micro,73,1-9)；以及(iii)不能消除生物膜中生长的细菌(Dufour等,Journal of Food Protection,67(2004),第1438-1443页；Abbeele等,1996,Int Rech Sci Stomotol Odontol 39(l-2):57-61)。后者信息教示了IO-在牛乳腺炎中用作治疗的用途，其中生物膜表型定期出现。期望到，基于所公布的数据，IO-化合物不能有效地完全杀死病原体并治愈乳腺炎感染。
但是，就低(<0.5％)浓度的过氧化氢与碘化物之间的反应产物而言，现有技术是不正确的，此反应在过氧化物酶不存在下进行。本发明者表明，这些反应产物有效地杀死大量革兰氏阴性和革兰氏阳性生物体(包括以生物膜形式生长的那些)并且它们提供了一种乳腺炎的高效疗法，其允许在治疗期间产生的乳液安全地用于奶酪制造和其它下游加工。并且，我们公开了，乳过氧化物酶(或任何其它过氧化物酶或任何其它增效剂或化合物)的存在对于在乳液或其它培养基中产生抗微生物活性不必要；并且添加过氧化物酶不提高所得产物的抗微生物效力，也不延长它们在乳液或其它培养基中的活性半衰期(结果3)。抗微生物活性的短寿命本质，并非成为阻碍，在本发明中作为一个关键的优点。这是因为我们公开了一种滴定反应的方法以使从治疗后8-12小时的动物获取的乳液中没有保留抗微生物活性。这是重要的，因为细菌起子培养物用于制造奶酪和酸奶，如果在此时存在抗微生物残余物或制剂将受到抑制。
次硫氰酸盐(OSCN-)通过硫氰酸盐与过氧化物的反应产生，该反应利用过氧化物酶催化。多项研究检验了OSCN-作为限制细菌生长的一种方法的用途。此外，多名患者描述了硫氰酸盐在过氧化物酶反应中的用途(EP 2510944 Al、专利号US 2012/0021071 Al、专利号US 2012/0128650 Al、专利号5607681)。所述文献都教示了使用补充的过氧化物酶使反应继续。Ishido等,2011描述了一种抑制细菌的OSCN-方法。酶催化的系统不能清除假单胞菌菌株和大肠杆菌菌株，即使持续接触时间为48小时。基于OSCN-的其它实验室研究描述了抑菌效果，而不是完全地消除细菌，通常在其大多数分离物中增殖时间(4小时或更少)减少最小；或根本没有抑菌效果，特别在引起乳腺炎的病原体例如大肠杆菌中。其它描述了有必要使用固定化酶以产生OSCN-，这是不适用于乳腺炎治疗的布局。Carlsson和同事(Infect.Immunity,44:581-586,1984)进一步说明了反应的副产物SCN-可在特定条件(例如存在过量过氧化物)下加强过氧化物分子的细胞毒性作用。这些发现教示了OSCN-模型因整体功效的原因用作乳腺炎治疗。
尽管这样，虽然使用OSCN-模型被描述为囊性纤维化的潜在治疗(专利号US 2012/0021071 Al)，但是申请中不包括关于动物或人类试验的数据。但是，在US 2012/0021071Al中，申请者了解因为OSCN-自身不足以用于这个目的，所以需要额外的外来化合物以去除生物膜。在US 8263138 B2中描述了对额外物质的类似需求。的确，本发明的表2中呈示的结果也教示了OSCN-在协同化合物不存在下尝试杀死生物膜培养物的用途。
令人吃惊地是，在本发明中，在过氧化物酶不存在下，包含低(<0.5％)浓度的过氧化氢和碘化物的组合物足以杀死生物膜粘附细胞，不需要添加任何协同化合物来协助生物膜去除。
本发明的抗微生物组合物存在多种其它用途。这些包括哺乳动物肺部的感染。囊性纤维化和结核病为两种目前极难以治疗的疾病。结核病症状由肺部感染引起并需要长期抗生素治疗。囊性纤维化(CF)为一种症状，其中患者不能调节氯离子穿过膜，特别在肺中。症状不可避免地导致多种慢性肺感染。对于任一种症状的抗生素治疗可导致严重的耐药性，使它们的效果最小。目前，抗生素通过血流以静脉内的方式递送，或通过口服悬浮液/片剂递送，或通过吸入递送。医药递送为CF患者的主要问题，因为抗生素不能有效地横穿肺膜到达需要的地方。此导致多种问题，其中通过引入亚抑制浓度导致的耐药性成为一个严重的问题。这使得利用药物的任何进一步治疗失效。
烧伤患者，或具有开放伤口的患者非常容易受到细菌感染，特别是因细菌的葡萄球菌或假单胞菌种属导致的那些。这些感染将不可避免地通过口服或静脉内方式的抗生素方案进行治疗，。这些可以预防的方式实施，或当感染明显时实施。这样使用抗生素通常导致耐药性以及无效的治疗结果。我们想到一种治疗烧伤患者的新颖方法，该方法利用文中公开的抗微生物组合物和方法，利用绷带或敷剂并结合所述的抗微生物组合物，如需要可定期调换或替换。
此外，每年大量的抗生素治疗是因为患者使用而被感染的医用装置。大量生物体导致这种感染，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。对如泌尿或静脉内导管的那些物品的感染通常是因为这些装置的无菌安装。在几天内，装置表面上存在的任何细菌细胞将增殖，导致生物膜的生成。这种生物膜特别难以利用抗生素治疗，因为药物不易穿过进入生物膜量的内细胞，通常导致生物膜对抗生素甚至更大程度的耐受性。医用装置的感染通常需要将其移走以及更换，给患者带来不适。虽然通常在医用装置安装后数天感染明显，但是一般因安装早期存在的细菌引起。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种用于预防或治疗微生物感染的方法和组合物。另一个目的是提供一种组合物，其能够杀死细菌、病毒、真菌和酵母，而不是减缓其生长。又另一个目的是提供一种可杀死耐抗生素的生物体的组合物。
另一目的是提供一种用于治疗临床和亚临床乳腺炎的组合物，而不使用抗生素。本发明的另一目的是提供一种用于乳腺炎的治疗，其不要在治疗期间丢弃乳液。
