CN109355285A - 一种未加抗凝剂的哺乳动物血液dna的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA提取方法，包括：1）不添加任何抗凝剂，通过兽用注射器抽取哺乳动物颈静脉血液，将兽用注射器连同血液与冰袋进行低温运输，低温24h后置于‑20℃冻存。2）冻存一年内，在4℃低温下充分解冻，待液体部分的血清与血凝块完全分离时，剪取约0.2g血凝块，用于后续DNA提取。3）剪取的血凝块加入500微升DPBS中，利用剪刀充分剪碎至黄枪头可以吹吸流畅为止。4）离心后留下的固体沉淀部分加入裂解液和蛋白酶K消化过夜，之后经过饱和酚、氯仿:异戊醇和酒精的萃取下完成DNA提取。本发明针对未加抗凝剂的凝固后哺乳动物血液，不使用红细胞裂解液的情况下，低成本提出质量好、浓度高的DNA，可用于后续基因扩增和高通量测序。

Description

一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA提取方法，属于分子生物技术领域。

背景技术

哺乳动物血液中包含三类血细胞，分别是红细胞、白细胞和血小板，DNA主要存在于血液中的有核白细胞中。通常情况下，提取哺乳动物血液时都需要加入抗凝剂，防止血液凝固，以保证有核白细胞可以被裂解以释放细胞核内的DNA。但是，在采样实践中，往往存在条件不允许或者加入抗凝剂后摇晃不充分等情况，最终只能获得凝固血块。针对哺乳动物血凝块，市面上的血液DNA提取试剂盒和常规处理血块后的DNA提取方法则不再奏效，这时给科研工作者和医务人员带来了研究和检测困难问题。

虽然，血液凝固了，但DNA并没有遭到破坏。血液离开血管几分钟后，血浆内的纤维蛋白原会转变为不溶性的血纤维；之后，血纤维交织成网会将大量的红细胞、白细胞和血小板网罗在内，尤其使得含有DNA的白细胞不易被裂解液触及而导致不能释放DNA。目前主要的解决措施有加入红细胞裂解液、白细胞裂解液进行多次消化或者匀浆后过柱提取等。然而，这些措施首先没有一个统一的操作标准，其次其提取后的DNA纯度和质量也欠佳。

发明内容

本发明目的在于公开了一种针对哺乳动物血液未加抗凝剂后的DNA提取方法，为科研工作者和医务人员提供了一种从哺乳动物血凝块中提取DNA的操作方法参考；并针对哺乳动物血凝块的采样、运输、保存和DNA提取等一整套流程作出了详细的阐述。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA的提取方法，包括哺乳动物采血后未加抗凝剂的运输与保存方法、未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理方法和处理后的血凝块的DNA提取方法；其特征在于运输与保存方法指的是：不添加任何抗凝剂，通过兽用注射器抽取哺乳动物颈静脉血液2毫升，将兽用注射器连同血液与冰袋进行低温运输，24h后置于-20℃冻存；所述的未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理：

（1）将-20℃下冻存的哺乳动物凝固血，放置于4℃低温下充分解冻；

（2）待液体部分的血清与血凝块完全分离时，剪取0.2g血凝块，备用；

（3）剪取的0.2g血凝块置于2毫升离心管，加入200-500微升DPBS后，利用剪刀充分剪碎至黄枪头可以吹吸流畅为止；所述的利用剪刀充分剪碎至黄枪头可以吹吸流畅为止，指的是：先加入200微升DPBS，利用剪刀简单剪碎，当逐渐剪碎时会产生较小颗粒和气泡，可适当继续添加DPBS继续剪碎，终体积范围为400-500微升；

（4）将管合口统一向内，12000rpm离心5min；

（5）离心后，用黄枪头贴近管合口一侧，将液体部分全部吸走，保留管内沉淀固体部分；该部分固体质量约为0.05-0.1g，可用于后续DNA提取；所述的离心管内沉淀固体部分，加入600微升裂解液，重悬沉淀固体，再加入30微升蛋白酶K和15微升SDS（20%），封口膜封口，55℃持续翻转，消化过夜。

