CN109350607B - 包覆魔芋葡甘露聚糖的nadh纳米微球及其制备工艺与应用 - Google Patents

包覆魔芋葡甘露聚糖的nadh纳米微球及其制备工艺与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球，其包括NADH纳米球，NADH纳米球外部包覆有魔芋葡甘露聚糖纳米球，所述NADH纳米球的粒径为500‑1000nm，魔芋葡甘露聚糖纳米球的粒径为200‑1000nm。在性质不稳定的NADH外部包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)纳米颗粒，所述KGM纳米颗粒将NADH保护在内部，防止了NADH遇光或氧后不稳定、易分解。将NADH与KGM制备为包覆复合物后，NADH可在一定时间内缓释，避免了其进入胃部立刻被胃酸分解，该复合纳米微球可用于生产口服制剂、对抗癌症。还公开了包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的制备工艺和应用，制备工艺步骤简单、条件温和，制得的纳米微球可广泛应用于抗癌药物、保健药物、宠物药物的制备中。

Description

包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球及其制备工艺与应用
技术领域
本发明属于保健品生产技术领域，涉及一种含有NADH的保健品及其制备与应用，具体地说涉及一种包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球及其制备工艺与应用。
背景技术
从生物学上讲，衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，是一种复杂的自然现象，具体表现为结构的退行性变和机能的衰退，适应性和抵抗力减退。从病理学上将，衰老是应激和劳损、损伤和感染、免疫反应衰退、营养失调、代谢障碍以及疏忽和滥用药物积累的结果。随着年龄的增长、机体的衰老，很多健康问题随之产生，严重影响人们的生活质量。如血管功能障碍、运动能力、大脑认知功能衰退等，甚至发生帕金森等病症。
旨在提高健康和生活质量的保健品近年来已逐渐得到了普及，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的生物物质被认为是具有日益增加身体和智力表现作用的物质且无副作用，其是呼吸链中的能量递送基质，临床研究表明，肠外给予NADH对治疗帕金森病和重度抑郁症有积极作用。NADH可促进帕金森症、阿尔兹海默症患者的认知能力和运动能力，以及缓解疲劳、嗜睡、色素性疲劳综合征，增强了使用者活力和动力。NADH位于呼吸链的第一位，属于人体新陈代谢的最重要且能量最丰富的电子载体，随着营养素的氧化，它在生产细胞能量和细胞调节中起到不可替代的作用，并在细胞能量生产中的发挥核心作用。其对人体起到积极作用的原理在于可积极影响激活神经递质的合成，刺激酪氨酸羟化酶(TH)，而酪氨酸羟化酶(TH)是产生多巴胺的关键酶。另外，NADH作为抗氧化剂保护自由基免受损失，是人体内最强有力的抗氧化剂，在细胞毒性自由基和过氧化物的中和中发挥重要作用。
上个世纪中叶，NADH通过输液的方式已成功治疗帕金森症、阿尔兹海默症等各种神经系统疾病以及迟发性痴呆，但是NADH药液化学性质不稳定，需即用即配，所以虽然这种生物分子的重心活化和刺激特征50年前即得到了确定，但是由于其高度敏感(对光和氧非常敏感)和不稳定的特点，使其一直未得到广泛应用。而且由于NADH与胃酸接触后立即被分解导致无法口服。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于NADH化学性质不稳定、难以储存、无法口服，从而提出一种提高了稳定性、易于保存、可口服、可大规模生产、使用的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球及其制备工艺与应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
本发明提供一种包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球，其包括NADH纳米球，所述NADH纳米球外部包覆有魔芋葡甘露聚糖纳米球，所述NADH纳米球的粒径为500-1000nm，所述魔芋葡甘露聚糖纳米球的粒径为200-1000nm。
作为优选，所述魔芋葡甘露聚糖纳米球由魔芋葡甘露聚糖、季铵化魔芋葡甘聚糖、羧甲基魔芋葡甘聚糖、脱乙酰魔芋葡甘聚糖中的至少一种制得。
本发明还提供一种制备所述的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的工艺，其包括如下步骤：
S1、将1-20重量份NADH纳米微球分散于制剂辅料中，得到预混物，所述辅料包括20-80重量份魔芋葡甘露聚糖纳米球、1-10重量份聚乙烯吡咯烷酮，1-30份微晶纤维素、1-10份聚磷酸钙、1-30份黄原胶、1-30份海藻酸钠、1-20份氧化镁、1-10份硬脂酸镁；
S2、向所述预混物中加入1-15重量份润湿剂和1-15重量份粘合剂，搅拌均匀，得到包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的NADH纳米微球。
作为优选，所述魔芋葡甘露聚糖纳米球采用如下工艺制备：
a、将魔芋葡甘聚糖化学降解，得到分子量为8000-20000Da的改性魔芋葡甘露聚糖；
b、将所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠共同研磨得到200-1000nm的颗粒。
作为优选，所述化学降解具体为：将魔芋葡甘露聚糖与0.1-1mol/L的HCl或0.1-1mol/L的NaOH共同搅拌2-10h，即得到改性魔芋葡甘露聚糖。
作为优选，所述润湿剂为质量浓度70％的乙醇、水中的至少一种。