本发明的另一目的是提供一种乳腺炎的临床解决方案，其易于实施。
本发明的另一目的是提供一种适用于伤口护理并杀死体内或体表定居的细菌的抗菌医药组合物。
目前，尚没有一种产品能够有效地杀死引起乳腺炎的病原体并治愈感染，同时也允许治疗期间产生的乳液立刻加工以用于例如奶酪和酸奶制造。本发明的目的是提供该治疗。另一目的是治疗不会使目标病原体获得抗生素耐受性，这非常有利于兽医学和人类医学。
具体实施方式
根据本发明，提供一种医药组合物，其包含碘化物(I-)和过氧化氢的来源，以及药学有效载体或稀释剂。过氧化氢的浓度可以重量/体积或重量/重量计小于1％。优选地，医药组合物不包含过氧化物酶或淀粉。
医药组合物可包含0.2:1至3:1的碘化物与过氧化氢的重量比。该比率可为0.38:1至1.52:1的碘化物与过氧化氢的重量比。比率可为0.5:1至2.5:1或0.75:1至2.0:1。
比率可选自：-
0.2:1至3:1的碘化物与过氧化氢的重量比，
更优选地，0.38:1至1.52:1的碘化物与过氧化氢的重量比，或更优选地，0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比。
在动物挤奶循环期间，医药组合物可适于达到每升乳液50mg过氧化物和37mg碘化物的最低浓度。
碘化物的来源可为碘化钠、碘化钾、碘化锂、碘化铯、碘化氢、碘化铑、或其它释放碘化物的化合物，或碘化物的缓慢释放形式，例如碘酸盐。如文中所用，术语'碘化物'不包括碘本身或聚维酮碘。碘在血液中或在乳腺中有毒。
过氧化氢的来源可为过氧化氢、或释放过氧化物的过碳酸盐、释放过氧化物的柠檬酸或维生素C、或其它适宜的释放过氧化物的化合物、或通过酶方式，例如利用酶路径还原糖化合物。同样地，使用其它形式(以及因此其它释放形式)的过氧化物可包括过氧化钠、过氧化锂。并且，可使用过氧化物盐，包括氧化钡、过硼酸钠、以及过氧化氢-尿素加合物。类似地，可使用释放氧的伪过氧化物，包括，但不限于，超氧化物、dioygenal、臭氧、和臭氧化物。同样地，也可使用有机过氧化物，可包括，但不限于，过氧酸类、酰基卤化物、脂肪族过氧化物。存在也以适宜方式作用的其它适宜氧化化合物，例如以钾盐形式的高锰酸盐。
当组合物中使用硫氰酸盐时，可使用0.2-5:1或更优选地0.8-1.3:1的硫氰酸盐与过氧化氢的比率。
组合物可适于治疗乳腺炎泌乳的反刍动物。
过氧化物和碘化物组分的递送可同时进行，或顺序进行和/或可通过乳房内装置进行。
药学有效载体为水、盐水、乳液、凝胶或水凝胶。
组合物可通过浸湿的绷带递送。
组合物可适于用作抗微生物鼻洗液，作为抗微生物漱口液、抗真菌洗液，作为消毒剂，加入用于治疗伤口或烧伤感染的绷带或敷剂中，或以用于治疗人类或动物肺部的细菌或真菌感染的喷雾形式雾化。
本发明也提供了一种涂覆了如上所述的组合物的医用装置，以及浸渍了组合物的绷带或敷剂。
也提供了一种消毒剂组合物，其包含碘化物和过氧化氢来源。
在本发明的另一个方面中，提供了一种预防或治疗感染的方法，其包括将碘化物和过氧化氢来源同时或顺序地向需要所述治疗的对象施用。
文中，我们公开了低浓度(例如，0.003％溶液)的过氧化氢能够在过氧化物酶或任何其它增效剂不存在下，通过与特定浓度的碘化物的反应得到有效的抗微生物治疗。除了杀死以浮游形式生长的细菌外，该方法也可用于清除生物膜。
所用组合物包含过氧化氢和碘化物，每种物质在水中的浓度为50-500mg/L；碘化物与过氧化氢的重量比为0.38:1至1.52:1，优选地，碘化物与过氧化氢的重量比为0.76:1(例如，76mg碘化物和100mg过氧化氢，例如通过添加100mg碘化钾，或者通过添加90mg碘化钠提供76mg碘化物，考虑了分子量39的钾与分子量23的钠之间的摩尔差异)：
a)以提供足以杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物的抗微生物活性；
b)以消除在多种表面上生长的细菌生物膜；
c)以当用于治疗环境中时避免对哺乳动物的刺激和损伤；
d)以当注入牛乳腺中时消除乳腺炎感染；
e)以确保该治疗期间产生的乳液不含会影响乳液用于奶酪、酸奶或其它后加工的任何抗微生物活性；
f)以实现上述目标，而不引起目标生物体对治疗本身，或对抗生素的耐受性或抗性。
本发明涉及抗微生物活性来源(通过过氧化氢与碘化物之间的反应产生)的使用，可每天施用一次，或两次，持续1-15天，优选地1-5天。或者，未结合氧的其它来源可通过氧化化合物例如高锰酸盐提供。
同样地，本发明涉及一种利用包含过氧化氢和碘化物的抗微生物组合物以在阻止细菌定居/杀死乳头管组织表面上的细菌中保护乳头管组织的方式。
在一个实施方案中，在动物挤奶后，将包含过氧化氢，100mg(直接以过氧化氢添加；或通过其它来源的过氧化氢得到此浓度)，和碘化钾，100mg，(0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比)的组合物引入乳房环境中，得到抗微生物活性，因此杀死存在的任何微生物。因为化合物的反应性质，必须将它们分离(例如，在分开的乳房内注射器中或在两室注射器中)，直到它们在乳房中混合。当注入空乳房中时，此反应将产生足以杀死引起感染的细菌的抗微生物活性。此外，反应在挤奶时停止(注入后大概10-12小时)，以使乳液的后加工正常进行。在另一个实施方案中，所用过氧化物的来源为过碳酸钠，过氧化氢利用率为20至30％。此可轻易取代并可延长货架期。
本发明涉及使用两个连续注射器递送治疗。
在另一个实施方案中，本发明涉及使用多筒注射器向乳房递送治疗。