本发明进一步公开了所述的提取方法在实现哺乳动物凝固的高浓度、高纯度DNA提取方面的应用，后续DNA提取实验检测结果显示，所提取的DNA的260/280比值在1.8-2.0的范围值内，且其琼脂糖电泳条带单一，用于目的片段扩增效果良好。

本发明更加详细的描述如下：

一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA提取方法，主要包括三部分内容：哺乳动物采血后未加抗凝剂的运输与保存方法、未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理方法和处理后的血凝块的DNA提取方法。

本发明哺乳动物采血后未加抗凝剂的运输与保存方法，即不添加任何抗凝剂，通过兽用注射器抽取哺乳动物颈静脉血液2毫升，将兽用注射器连同血液与冰袋进行低温运输，低温24h后置于-20℃冻存。冻存前，一般可见血清和血凝块的自然分离。-20℃冻存的凝固血在至少一年内，可保证DNA提取质量不会降低。

本发明未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理方法，包括以下步骤：

（1）将-20℃下冻存的哺乳动物凝固血，放置于4℃低温下充分解冻。

（2）待液体部分的血清与血凝块完全分离时，剪取约0.2g血凝块，备用。

（3）剪取的0.2g血凝块置于2毫升离心管，先加入200微升DPBS（Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline），利用剪刀简单剪碎，当逐渐剪碎时会产生较小颗粒和气泡，可适当继续添加DPBS（一般终体积不要超过500微升）继续至黄枪头可以吹吸流畅为止，即通过100微升移液器配黄枪头（吸头）可以对500微升剪碎后的凝固血及DPBS混合液可以来回吹吸轻松、不堵塞黄枪头为止。

（4）将管合口统一向内，12000rpm离心5min。

（5）离心后，用黄枪头贴近管合口一侧，将液体部分全部吸走，保留管内沉淀固体部分；该部分固体质量约为0.05-0.1g，可用于后续DNA提取。

本发明用于处理后的血凝块的DNA提取的各项试剂配制准备如下：

（1）裂解液：mL Tris-HCl (1 M; pH8.0)、1 mL EDTA (0.1 M; pH 8.0)、20 mL NaCl(0.5 M; pH 8.0)、74mL双蒸水。配制好后的液体，经高压灭菌15min备用。

（2）SDS（20%）：20g SDS溶于双蒸水中，68℃溶解后，双蒸水定容至100ml，0.2μm的滤膜过滤灭菌备用。

（3）氯仿:异戊醇（24:1）：指氯仿和异戊醇的体积比，每个样本提取需要准备900微升。

（4）NaAc（3M; PH 5.2）：12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50ml，加冰乙酸调PH至5.2。

（5）Tris-HCl(1 M; pH8.0)：121.1 g Tris溶于800 ml水中，将pH值调至8.0，再定容至1L，高压灭菌备用。

（6）EDTA (0.1 M; pH 8.0)：37.22g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂H₂O)溶于80mL水中，溶解后将pH调至8.0，定容至1 L，高压灭菌备用。

（7）NaCl(0.5 M; pH 8.0)：5.844g NaCl溶于双蒸水中，定容至200ml备用。

（8）剪过的黄枪头：在原本完整的黄枪头尖端剪去约0.5cm。

本发明处理后的血凝块的DNA提取方法，步骤如下：

（1）对于步骤3内的（5）中的2毫升离心管内沉淀固体部分，加入600微升裂解液，重悬沉淀固体，再加入30微升蛋白酶K和15微升SDS（20%），封口膜封口，55℃持续翻转，消化过夜。

（2）向消化过夜后的2毫升离心管内，加入600微升饱和酚，持续颠倒混匀15min，放置至分层。如上层有块状物，需继续颠倒混匀，直至上层无块状物为止。

（3）将2毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至一个洁净的1.5毫升离心管中，液体总体积约600微升，若体积不够需用双蒸发水补齐至600微升，注意不要搅动下层液体。

（4）向1.5毫升离心管内，加入300微升氯仿:异戊醇（24:1）和300微升饱和酚，管内共计1.2毫升液体，持续颠倒混匀15min。

（5）将1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至另一个洁净的1.5毫升离心管中，液体总体积约600微升，若体积不够需用双蒸水补齐至600微升。

