CN109355336A - 一种牛皮胶原蛋白的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物胶原蛋白制备的技术领域,具体涉及一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:S1脱脂脱毛:将牛皮浸入水中,控制温度下,加入脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理,沥出,用清水洗净;S2免疫处理:将牛皮置于碳酸钠溶液中,维持pH为7.8‑8.5,温度为20‑25℃条件下,转动15‑20min后,取出沥干,加水高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;S3提取:向牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH,加入活化复合酶制剂,在自然温度下搅拌5‑7h后,固液分离,得提取液备用;S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;本发明方法提高了胶原蛋白的纯度和得率,并且缩短了提取时间。

Description

一种牛皮胶原蛋白的提取方法
技术领域
本发明涉及生物胶原蛋白制备的技术领域,具体涉及一种牛皮胶原蛋白的提取方法。
背景技术
胶原蛋白是动物细胞合成的一种天然生物高分子,广泛存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中,是结缔组织极其主要的结构蛋白,起着支持结构器官、保护机体的作用。胶原蛋白具有稳定的性质,一般的加工温度及短时间加热都难使其分解,因此难被人体吸收,食用利用率较低。
目前,常用的提取方式有酶降解法、酸提取法、碱提取法和重组DNA提取法。酸碱法因强酸强碱反应剧烈、设备腐蚀严重,已不适用于工业化应用。重组DNA提取效果佳但工序繁杂且成本高;相比之下,酶法效果好、环境友好。
如CN201610121685.4公开了一种复合酶法水解制备牛皮胶原蛋白的方法,利用复合酶水解制备牛皮胶原蛋白的工艺,以获取所需的蛋白质产品。经过牛皮浸泡清洗,蒸煮酶解,脱色脱苦,过滤,离子交换,浓缩,灭菌,喷雾干燥,过筛工序。该发明省去传统制作工艺复杂程序,降低能耗和成本,能直接使用牛皮制备胶原蛋白,获得的胶原蛋白质量好,分子量位于3050-3300Da之间,苦味显著降低。
又如CN201710089525.0公开了一种酶法提取牦牛皮胶原蛋白的方法,本发明涉及提取胶原蛋白领域,包括以下工序完成:脱毛→粉碎→脱脂→酶解→纯化。该发明以牦牛皮为原料,发明了一种酶法提取牦牛皮胶原蛋白的方法,旨在得到性能优良的胶原蛋白,提高牦牛皮的产品价值和经济效益;本发明经过脱毛、脱脂后利用酶制剂水解制备的胶原蛋白纯度高、色泽均匀、无异味,提取过程绿色环保、工艺简单,并能扩牦牛皮的利用范围,增加牦牛皮的利用价值。
但现有技术脱毛脱脂过程造成胶原蛋白损失较多,且提取前处理一般先脱毛后脱脂,增加了工艺,提取温度要求苛刻,这限制了酶法的发展,而大多数研究者均是致力于如何优化酶组合提取效果,但对于如何降低脱毛脱脂过程中胶原蛋白的损失率以及如何降低提取温度要求的研究较少。
发明内容
本发明为解决上述技术问题,本发明提供了一种牛皮胶原蛋白的提取方法。
具体按照以下技术方案实现:
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量(2-2.5)倍的水中,控制温度在35-40℃下,加入牛皮质量0.001-0.002的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2-3h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量(1.2-1.5)倍的碳酸钠溶液中,维持pH为7.8-8.5,温度为20-25℃条件下,转动15-20min后,取出沥干,加入牛皮重量(1-1.3)倍的水高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6-6.8,然后加入牛皮质量0.002-0.004倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以100-150r/min搅拌5-7h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液。
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3000-3500U、葡萄糖淀粉酶1800-2100U、枯草杆菌α-淀粉酶1100-1600U。
所述有机酸溶液的质量浓度为60-65%。
所述有机酸溶液中含有阿魏酸。
所述有机酸溶液中含有没食子酸。
所述有机酸溶液中还含有醋酸、酒石酸、咖啡酸、柠檬酸、琥铂酸中任一种。
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35-40%。
所述没食子酸用量占有机酸总用量的38-45%。
所述高速搅拌的转速为500-600转/min。
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶800-1000U、菠萝蛋白酶2000-2500U、木瓜蛋白酶1600-2800U。
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液。
所述高压脉冲电场处理中电场强度为10-14kV/cm,脉冲数为10-15。
所述每升矿质水中含有镁100-120mg、钾80-97mg、硒18-23mg、磷200-300mg、氮110-128mg、锰25-30mg。
本发明的有益效果在于:
利用本发明方法提取胶原蛋白,提高了胶原蛋白的纯度和得率,并且缩短了提取时间,简化了提取前处理工艺,将现有技术中脱毛、脱脂的步骤改为一步完成脱毛脱脂。
首先,本发明利用脂肪酶、葡萄糖淀粉酶、枯草杆菌α-淀粉酶处理牛皮,一步完成了牛皮脱毛脱脂,并且减少了牛皮中蛋白质水解,降低了胶原蛋白损失率。
其次,本发明利用碳酸钠处理牛皮,一方面有效脱除毛脂,另一方面,改善了牛皮中无机盐情况,再结合高速搅拌以及高压均质处理,有效地对牛皮进行了破壁处理,有助于胶原蛋白的溶出。
最后,本发明利用有机酸与凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶共同处理,充分溶出胶原蛋白,降低杂质蛋白,提高胶原蛋白纯度和提取率;并且利用高压脉冲电场技术,使得提取胶原蛋白所用的酶具有高活性,能够高效溶出胶原蛋白,并且降低提取温度的要求,实现在自然温度下提取。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明,但本发明并不局限于这些实施方式,任何在本实施例基本精神上的改进或代替,仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.5倍的水中,控制温度在40℃下,加入牛皮质量0.002的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理3h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.5倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.5,温度为25℃条件下,转动20min后,取出沥干,加入牛皮重量1.3倍的水,在600转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.8,然后加入牛皮质量0.004倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以150r/min搅拌5-7h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3500U、葡萄糖淀粉酶2100U、枯草杆菌α-淀粉酶1600U;