目前，乳头浸液通常在挤奶期间使用以最大程度地减少乳头表面的细菌被带入乳房内。此动作可减少乳腺炎事件。常使用以碘为主的化合物(但是在有机物质例如乳液存在下无效)。以活化碘化物为主的组合物因为在更低浓度下可工作所以更有效。本发明所讨论的碘化物与过氧化物之间的反应可用作制剂或用作抗菌乳头浸液、或用作以敷剂为主的开放伤口(或破裂的乳头管组织)的抗菌障壁。
在此环境中，可将过氧化氢和碘化钾凝胶或盐水溶液的制备组合物用于敷剂或绷带。可将敷剂施用于损伤的乳头管组织或其它损伤/未损伤组织。
附图说明
图la和lb人造乳房模型图和示意图。利用蠕动泵通过上部开口注入乳液。注入剂量并利用位于底部的“乳头管”提取样品。
图2改良的罗宾斯装置，填加12个聚氨酯试样以允许生物膜培养物附着和增殖。装置提供了流入介质并通过两端的开口灌注。
图311只动物的体细胞计数(初始，以及开始治疗后的21天)，这些动物利用包含100mg碘化钾和100mg过氧化氢的制剂以一天两次的方式治疗2天。
实施例
1一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；该组合物由过氧化氢和碘化物组成(50-1,000mg过氧化氢和35-700mg碘化钾)。
2一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比(76mg碘化物和100mg过氧化氢)
3一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比(50mg过氧化氢和38mg碘化物–由50mg碘化钾或45mg碘化钠提供)。
4一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(150mg过氧化氢和114mg碘化物-由150mg碘化钾或135mg碘化钠提供)。
5一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(200mg过氧化氢和152mg碘化物-由200mg碘化钾或180mg碘化钠提供)。
6一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(300mg过氧化氢和228mg碘化物-由300mg碘化钾或270mg碘化钠提供)。
7一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(400mg过氧化氢和304mg碘化钾-由400mg碘化钾或360mg碘化钠提供)。
8一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(500mg过氧化氢和380mg碘化物-由500mg碘化钾或450mg碘化钠提供)。
9一种通过乳房内装置进行每天一次，或每天二次治疗的即用组合物；它们包含0.76:1的碘化物与过氧化氢的比率(1,000mg过氧化氢和760mg碘化物-由1,000mg碘化钾或900mg碘化钠提供)。
10以上组合物(1-9)其中过氧化物以释放过氧化物的化合物(例如过碳酸盐或过氧化氢合物)存在。在所述实施方案中，过碳酸盐的适宜浓度可通过过碳酸盐的有效过氧化物含量(通常20％-30％)和过氧化物的所需浓度计算。例如，1000mg具有30％有效过氧化氢的过碳酸钠将在溶于环境中时释放300mg过氧化氢。类似地，使用333mg过碳酸盐将释放100mg过氧化氢。
11一种用于制造例如用作乳头浸液洗液的通用抗菌洗液的组合物，其包含在10-10,000mg过氧化氢和7.6-7,600mg碘化物下的刚混合的过氧化氢来源和碘化物。
12一种用于制造例如用作乳头浸液洗液的通用抗菌洗液的组合物，其包含刚混合的离子碘化物来源，其中每升存在19-7,600mg碘化物(由25-10,000mg碘化钾或22.5-9,000mg碘化钠提供)，并以0.38-1.52:1的碘化物与过氧化氢的比率制备。
13一种用于制造例如用作乳头浸液洗液的通用抗菌洗液的组合物，其包含刚混合的过氧化氢来源和碘化物，其中每升存在100mg过氧化氢以及每升存在76mg碘化物(由100mg碘化钾或90mg碘化钠提供)。
14一种用于制造例如用作乳头浸液洗液的通用抗菌洗液的组合物，其包含刚混合的过氧化氢来源和碘化物，其中每升存在200mg过氧化氢以及每升存在152mg碘化物-由200mg碘化钾或180mg碘化钠提供。
15一种用于伤口护理而制备的敷剂，其中将敷剂浸于以上实施例(12-14)中所述的抗菌洗液中。
16一种如上所述的组合物，其中过氧化氢来源额外地或者替代地由释放过氧化物的化合物(例如过碳酸盐)或通过酶方式，例如还原糖化合物提供，足以得到所需浓度的过氧化氢。并且，包括含有另一种适宜的氧化化合物例如高锰酸钾以开始反应的组合物。
碘化物的来源可额外地或替代地由文中其它地方所述的化合物表提供，包括，但不限于碘化钠、碘化钾、碘化锂、碘化铯、碘化氢、碘化铑、或其它释放碘化物的化合物，或碘化物的缓慢释放形式，例如降解的碘酸盐。
并且，在使用碘化物对例如存在甲状腺问题的患者造成问题的情况中，碘化物可被硫氰酸盐分子替代(以例如但不限于硫氰酸钠或钾的形式提供)，但是按照0.2-5:1或更优选地0.8-1.3:1的硫氰酸盐与过氧化氢的比率。
此制剂可通过使用连续的适宜的乳房内注射器，或双筒注射器施用(阻止碘化物和过氧化物过早反应)。
所有所述的组合物在医药适宜的载体中制备。所述载体包括，但不限于，水、pH适宜的盐水、包含碳酸氢盐缓冲液的pH适宜的盐水、凝胶、或水凝胶。
可将来自列表的糖皮质激素补充到组合物中以解决感染期间局部的发炎问题，糖皮质激素包括，但不限于强的松、强的松龙、皮质醇和氢化可的松。例如，将10-20mg强的松龙或强的松或30-60mg氢化可的松补充到抗微生物组合物中可用于阻止感染发炎，作为乳腺炎治疗的一部分。