（6）向上一步骤中新的1.5毫升离心管内，加入600微升氯仿:异戊醇（24:1），管内共计1.2毫升液体，持续颠倒混匀15min。

（7）将上一步骤中的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至另一个洁净的1.5毫升离心管中，加入60μl的NaAc（3M;PH 5.2），再加入1毫升预冷的冰无水乙醇（约2倍于刚收集的DNA溶液体积），颠倒混匀，可出现絮状DNA沉淀。

（8）将出现絮状DNA沉淀的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用1000微升移液器吸走上清液弃掉，保留底部沉淀，加入800微升70%乙醇，吹打悬浮DNA。

（9）将悬浮DNA的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心1min；之后，用移液器吸走乙醇，留下DNA沉淀。重复本部分步骤（8）和（9）一次。

（10）针对所获得的DNA沉淀，将其离心管盖打开，室温干燥5-10min。

（11）向干燥后的离心管中，先加入50微升的双蒸水溶解DNA，如浓度过高，可再加双蒸水稀释。

（12）获得的DNA溶液，可长期保存于-20℃。

通过以上步骤，本发明可针对未加抗凝剂的哺乳动物血液所形成的血凝块进行DNA提取，系统地从哺乳动物血凝块的采样、运输、保存以及提取DNA的血凝块前处理直至最终的DNA提取等方面提出了一整套方案流程，为哺乳动物凝固血液提取DNA提供可一种方法参考。

本发明公开了的未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA的提取方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）对于血样的收集条件要求较低，可以解决未加抗凝剂或与抗凝剂混匀不充分导致的凝血DNA提取困难问题。

（2）在本发明对血凝块DNA提取的前处理指导下，不需要单独购买并添加红细胞裂解液来处理血凝块；且本发明的前处理步骤便于生产实践的保存与运输条件控制，易于操作实现。

（3）在本发明针对血凝块样品优化了裂解液成分，结合30微升蛋白酶K和15微升SDS（20%）处理后，可较好的裂解血凝块样品。

本发明主要解决了未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA提取问题，重点考察了血凝块DNA提取的前处理和裂解液的配方，主要的难点在于血凝块DNA提取的前处理步骤。

附图说明

图1 是绵羊凝固血所提取DNA的Nanodrop检测峰图（本发明方法）；

图2 是绵羊凝固血所提取DNA的琼脂糖电泳图（本发明方法）；

图3 是以本发明方法提取的DNA为模板扩增绵羊RPL19内参基因的琼脂糖电泳图；

图4 是绵羊凝固血所提取DNA的Nanodrop检测峰图（常规方法）；

图5 是绵羊凝固血所提取DNA的琼脂糖电泳图（常规方法）；

图6 是以常规方法提取的DNA为模板扩增绵羊RPL19内参基因的琼脂糖电泳图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1

1.以绵羊为例，不添加任何抗凝剂，通过兽用注射器抽取绵羊颈静脉血液2毫升，将兽用注射器连同血液与冰袋进行低温运输，低温24h后置于-20℃冻存。冻存前，一般可见血清和血凝块的自然分离。-20℃冻存的凝固血在至少一年内，可保证DNA提取质量不会降低。

2. 未加抗凝剂的绵羊凝固血DNA提取前处理方法，包括以下步骤：

（1）将-20℃下冻存的绵羊凝固血，放置于4℃低温下充分解冻。

（2）待液体部分的血清与血凝块完全分离时，剪取约0.2g血凝块，备用。

（3）剪取的0.2g血凝块置于2毫升离心管，先加入200微升DPBS（Dulbecco'sPhosphate Buffered Saline），利用剪刀简单剪碎，当逐渐剪碎时会产生较小颗粒和气泡，可适当继续添加DPBS（一般终体积不要超过500微升）继续至黄枪头可以吹吸流畅为止，即通过100微升移液器配黄枪头（吸头）可以对500微升剪碎后的凝固血及DPBS混合液可以来回吹吸轻松、不堵塞黄枪头为止。

（4）将管合口统一向内，12000rpm离心5min。

（5）离心后，用黄枪头贴近管合口一侧，将液体部分全部吸走，保留管内沉淀固体部分；该部分固体质量约为0.05-0.1g，可用于后续DNA提取。

3. 用于处理后的血凝块的DNA提取的各项试剂配制准备如下：

（1）裂解液：mL Tris-HCl (1 M; pH8.0)、1 mL EDTA (0.1 M; pH 8.0)、20 mL NaCl(0.5 M; pH 8.0)、74mL双蒸水。配制好后的液体，经高压灭菌15min备用。