所述有机酸溶液的质量浓度为65%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、酒石酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的40%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的45%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶1000U、菠萝蛋白酶2500U、木瓜蛋白酶2800U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为14kV/cm,脉冲数为15;
所述每升矿质水中含有镁120mg、钾97mg、硒23mg、磷300mg、氮128mg、锰30mg。
实施例2
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2倍的水中,控制温度在35℃下,加入牛皮质量0.001的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.2倍的碳酸钠溶液中,维持pH为7.8,温度为20℃条件下,转动15min后,取出沥干,加入牛皮重量1倍的水,在500转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6,然后加入牛皮质量0.002倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以100r/min搅拌5h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3000U、葡萄糖淀粉酶1800U、枯草杆菌α-淀粉酶1100U;
所述有机酸溶液的质量浓度为60%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、柠檬酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的38%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶800U、菠萝蛋白酶2000U、木瓜蛋白酶1600U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为10kV/cm,脉冲数为10;
所述每升矿质水中含有镁100mg、钾80mg、硒18mg、磷200mg、氮110mg、锰25mg。
实施例3
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.2倍的水中,控制温度在37℃下,加入牛皮质量0.0012的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2.5h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.3倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.0,温度为25℃条件下,转动18min后,取出沥干,加入牛皮重量1.2倍的水,在550转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.5,然后加入牛皮质量0.003倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以120r/min搅拌6h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3200U、葡萄糖淀粉酶2000U、枯草杆菌α-淀粉酶1300U;
所述有机酸溶液的质量浓度为62%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、咖啡酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的38%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的40%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶900U、菠萝蛋白酶2200U、木瓜蛋白酶2000U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为13kV/cm,脉冲数为12;
所述每升矿质水中含有镁110mg、钾90mg、硒20mg、磷250mg、氮120mg、锰28mg。
实施例4
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.2倍的水中,控制温度在37℃下,加入牛皮质量0.0012的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2.5h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.3倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.0,温度为25℃条件下,转动18min后,取出沥干,加入牛皮重量1.2倍的水,在550转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.5,然后加入牛皮质量0.003倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以120r/min搅拌6h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3500U、葡萄糖淀粉酶2000U、枯草杆菌α-淀粉酶1600U;
所述有机酸溶液的质量浓度为65%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、醋酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的45%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶1000U、菠萝蛋白酶2500U、木瓜蛋白酶1600U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为12kV/cm,脉冲数为12;
所述每升矿质水中含有镁100mg、钾95mg、硒23mg、磷200mg、氮120mg、锰30mg。
对比例1
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.2倍的水中,控制温度在37℃下,加入牛皮质量0.0012的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2.5h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.3倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.0,温度为25℃条件下,转动18min后,取出沥干,加入牛皮重量1.2倍的水,在550转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.5,然后加入牛皮质量0.003倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以120r/min搅拌6h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3500U、葡萄糖淀粉酶2000U、枯草杆菌α-淀粉酶1600U;
所述有机酸溶液的质量浓度为65%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、醋酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的45%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:菠萝蛋白酶2500U、木瓜蛋白酶1600U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为12kV/cm,脉冲数为12;
所述每升矿质水中含有镁100mg、钾95mg、硒23mg、磷200mg、氮120mg、锰30mg。
对比例2