组合物施用指示载体使用。例如，乳腺炎乳房内治疗可在盐水或水中，或在更复杂的溶液例如硬脂酸盐/油中制备。以硬脂酸盐/油为主的组合物适于在组合物中以包含释放过氧化氢的过碳酸钠，因为其阻止过氧化物释放直到组合物在乳腺中的乳液中稀释。
并且，以水凝胶为主的组合物可用于帮助在伤口护理/绷带环境中施用。此实例为具有pH调节的组成的以聚丙烯酸钠为主的水凝胶。并且，盐水或碳酸氢盐/盐水载体可在消毒环境中使用或用作鼻洗液以缓解鼻窦炎以及伴发的感染。
此外，使用包含温度敏感性水凝胶的敷剂可用于螯合组分以在体温下将敷剂施用于组织将允许当组分反应时释放抗微生物活性。
医药结果
结果1
在10ml无菌水中混合过氧化氢和碘化钾的刚制得的混合物(每种100mg，0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比)。使用微-肉汤稀释技术，利用96孔板系统，在包含试验细菌生物体的肉汤中双倍稀释组合物。取决于生物体的敏感度，在细菌培养物不再耐受抗微生物组合物作用的稀释度下达到截止点。将此表征为最低抑菌浓度(MIC)。MIC越低，生物体越敏感。
Figure BDA0000834003360000171
Figure BDA0000834003360000181
表1引起乳腺炎的生物体对抗微生物组合物的MIC，该抗微生物组合物包含100mg过氧化氢和100mg碘化钾，新鲜配制的10ml体积并相应稀释。铜绿假单胞菌PA-29显示了对杀菌剂的耐受性增强以及对氟喹诺酮类抗生素的抗性增强。铜绿假单胞菌‘R’菌株为囊性纤维化临床分离株，其显示对amakcin、妥布霉素、环丙沙星、和庆大霉素中的一种或多种的耐受性。金黄色葡萄球菌BH1CC在其它地方被描述成MRSA类生物体。
表1显示了多种引起乳腺炎的生物体对在过氧化酶不存在下过氧化氢与碘化物之间的反应所产生的抗微生物活性的敏感度。明显的是，测试的所有菌株，包括革兰氏阳性生物体对组合物敏感。明显的是，在肉汤中，不需要使用乳过氧化物酶。此外，明显的是，组合物对真菌也有效。
并且，肉汤在试验后的多个时间进行亚培养以测试细胞生存力。此通过将100微升处理培养物在10ml不含抗微生物剂的新鲜肉汤中亚培养进行。此区分细胞死亡与细胞停滞(其中可检测到活细胞)。处理后48小时、72小时或96小时，没有观察到生长(利用与在MIC试验中抑制它们的那些浓度相同数量级的浓度)。此说明所产生的抗微生物活性对于革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体具有杀菌作用，这是一个令人惊讶的发现。
结果2
本发明的抗微生物组合物(过氧化物和碘化物)和包含过氧化物和硫氰酸盐的另一种组合物对以生物膜模式生长的细菌细胞的活性通过改良的罗宾斯装置(MRD)建立。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、或三种的混合物的生物膜通过在连接改良的罗宾斯装置的1L玻璃瓶中培养500ml LB建立。MRD系统由12个采样口组成，将医药级聚氨酯试样(50mm2表面积)插入其中。使培养物在37℃下增殖并以0.1h-1的速率向MRD注入/灌注培养物，持续至少48小时(在头24小时后，再补充100ml LB)。然后，向MRD灌注对照物或试验溶液。在灌注中使用低值恒力，以使整个体积用大概90秒通过系统。所用的对照为生理盐水溶液。通过灌注MRD室同时使试样在原位测试多种不同溶液：包含0.3g l-1硫氰酸钾和/或碘化钾，和0.003％过氧化氢的‘1x’溶液；包含1.5g l-1硫氰酸钾和/或碘化钾，和0.015％过氧化氢的‘5x’溶液；以及包含6g l-1硫氰酸钾和/或碘化钾，和0.06％过氧化氢的‘20x’溶液。
大肠杆菌 1x 5x 20x
无灌注 10<sup>5-6</sup> 10<sup>5-6</sup> 10<sup>5-6</sup>
盐水 10<sup>5-6</sup> 10<sup>5-6</sup> 10<sup>5-6</sup>
盐水+SCN/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 10<sup>5-6</sup> 10<sup>5-6</sup> 10<sup>4-5</sup>
表2从灌注/非灌注大肠杆菌生物膜分离的总活菌数(菌落形成单位每试样)并针对硫氰酸盐为主的溶液测试。数值表示四个试样的范围。
从表2，清楚地得出，在灌注步骤不存在下，可将105-6菌落形成单位(CFU)从试样中移除。同样地，当系统灌注盐水溶液时，细菌生存力变化不明显。将硫氰酸盐和过氧化氢补充到1x或5x水平的液中不改变细胞生存力的结果。使用20x溶液开始影响细胞生存力，数量一般以对数减少。当利用铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌生物膜培养物重复时指出类似结果。
大肠杆菌 1x 5x 20x
无灌注 8.3(±0.8)×10<sup>5</sup> 2.2(±0.4)×10<sup>6</sup> 2.3(±0.8)×10<sup>6</sup>
盐水 8.2(±0.9)×10<sup>5</sup> 3.8(±0.2)×10<sup>6</sup> 1.9(±0.5)×10<sup>6</sup>
盐水+碘化物/H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 5(±1)×10<sup>4</sup> 3.3(±0.5)×10<sup>3</sup> NG
表3利用以碘化物为主的溶液从灌注/非灌注大肠杆菌生物膜中分离的总活菌数(菌落形成单位每试样)。数值表示四次重复和两次生物重复的平均值。NG-没有可回收的活细胞