作为优选，所述粘合剂为质量浓度10wt％的预胶化淀粉、10wt％的淀粉浆、10wt％的羟丙甲纤维素中的至少一种。
作为优选，所述步骤S2后还包括将包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球通过湿法制粒工艺制粒的步骤。
作为优选，所述湿法制粒工艺后还包括将制得的颗粒压片制得片剂的步骤。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球，其包括NADH纳米球，所述NADH纳米球外部包覆有魔芋葡甘露聚糖纳米球，所述NADH纳米球的粒径为500-1000nm，所述魔芋葡甘露聚糖纳米球的粒径为200-1000nm。在性质不稳定的NADH外部包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)纳米颗粒，所述KGM纳米颗粒将NADH保护在内部，防止了NADH遇光或氧后不稳定、易分解。将NADH与KGM制备为包覆复合物后，所述NADH可在一定时间内缓释，避免了进入胃部立刻被胃酸分解，该复合纳米微球可用于生产口服制剂，NADH具有激活DNA修复酶帮助修复DNA的作用，其次，NADH还是一种强抗氧化剂，可帮助清除体内自由基，第三，NADH可激活以一氧化氮合酶，促进一氧化氮的合成。而KGM则具有粘度高、吸水性强、膨胀快等特性，可有效保护NADH。
(2)本发明所述的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的制备工艺，将NADH、KGM纳米微球与各种辅料混合制备，得到包覆有魔芋葡甘露聚糖纳米微球的复合材料。采用的辅料中，黄原胶具有良好的粘合作用，海藻酸钠具有浓缩溶液、形成凝胶的能力，其与KGM、黄原胶一起，可在NADH表面形成保护层，并可使NADH缓释出来。微晶纤维素、羟丙基纤维素使得制得的复合材料易于压片处理，更适宜于制备口服剂型，该制备工艺步骤简单、条件温和，生产效率高，适宜于工业化批量生产。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例3所述的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球压为片剂后在模拟胃酸溶液和模拟结肠溶液浸泡后有效成分的释放率趋势图；
图2是本发明实施例3的所述的包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球压为片剂后在模拟结肠溶液浸泡后有效成分的释放率趋势图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)的NADH纳米微球，其包括NADH纳米微球，所述NADH纳米微球外部包覆有KGM纳米微球，其中，所述NADH纳米微球的粒径为500nm，所述KGM纳米微球的粒径为200nm，还包括其它制剂辅料，本实施例中，所述KGM纳米微球由魔芋葡甘露聚糖制得。
本实施还提供一种制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的工艺，其包括如下步骤：
S1、将1重量份NADH纳米微球分散于制剂辅料中，得到预混物，其中所述辅料以重量份计，包括80份魔芋葡甘露聚糖纳米球、1份聚乙烯吡咯烷酮，30份微晶纤维素、1份聚磷酸钙、30份黄原胶、1份海藻酸钠、20份氧化镁、1份硬脂酸镁。
上述辅料中，黄原胶具有良好的粘合作用，海藻酸钠具有形成凝胶和成膜的能力，KGM纳米球与海藻酸钠和黄原胶共同形成一层保护膜，起到保护NADH和缓释NADH的作用。聚乙烯吡咯烷酮是一种合成水性高分子化合物，具有胶体保护作用，良好的成膜性、粘结性、吸湿性等，还具有优异的生理相容性。
S2、向所述预混物中加入1重量份润湿剂和15重量份粘合剂，搅拌均匀，得到包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的NADH纳米微球。其中，所述润湿剂采用浓度为70％的乙醇，所述粘合剂为10wt％的预胶化淀粉。所述预胶化淀粉具有良好的崩解、粘合作用，可改善混合物的硬度、崩解度和表面光亮度，还可提高溶出度，添加有预胶化淀粉的混合物易制粒，颗粒成粒性和可压性好。
所述的KGM纳米微球采用如下工艺制备：
a、将魔芋葡甘聚糖化学降解，将所述魔芋葡甘聚糖用0.1mol/L的HCl在常温下共同搅拌反应10h，得到粘均分子量为8000-20000Da的改性魔芋葡甘露聚糖。
b、将所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠共同研磨得到粒径为200nm的颗粒，所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠的质量比为1:1。
进一步地，制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球后，还包括将复合纳米微球用中号钢筛湿法制粒，即将称量好重量的物料置于筛孔尺寸由内而外递减的一套筛网上，物料按照颗粒大小分别留在各层筛面，然后将筛分而得的湿料烘干，烘干过程为在40℃下真空干燥3h。
所述颗粒可在8h内持续释放NADH。
进一步地，所述NADH纳米球采用如下工艺制备：
1、提取烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶。
2、固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶。
3、用固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
具体步骤如下：