（2）SDS（20%）：20g SDS溶于双蒸水中，68℃溶解后，双蒸水定容至100ml，0.2μm的滤膜过滤灭菌备用。

（3）氯仿:异戊醇（24:1）：指氯仿和异戊醇的体积比，每个样本提取需要准备900微升。

（4）NaAc（3M; PH 5.2）：12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50ml，加冰乙酸调PH至5.2。

（5）Tris-HCl(1 M; pH8.0)：121.1 g Tris溶于800 ml水中，将pH值调至8.0，再定容至1L，高压灭菌备用。

（6）EDTA (0.1 M; pH 8.0)：37.22g 二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂H₂O)溶于80mL水中，溶解后将pH调至8.0，定容至1 L，高压灭菌备用。

（7）NaCl(0.5 M; pH 8.0)：5.844g NaCl溶于双蒸水中，定容至200ml备用。

（8）剪过的黄枪头：在原本完整的黄枪头尖端剪去约0.5cm。

4. 处理后的血凝块的DNA提取方法，步骤如下：

（1）对于步骤2内的（5）中的2毫升离心管内沉淀固体部分，加入600微升裂解液，重悬沉淀固体，再加入30微升蛋白酶K和15微升SDS（20%），封口膜封口，55℃持续翻转，消化过夜。

（2）向消化过夜后的2毫升离心管内，加入600微升饱和酚，持续颠倒混匀15min，放置至分层。如上层有块状物，需继续颠倒混匀，直至上层无块状物为止。

（3）将2毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至一个洁净的1.5毫升离心管中，液体总体积约600微升，若体积不够需用双蒸发水补齐至600微升，注意不要搅动下层液体。

（4）向1.5毫升离心管内，加入300微升氯仿:异戊醇（24:1）和300微升饱和酚，管内共计1.2毫升液体，持续颠倒混匀15min。

（5）将1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至另一个洁净的1.5毫升离心管中，液体总体积约600微升，若体积不够需用双蒸水补齐至600微升。

（6）向上一步骤中新的1.5毫升离心管内，加入600微升氯仿:异戊醇（24:1），管内共计1.2毫升液体，持续颠倒混匀15min。

（7）将上一步骤中的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用剪过的黄枪头吸取上层透明的DNA溶液至另一个洁净的1.5毫升离心管中，加入60μl的NaAc（3M;PH 5.2），再加入1毫升预冷的冰无水乙醇（约2倍于刚收集的DNA溶液体积），颠倒混匀，可出现絮状DNA沉淀。

（8）将出现絮状DNA沉淀的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心10min，用1000微升移液器吸走上清液弃掉，保留底部沉淀，加入800微升70%乙醇，吹打悬浮DNA。

（9）将悬浮DNA的1.5毫升离心管置于离心机中，12000rpm离心1min；之后，用移液器吸走乙醇，留下DNA沉淀。重复本部分步骤（8）和（9）一次。

（10）针对所获得的DNA沉淀，将其离心管盖打开，室温干燥5-10min。

（11）向干燥后的离心管中，先加入50微升的双蒸水溶解DNA，如浓度过高，可再加双蒸水稀释。

（12）吸取1微升DNA溶液用于Nanodrop仪器分析其吸光值和浓度检测，如图1是采用本发明方法提取绵羊凝固血的DNA光谱吸收图。

（13）吸取1微升DNA溶液用于琼脂糖电泳检测其完整性，如图2是采用本发明方法提取绵羊凝固血的DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

（14）以绵羊凝固血液提出DNA为模板，根据绵羊RPL19内参基因，设计引物（序列如下），采用95℃、5min，33×[95℃、30s，60℃、30s，72℃、30s]，72℃、8min，4℃保存的扩增程序，最终获得了较高的RPL19基因片段浓度，如图3所示。