对于三个所有生物体，使用碘化物替代过氧化物和硫氰酸盐得到的OSCN-对试验结果具有明显的影响(表3)。使用1x以碘化物为主的溶液，细胞生存力明显降低。一般来讲，在90秒灌注后，细胞生存力减少了100-1000倍(表3)。利用‘5x’水平的碘化物，观察到大肠杆菌从106CFU降到103CFU。应注意，四个样品中有三个根本没有回收到细胞。‘20x’溶液足以导致完全不存在活细胞回收(表3)。重复设置，但使用大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌DSM 15676和铜绿假单胞菌NCIMB 10421的混合培养物产生非常类似的模式(表4)。‘1x’溶液足以使细菌生存力减少100-倍。‘5x’和‘20x’溶液足以完全不能从试样表面回收活细胞。利用混合的培养物时，对表面的附着更大并在一定程度上，明显表明，在只灌注盐水溶液时会损失一些细胞。在短时间(90秒)内生物膜附着细胞生存力的下降指出当涉及体内模型时，碘化物/过氧化氢组合物在生物膜集中的感染中作为治疗非常有效。
Figure BDA0000834003360000201
表4从一起培养的大肠杆菌、铜绿假单胞菌、和金黄色葡萄球菌的灌注/非灌注混合生物膜中分离出的总活菌数(菌落形成单位每试样))并针对活化-碘化物溶液测试。数值表示四次重复和两次生物重复的平均值。NG-没有可回收的活细胞。
表3和4中所示的数据明显地表明即使非常低浓度的抗微生物组合物所产生的活性也能够杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性生物体的形成生物膜的细菌培养物以及甚至混合的培养聚生体。此结果与使用抗生素比较以得到相同结果。与浮游生物细胞相比(即，自由浮动)，多种抗生素浓度需要增加1,000-倍以杀死生物膜细胞。当碘化物/过氧化氢组合物用于产生抗微生物活性时，就不是这种情况。
我们公开了过氧化氢即使在低浓度(例如，0.003％溶液)下也能够通过在过氧化物酶不存在下与碘化物的反应产生对引起感染的生物体有效的抗微生物作用。接触时间的延长(例如，10分钟)允许1x溶液杀死细菌培养物，程度与更强浓度下相同。
现有技术教导了需要甚至更高浓度的抗微生物剂以有效地杀死生物膜细菌。在本发明中，过氧化氢的量有效，但是在使用正确量的碘化物下。本发明组合物将提供(a)更大的杀伤效力；(b)有效的生物膜根除以及(c)适于体内施用的组合物，例如治疗乳腺炎或其它感染(并在不引起感染部位刺激下进行)。
结果3
乳过氧化物酶被表明以大量浓度存在于牛乳中，高达30mg l-1。此水平取决于动物的健康情况，牛的繁殖等，因此不能取决于以用于各自动物治疗的适宜浓度存在。对自然存在的乳过氧化物酶的依赖不能允许最佳设计的治疗。为了说明文中所公开的所述方法和组合物不需要内源性乳过氧化物酶，MIC在肉汤、牛乳、巴士灭菌乳、和超高温处理(UHT)乳液中进行。乳过氧化物酶在高温下失活，利用在巴士灭菌处理中使用的那些。常见的巴士灭菌处理(72℃，15秒)大量地降低酶活性(约70％)，而80℃或更高温度(包括135℃下的UHT处理)下的处理将完全地破坏酶。乳液中存在乳过氧化物酶对于反应至关重要，在UHT乳液环境中使用低浓度的碘化物和过氧化物不会产生任何明显的抗维生素效果。
在这些环境中测试本发明组合物，大肠杆菌在UHT乳液中不会比在肉汤、原料乳、和巴氏杀菌奶更耐受此效果(参见表5)。这清楚地表明，本发明组合物不以任何方式依赖于内源性或天然乳过氧化物酶的存在。
并且，将乳过氧化物酶补充到UHT乳液浓缩物的肉汤中不会影响培养24小时后最低抑菌浓度确定值的结果(表5)。
Figure BDA0000834003360000221
表5大肠杆菌ATCC 25922对100mg过氧化氢和100mg碘化钾的适当稀释的制剂的MIC。数值表明在24小时内抑制生长所需的碘化钾和过氧化氢的最小值mg/L。LB-溶菌肉汤。巴氏杀菌奶-72℃,15秒。UHT奶-135℃,3秒。LP-乳过氧化物酶。
结果4
在减小对抗微生物的耐受性的尝试中，使用微肉汤稀释方法，重复传代，利用大肠杆菌ATCC 25922和多种抗生素，以及包含过氧化氢和碘化钾的本发明组合物。卡那霉素、多粘菌素B、和左氧氟沙星(所有临床上重要并相关的抗生素)的原液浓度用以说明对抗生素的常见耐受性的发展。利用96孔平板制得双倍稀释的抗维生素组合物。利用104cfu ml-1大肠杆菌ATCC 25922培养孔内容物并允许培养。仍导致过夜生长的具有最高浓度的抗微生物的孔作为第二天传代的接种物。因此，例如，‘卡那霉素-传代’的菌株在除了卡那霉素的试验期间不与任何抗微生物剂接触。
在抗生素存在下只在8次传代后，生物体完全地耐卡那霉素和多粘菌素B医药。10此传代后，生物体比传代前对左氧氟沙星效果的耐受性高出8倍。这些结果反映在其中细菌因重复暴露于抗生素而增加耐受性的环境中使用抗生素。但是，在相同试验期间，生物体在类似次数的传代后不耐受过氧化氢/碘化物组合物所产生的抗微生物活性的效果。这是因为作用的固定模式其中没有此反应所产生的抗微生物活性的单个目标，好像确实穿过多个细菌蛋白。细菌细胞需要多个同时突变以得到耐受性，但对于传统抗生素只需要一个突变。此严重地限制生物体抵消本发明作用的能力。宽范围作用的抗微生物被描述为不可能引起细菌耐受性，或用于发展对抗生素的交互抗性。抗微生物组合物也可能杀死多种耐抗生素的铜绿假单胞菌。发展的卡那霉素和多粘菌素B耐受性菌株，以及左氧氟沙星耐受性突变株不会更耐受所公开组合物的作用，表明交叉耐药性不会发生。对氟喹诺酮耐受并对苯扎氯铵杀虫剂耐受的先前由Mc Cay等(Microbiology,第156卷,No.130-38,2010)所述的菌株对本发明的抗微生物活性的作用敏感(表1)。同样，具有对在治疗CF患者中所用的关键抗生素耐受性增强的多种临床上的囊性纤维化分离的铜绿假单胞菌菌株不比铜绿假单胞菌野生型菌株更耐受抗微生物活性(表1)。此外，金黄色葡萄球菌BH1CC(MRSA)为一种从Beaumonthospital,Dublin,Ireland分离的抗生素耐性菌株(苯唑西林MIC>256mg/L)。该菌株不必另一种金黄色葡萄球菌菌株更耐受反应的作用(表1)。此再次表明文中所公开的方法和组合物对于MRSA分离物有效。