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.2倍的水中,控制温度在37℃下,加入牛皮质量0.0012的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2.5h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.3倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.0,温度为25℃条件下,转动18min后,取出沥干,加入牛皮重量1.2倍的水,在550转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.5,然后加入牛皮质量0.003倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以120r/min搅拌6h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3500U、葡萄糖淀粉酶2000U、枯草杆菌α-淀粉酶1600U;
所述有机酸溶液的质量浓度为65%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、醋酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的45%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶1000U、菠萝蛋白酶2500U、木瓜蛋白酶1600U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入矿质水中,配成酶液;
所述每升矿质水中含有镁100mg、钾95mg、硒23mg、磷200mg、氮120mg、锰30mg。
对比例3
一种牛皮胶原蛋白的提取方法,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量2.2倍的水中,控制温度在37℃下,加入牛皮质量0.0012的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2.5h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量1.3倍的碳酸钠溶液中,维持pH为8.0,温度为25℃条件下,转动18min后,取出沥干,加入牛皮重量1.2倍的水,在550转/min条件下高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6.5,然后加入牛皮质量0.003倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以120r/min搅拌6h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液;
所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3500U、葡萄糖淀粉酶2000U、枯草杆菌α-淀粉酶1600U;
所述有机酸溶液的质量浓度为65%;
所述有机酸溶液中含有阿魏酸、没食子酸、醋酸;
所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35%;
所述没食子酸用量占有机酸总用量的45%;
所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶1000U、菠萝蛋白酶2500U、木瓜蛋白酶1600U;
所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的超纯水中,配成酶液;
所述高压脉冲电场处理中电场强度为12kV/cm,脉冲数为12。
试验例1
对实施例1-4及对比例1-3中的胶原蛋白损失率进行测定,方法如下:
(1)羟脯氨酸标准曲线测定:准备配置浓度为0.5、1.0、1.5、2.0μg/mL的羟脯氨酸标准工作液,吸取4mL于具色管中,加入2mL氯胺T,摇匀后置于室温条件下20min,加入2mL显色剂,摇匀后置于60℃保温20min,迅速冷却,在558nm处测定吸光度值,绘制标准曲线;
(2)脱脂脱毛、免疫处理后牛皮羟脯氨酸含量的测定:取牛皮样品4g于锥形瓶中,在105℃硫酸溶液(3mol/L)中水解16h,过滤到250mL容量瓶并定容至刻度,稀释该溶液中羟脯氨酸浓度至1.0μg/mL,取4mL经氯胺T氧化,测定反应液558nm处的吸光度值;
(3)酶提取处理后牛皮羟脯氨酸含量的测定:取牛皮样品4g于锥形瓶中,在105℃硫酸溶液(3mol/L)中水解16h,过滤到250mL容量瓶并定容至刻度,稀释该溶液中羟脯氨酸浓度至1.0μg/mL,取4mL经氯胺T氧化,测定反应液558nm处的吸光度值;
样品中羟脯氨酸含量计算公式如下:W=(C×4×F×10-3)/M;W为羟脯氨酸含量(mg/g),C为标准曲线上相应的羟脯氨酸浓度(μg/mL),F为稀释倍数,M为称取样品质量(g)。
脱脂脱毛、免疫处理后牛皮胶原蛋白损失率计算公司如下:R1=(W0-W2)/W0×100%;
酶提取处理后牛皮胶原蛋白损失率计算公司如下:R2=(W0-W2)/W0×100%;
R为胶原蛋白损失率(%),W0为脱毛前羟脯氨酸含量(mg/g),W1为脱毛脱脂后羟脯氨酸含量(mg/g),W2为酶提取后羟脯氨酸含量(mg/g),结果如表1所示:
表1

Claims (10)

1.一种牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1脱脂脱毛:将牛皮浸入牛皮质量(2-2.5)倍的水中,控制温度在35-40℃下,加入牛皮质量0.001-0.002的脱毛脱脂复合酶制剂,恒温处理2-3h,沥出,用清水洗净;
S2免疫处理:将牛皮置于牛皮质量(1.2-1.5)倍的碳酸钠溶液中,维持pH为7.8-8.5,温度为20-25℃条件下,转动15-20min后,取出沥干,加入牛皮重量(1-1.3)倍的水高速搅拌制成糊状,用高压均质机处理后,制成牛皮浆;
S3提取:向免疫处理后的牛皮浆中加入有机酸溶液调节pH为6-6.8,然后加入牛皮质量0.002-0.004倍的活化复合酶制剂,在自然温度下以100-150r/min搅拌5-7h后,利用压滤机进行固液分离,得提取液备用;
S4纯化:将提取液经离心分离取上层液,得胶原蛋白溶液。
2.如权利要求1所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述每100g脱毛脱脂复合酶制剂脂中含有如下组分:脂肪酶3000-3500U、葡萄糖淀粉酶1800-2100U、枯草杆菌α-淀粉酶1100-1600U。
3.如权利要求1所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述有机酸溶液的质量浓度为60-65%。
4.如权利要求1或3所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述有机酸溶液中含有阿魏酸。
5.如权利要求1或3所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述有机酸溶液中含有没食子酸。
6.如权利要求1或3所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述有机酸溶液中含有醋酸、酒石酸、咖啡酸、柠檬酸、琥铂酸中任一种。
7.如权利要求4所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述阿魏酸用量占有机酸总用量的35-40%。
8.如权利要求5所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述没食子酸用量占有机酸总用量的38-45%。
9.如权利要求1所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述每100g活化复合酶制剂中含有如下组分:凝乳酶800-1000U、菠萝蛋白酶2000-2500U、木瓜蛋白酶1600-2800U。
10.如权利要求9所述牛皮胶原蛋白的提取方法,其特征在于,所述活化复合酶制剂是将凝乳酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶加入经高压脉冲电场处理的矿质水中,配成酶液。
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