RPL19基因引物F：AATCGCCAATGCCAACTC

RPL19基因引物R：CCCTTTCGCTTACCTATACC。

实施例2

对比试验：

常规的方法：

对于未添加抗凝剂的哺乳动物血液形成的血凝块，常规处理方法一般采取匀浆仪破碎法，即加入双蒸水清洗血凝块，通过均浆仪将血凝块破碎，离心后，弃上清加入裂解液和蛋白酶K，再利用试剂盒法或常规酚仿法提取DNA。若采取试剂盒法，在过柱时容易引发堵塞，不容易提出DNA；若采取常规酚仿法，则所提出的DNA浓度和纯度均较低（如图4、图5），不利于后续PCR扩增试验（如图6）。以绵羊凝固血为例，提取的DNA的Nanodrop检测峰图如图4所示，其260/280比值远远偏离1.8-2.0的范围值。所提取DNA的琼脂糖电泳图如图5所示，其电泳拖带非常严重。以绵羊凝固血所提取DNA为模板扩增的绵羊RPL19内参基因琼脂糖电泳图如图6所示，可能由于DNA提取浓度和纯度的影响，其引物二聚体形成较为严重，几乎没有目的条带。以上试验结果均不理想。

本发明的方法：

本发明方法采用DPBS来清洗血凝块，并利用剪刀剪至黄枪头可以吹吸顺畅为止，离心后，弃上清加入本发明中的裂解液、SDS和蛋白酶K，再通过酚仿法提取DNA，提取后的DNA浓度与纯度较高，更适于后续PCR的扩增试验等。以绵羊凝固血为例，提取的DNA的Nanodrop检测峰图如图1所示，其260/280比值均在1.8-2.0的范围值内。所提取DNA的琼脂糖电泳图如图2所示，其电泳条带较为单一。以绵羊凝固血所提取DNA为模板扩增的绵羊RPL19内参基因琼脂糖电泳图如图3所示，目的条带单一明亮。从以上结果可知，采用本发明的方法可以提出较高质量的DNA，并可用于后续试验研究。

结论：本发明系统的说明了哺乳动物凝固血的收集与保存方法，详细的介绍了凝固血DNA提取钱的处理方法与凝固血裂解液的配方，处理后的血凝块样品可在酚仿法的基础上实现高浓度、高纯度DNA的提取。

以上所示仅为本发明的优选实例，并不用以限制本发明，凡在本发明所述范围之内所作的任何修改、等同替换和改进等，应视为本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市畜牧兽医研究所

<120> 一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA的提取方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatcgccaat gccaactc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctttcgct tacctatacc 20

Claims (2)

1.一种未加抗凝剂的哺乳动物血液DNA的提取方法，包括哺乳动物采血后未加抗凝剂的运输与保存方法、未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理方法和处理后的血凝块的DNA提取方法；其特征在于运输与保存方法指的是：不添加任何抗凝剂，通过兽用注射器抽取哺乳动物颈静脉血液2毫升，将兽用注射器连同血液与冰袋进行低温运输，24h后置于-20℃冻存；所述的未加抗凝剂的哺乳动物凝固血DNA提取前处理：

（1）将-20℃下冻存的哺乳动物凝固血，放置于4℃低温下充分解冻；

（2）待液体部分的血清与血凝块完全分离时，剪取0.2g血凝块，备用；

（3）剪取的0.2g血凝块置于2毫升离心管，加入200-500微升DPBS后，利用剪刀充分剪碎至黄枪头可以吹吸流畅为止；所述的利用剪刀充分剪碎至黄枪头可以吹吸流畅为止，指的是：先加入200微升DPBS，利用剪刀简单剪碎，当逐渐剪碎时会产生较小颗粒和气泡，可适当继续添加DPBS继续剪碎，终体积范围为400-500微升；

（4）将管合口统一向内，12000rpm离心5min；

（5）离心后，用黄枪头贴近管合口一侧，将液体部分全部吸走，保留管内沉淀固体部分；该部分固体质量约为0.05-0.1g，可用于后续DNA提取；所述的离心管内沉淀固体部分，加入600微升裂解液，重悬沉淀固体，再加入30微升蛋白酶K和15微升SDS（20%），封口膜封口，55℃持续翻转，消化过夜。

2.权利要求1所述的提取方法是在实现哺乳动物凝固血的高浓度、高纯度DNA提取方面的应用。