结果5
修改一种试验方法以确定所需组合物的最适宜浓度以在乳房内提供抗微生物作用，而不是一直在乳液中，在动物挤奶后。设计一个模拟的牛乳房，利用具有两个入口通道的修改的橡胶气体-收集袋(见图1)。将通过过氧化氢和碘化钾反应刚制得的多种制剂通过入口引入袋中。为了模拟乳房环境，然后以相同速率将乳液供入乳房中，奶牛每天应产奶12L。在不同时间点定期取奶样并通过使样品掺杂大肠杆菌确定乳液的抗微生物活性。然后，培养掺杂乳液样品并随后测试残留的活大肠杆菌细胞的存在。缺少活细胞表明存在抑制/杀死大肠杆菌的足够的抗微生物活性。相反地，活细胞的存在表明乳液不再含有足以抑制微生物生长的量的抗微生物活性。使用此方法，滴定每个预期实施方案，以使活性在治疗/输注后存在至少5-6个小时，但在治疗后不会超过10个小时(以当乳液在乳房环境外部时活性将不存在)。包含100mg碘化钾、和100mg过氧化氢的10ml体积达到所需特征(0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比)。在小于50mg的过氧化物浓度下(即，>1.52:1的碘化物与过氧化物的重量比)，在4-5小时内抗微生物活性不足以成为有效的治疗。在大于300mg的过氧化物浓度下(即，<0.38:1的碘化物与过氧化物的重量比)，抗微生物活性持续10小时以上，这是乳液后加工的一个潜在问题。动物细胞组织的损伤风险也随过氧化物浓度增加而增加。0.38-1.52:1的碘化物与过氧化氢的重量比适于在模拟的牛乳房中提供适宜节奏的反应。
利用此方法，预计多种反刍动物(牛、羊等)的过氧化物与碘化物的适宜比率。令人感兴趣的是，发现过氧化物与碘化物(每种200mg，0.76:1的碘化物：过氧化氢重量比)的未稀释的10ml组合物在比乳腺炎环境中更短的时间框中损失了所有明显的抗微生物活性(但是仍用于消毒目的，其中接触时间更短)，但是初始浓度升高。此发现证实过氧化氢与碘化物之间的反应的动力学为发展用于治疗目的的适宜组合物的前提。这与直觉相反，抗微生物化合物的更加浓缩的溶液没有更加稀释的形式有效并且与包含100mg每种物质的实施方案相比，更加浓缩的溶液在更短的时间内失去活性-在此情况中，这再次强调反应动力学与效力之间的联系。
未能考虑到动态体积，乳房环境的变化也是得到有效的乳腺炎治疗的一个问题。例如，将组合物(100mg碘化钾和50mg过氧化氢-1.52:1的碘化物与过氧化氢的重量比)加入恒定不变体积的1L乳液中。组合物在此情况中保持抗微生物活性>24小时，但是相同组合物在乳房模型中试验期间记录抗微生物活性<3小时。在适当的模拟乳房模型方法不存在，此结果将指出利用此特定比率，抗微生物组合物活性太长(即，大于10小时)并且在乳液从乳房中挤出后，预期活性加长。此证明如此申请所公开的模拟乳房模型提供一个有效方法，其允许适宜的治疗设计体内应用。
结果6
需要正确浓度的过氧化物和碘化物以确保乳腺炎的一个有效治疗并确保乳液的后加工不受影响。使用模型乳房系统允许我们发展正确浓度的组合物。如果使用捕正确的浓度，将观察不到相同结果。
例如，向泌乳奶牛注入包含碘化钾和过氧化氢(每种5ml溶液，分别包含50mg(转化为38mg碘化物)和150mg-0.25:1的碘化物与过氧化物的重量比)的组合物。将5ml实施方案注入泌乳奶牛中，每天两次，持续2天。监测动物的活性变化、产奶量等。注意动物的刺激、产奶量减少以及乳房敏感性，表明抗微生物活性的产生不充足(或太慢)并保留了未使用的过氧化物，其开始刺激或损伤动物组织。此试验在乳房中使用0.1-0.15％过氧化物的浓度，但是明显低于防腐剂中所需的被报道的过氧化物的浓度，仍会刺激动物。利用该实施方案治疗乳腺炎是不可接受的。使用此实施方案(或类似的实施方案，其中过氧化物长时间存在)在乳液后加工中也导致问题以及初期会刺激动物。这是因为过氧化物的存在可能抑制奶酪和酸奶加工阶段所使用的任何起子培养物。
为了说明使用另一种优选的实施方案(包含100mg碘化钾和100mg过氧化氢-0.76:1的碘化物与过氧化物的重量比)不会伤害动物，向5只泌乳奶牛注入此实施方案，每天两次，持续5天。在治疗后的一段时间内、以及治疗后的多个月内监测动物的活性变化、产奶量等。治疗后，乳房敏感性、硬度或温度没有不适或变化迹象；并且每只动物所产的乳液的质量(营养、化学或生物)或量没有变化。此说明：a)组合物和治疗在所述水平下对于动物无毒(甚至5天的长时间治疗后)；b)产生抗微生物活性的反应没有出现瓶颈，使过氧化物存在延长；以及c)早期所述的刺激原因可能是乳头管组织长时间暴露于过量过氧化物。这些特定结果也支持治疗的此实施方案适宜用作亚临床乳腺炎的治疗和/或作为预防性治疗，只要不存在对牛的任何副作用并且进行治疗的动物所产生的乳液可继续使用。
实施例7
为说明治疗方法不干扰后加工，利用Delvo试验测试来自健康动物的乳液，该健康动物输注了包含100mg碘化钾和100mg过氧化氢的组合物。这是测试抗微生物剂存在的“黄金标准”(对于一些抗微生物剂，对十亿分率敏感并对大部分化合物敏感)。从健康牛和患有临床乳腺炎的牛得到的乳液当在治疗期间测试时对抗微生物剂呈“阴性”结果，因此证实抗微生物组合物在有限的时间内(即，只在挤奶期间)具有活性。严格来讲，此说明实施方案不影响乳液的后加工-挤奶后存在的抗微生物活性不足以抑制Delvo测试生物体，则不存在与起子培养物的抑制相关的问题。
实施例8
识别多种患病动物，它们因金黄色葡萄球菌而含有慢性临床乳腺炎。这些动物在试验前对几个月的先前抗生素治疗没有反应并表明与慢性乳腺炎相关的常见循环SCC增加。这些动物中11个利用本发明的实施方案治疗，包含100mg碘化钾和100mg过氧化氢(0.76:1的重量比)。挤奶后，以每天两次的方式治疗动物，持续两天。在治疗开始后第21天确定体细胞计数。此符合欧洲药品管理局指南日期(确保指出的任何效果不仅仅是暂时的)。在第21天，根据乳品SCC计数、乳房敏感性、肿胀、温度或其它乳液质量指标，没有任何残留的临床感染证据，因此说明本发明的治疗有效性，即使在金黄色葡萄球菌慢性感染的牛中(参见SCC计数数据的图3)。此试验说明组合物能够治疗具有慢性性质的金黄色葡萄球菌感染。关键是，这也说明组合物对于动物是无害的，如利用过氧化氢的情况。这些动物因为被处死(低产乳量、对多种抗生素没反应、以及持续增长的SCC)但是返回到牧群并在利用本发明治疗后正常挤奶数月。因乳产量增加，没有丢弃乳液，以及兽医费用，和动物替换给奶农所节约的成本估计达>€10,000($13,000)。
从在此申请中利用乳液作为细菌生长培养基所报道的体内研究和体外研究中得到的新颖发现为过氧化氢/碘化物模型在含有相对高水平的硫氰酸盐的乳液中体内或体外作用的能力。基于当前技术，这不是使用过氧化物酶催化过氧化氢与碘化物之间的反应的情况。
Klebanoff等(J Exp Med 1967126(6):1063-78)描述了这个实施“硫氰酸根离子抑制IO-的作用，”IO-由过氧化氢与碘化物之间的过氧化酶催化的反应得到。该研究的作者认为这“明显似是而非”，假定硫氰酸根在制造OSCN-中的作用。该发现进一步教示了过氧化物与碘化物之间过氧化酶催化的反应以产生IO-的效力，此时乳房环境中的抗微生物剂被限制，硫氰酸根大量存在于牛乳中(WHO/FAO,2005)。Tenovuo等和综述(Oral Diseases{2002}8,23-29)中所述的文章说明虽然碘化物的氧化物比硫氰化物氧化产物更有效，但是“与碘化物连同LP-系统有关的主要问题是甚至相对小浓度的唾液硫氰酸盐消除LP/I-/H2O2系统的细菌作用，因为SCN-是优选的底物”。并且，报道指出，在酵母白色念珠菌的口生物膜研究中，硫氰酸根与碘化物之间的类似并强烈的干扰强烈并负面地影响IO-产生。作者指出“关于其它碘化合物的IO-影响酵母生长和存活的能力必须受到质疑，因为临床试验显示用于体内抗真菌目的的其它碘制剂的有限或微弱的有利作用”。“通过此研究体外说明的碘化物/过氧化酶系统的效率难以转移到动物或人类。除了抗氧化剂对宿主细胞的毒性以及例如从牛乳中分离的酶的免疫原性，碘化物的氧化在硫氰酸盐控制下，硫氰酸盐不仅存在于多种外分泌物中(例如在人唾液中)，但是也优选地用作乳过氧化酶的底物。的确，底物同时并入相同凝胶中，在0.25至4mM的硫氰酸盐的浓度增加下，使2mM碘化物的有利作用减小，0.25至4mM对应于唾液中硫氰酸盐的正常范围”(Ahariz and Courtois2010.Clinical,Cosmetic and Investigational Dentistry 2010:269–78)。这些作者总结出，阻止白色念珠菌生物膜生成的过氧化酶产生的IO-只是用于在体外情况下用于处理装置。
相对于上述内容，乳液中硫氰酸盐的浓度高，并且根据动物饮食大范围内变化。硫氰酸盐的IO-产生的严重抑制因此指出以碘化物与过氧化氢为主的治疗不利于乳腺炎的治疗。
结果9
模拟的乳房模型方法指出对抗微生物活性的评价比现有技术明显改进。以上结果6和8描述治疗利用100mg碘化钾和100mg过氧化氢(0.76:1的碘化物与过氧化氢的重量比)。使用极低浓度的组分对动物不刺激或其它负面影响，但在治疗期间或治疗后，SCC计数没有明显降低或感染没有明显改善。但是，利用传统最低抑菌浓度试验的体外试验表明，1L体积的溶液抗微生物活性持续约24小时。但是，模拟的乳房模型方法正确地预测了，在体外其抗微生物性不能持续足够的时间以充分地杀死病原体。体内数据验证了试验模型的预测并说明了其在绘图乳房环境的动力学中的重要性。明显的是，反应必须达到的浓度和比率范围以有效地用作乳腺炎治疗，结果8中的所述实施方案实现了用于治疗牛乳腺炎的有效浓度。
在检测这些结果时，明显的是，所述过氧化氢/碘化物组合物有效地杀死大量生物体(表1)。也表明了，利用此模型之间的结果存在显著差异，通过与基于产生OSCN-的那个比较，关于革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体的生物膜培养物的治疗(表2-4)。化合物的比率也显示了在体内水平下极其重要。过高的浓度引起组织损伤或延长的活性(影响乳液的后加工；Delvo试验失败)。过低浓度或比率导致活性不足，最小化杀死存在的病原体的治疗的效果。乳房环境的动力学，从极小体积开始并增加到～1-4升乳液也是一个重要因素。令人惊讶的是，未稀释的组合物比稀释的组合物损失活性更快。利用恒定的最终体积的传统体外模型教示过高估计过氧化氢/碘化物模型的有效性并且不能体外翻译成功-这是本发明中所引述的现有技术的一个特征。文中所公开的新颖的模拟的乳房模型方法的开发、设计和配置允许适当地评价本发明治疗并最终地允许乳腺炎的新颖疗法的开发。
这是第一次描述低浓度的过氧化氢与碘化物之间的反应，作为高度有效的细菌组合物用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的基础，与乳过氧化物酶(或任何其它过氧化物酶)活性无关。首次说明甚至低浓度的过氧化氢与碘化物的反应物提供一种消除细菌生物膜的有效方法，甚至在硫氰酸盐存在下。也第一次公开了过氧化氢和碘化物组合物成功地用于治疗牛乳腺炎，以及通过敷剂的方式用于潜在的开放伤口。
第一次描述了一种表征所涉及的乳房环境的试验方法以允许基于过氧化氢和碘化物开发乳腺炎疗法。我们呈示体内数据以验证新颖方法得到牛乳腺炎的安全治疗的新颖方法的有效性，一种能够治疗和治愈乳腺炎的方法，同时允许得到不影响后加工操作的乳液，例如奶酪或酸奶制造。
结果10
为了说明传统的以碘为主的抗微生物剂与文中所述的活化IO-形式之间的差异，在多种培养基中进行MIC，包括水、LB肉汤、和乳液，利用大肠杆菌ATCC 25922作为试验生物体。作为比较，常在医院环境中用作局部消毒剂的PVP-I或聚维酮碘被用作游离碘(I2)的来源。虽然PVP-I在水和盐水中抗微生物性强，但在LB和乳液中所存在的有机物存在下特别快速地分解(见表6)。此限制PVP-I对不存在有机物的该区域的功效。利用本发明的OI-制剂就不是这种情况。有机物不会不可逆地导致溶液无效。奇怪的是，在盐水环境中使用过氧化氢与PVP-I的组合不会产生抗微生物活性，或者因为PVP-I明显地对过氧化物抗微生物活性发挥负面效果(表6)。在肉汤环境中重复使PVP-I在影响过氧化物前分解，MIC与过氧化物在PVP-I不存在下的MIC相同。利用100mg H2O2和100mg KI的组合物，在每种试验环境(乳液、肉汤和水)中达到20-40mg L-1的MIC，表明有机物的存在不能抑制所需的抗微生物活性。
溶液环境 MIC(mg L<sup>-1</sup>)
PVP-I (盐水) 1-2
PVP-I (在LB中) >250
PVP-I (乳液) >250
PVP-I+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (盐水) >250
PVP-I+H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (肉汤) 20-40
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (肉汤) 20-40
表6在有机物不存在和存在下PVP-I的活性。

Claims (19)

1.一种医药组合物在制备用于治疗或预防反刍动物中乳腺炎的药物中的用途，其中所述医药组合物包含碘化物(I-)和过氧化氢的来源，以及药学有效载体或稀释剂，其中所述医药组合物不包含过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述过氧化氢的浓度为以重量/体积或重量/重量计小于1％，并且所述浓度指的是在治疗或预防反刍动物中乳腺炎的用途期间的浓度。
3.根据权利要求1所述的用途，其包含0.2:1至3:1的碘化物与过氧化氢的重量比。
4.根据权利要求1所述的用途，其包含0.38:1至1.52:1的碘化物与过氧化氢的重量比。
5.根据权利要求1所述的用途，其包含5-5,000mg碘化物，以0.2:1至3:1的碘化物与过氧化氢的重量比制得。
6.根据权利要求1所述的用途，其包含5-5,000mg碘化物，以0.38：1至1.52：1的碘化物与过氧化氢的优选重量比制得。
7.根据权利要求1所述的用途，其包含5-5,000mg碘化物，以0.76：1的碘化物与过氧化氢的更优选的重量比制得。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述碘化物的来源可为碘化钠或碘化钾、碘化锂、碘化铯、碘化氢、碘化铑、或其缓慢释放形式。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述过氧化氢的来源为
(i)过氧化氢、
(ii)过氧化钠、
(iii)过氧化锂
(iv)过氧化物盐，其包括过硼酸钠
(v)过氧化氢-尿素加合物
或
(vi)有机过氧化物，其包括过氧酸类、酰基卤化物和脂肪族过氧化物。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述过氧化氢的来源可为释放过氧化物的过碳酸盐。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述释放过氧化物的过碳酸盐是过碳酸钠或钾，或缓慢释放形式。
12.根据权利要求1所述的用途，其包含5-5,000mg碘化物，以0.2:1至1:1的碘化物与过碳酸钠的重量比制得。
13.根据权利要求1所述的用途，其进一步包含乳铁蛋白或糖皮质激素。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述糖皮质激素为泼尼松龙、泼尼松、或氢化可的松。
15.根据权利要求1所述的用途，其中所述过氧化物和碘化物组分的递送是同时的或顺序的。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述药学有效载体为水、盐水、乳液或凝胶。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述凝胶是水凝胶。
18.根据权利要求1所述的用途，其适于通过乳房内装置递送。
19.根据权利要求1所述的用途，其中过氧化氢和碘化物以浓缩形式提供在医用装置中，适于制造包含10-5,000mg/L过氧化氢和7-3,800mg/L碘化物的工作溶液。
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