将含烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的质粒pRSET bmj转化感受态细菌细胞E.coliHB101，在Luriabroth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37℃培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中并于30℃培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10℃，17800g，10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白经70℃热处理10分钟，离心(10℃，17800g，10分钟)并收集上清液，即为部分纯化的蛋白。
烟酰胺核苷腺苷酰转移酶固定化：取烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白或部分纯化的蛋白，用洗酶缓冲液(0.02MTris HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液)稀释至蛋白含量5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，加入环氧型固定化酶载体LX 3000(10毫克酶/克载体)，于摇床(转速100rpm)中25℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5 6次，得到固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶。
用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸：配制底物溶液：含5mM的烟酰胺核苷酸、10mM的三磷酸腺苷二钠(ATP)、100mMTris盐酸缓冲液和终浓度为10mM的MgCl2，调pH至7.5。取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，于37℃进行反应2-20小时。离心(10℃，17800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。结果表明，烟酰胺核苷酸转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的转化率超过80％。
实施例2
本实施例提供一种包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)的NADH纳米微球，其包括NADH纳米微球，所述NADH纳米微球外部包覆有KGM纳米微球，其中，所述NADH纳米微球的粒径为1000nm，所述KGM纳米微球的粒径为1000nm，还包括其它制剂辅料，本实施例中，所述KGM纳米微球为季铵化魔芋葡甘聚糖(QKGM)、羧甲基魔芋葡甘聚糖(CKMG)的混合物。
本实施还提供一种制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的工艺，其包括如下步骤：
S1、将20重量份NADH纳米微球分散于制剂辅料中(所述NADH纳米微球的制备工艺与实施例1相同)，得到预混物，其中所述辅料以重量份计，包括20份魔芋葡甘露聚糖纳米球、10份聚乙烯吡咯烷酮，1份微晶纤维素、10份聚磷酸钙、1份黄原胶、30份海藻酸钠、1份氧化镁、10份硬脂酸镁。
上述辅料中，黄原胶具有良好的粘合作用，海藻酸钠具有形成凝胶和成膜的能力，KGM纳米球与海藻酸钠和黄原胶共同形成一层保护膜，起到保护NADH和缓释NADH的作用。聚乙烯吡咯烷酮是一种合成水性高分子化合物，具有胶体保护作用，良好的成膜性、粘结性、吸湿性等，还具有优异的生理相容性。
S2、向所述预混物中加入15重量份润湿剂和1重量份粘合剂，搅拌均匀，得到包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的NADH纳米微球。其中，所述润湿剂采用浓度为70％的乙醇和水的混合物，所述乙醇与水的体积比为3:1。所述粘合剂为10wt％的淀粉浆与10％的羟丙甲纤维素的混合物，二者的体积比为1:1。所述羟丙甲纤维素具有改善崩解、提高溶出度的作用。
所述的KGM纳米微球采用如下工艺制备：
a、将魔芋葡甘聚糖化学降解，将季铵化魔芋葡甘聚糖(QKGM)、羧甲基魔芋葡甘聚糖(CKMG)用1mol/L的NaOH在常温下共同搅拌反应2h，得到粘均分子量为8000-20000Da的改性魔芋葡甘露聚糖。
b、将所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠共同研磨得到粒径为1000nm的颗粒，所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2。
进一步地，制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球后，还包括将复合纳米微球用中号钢筛湿法制粒，即将称量好重量的物料置于筛孔尺寸由内而外递减的一套筛网上，物料按照颗粒大小分别留在各层筛面，然后将筛分而得的湿料烘干，烘干过程为在40℃下真空干燥2h。
更进一步地，还包括将制粒得到的颗粒用压片机压为片剂，所述片剂易于口服，且可在8h内持续释放NADH。
实施例3
本实施例提供一种包覆魔芋葡甘露聚糖(KGM)的NADH纳米微球，其包括NADH纳米微球，所述NADH纳米微球外部包覆有KGM纳米微球，其中，所述NADH纳米微球的粒径为700nm，所述KGM纳米微球的粒径为500nm，还包括其它制剂辅料，本实施例中，所述KGM纳米微球为脱乙酰魔芋葡甘聚糖(da-KGM)。
本实施还提供一种制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球的工艺，其包括如下步骤：
S1、将10重量份NADH纳米微球分散于制剂辅料中(所述NADH纳米微球的制备工艺与实施例1相同)，得到预混物，其中所述辅料以重量份计，包括40份魔芋葡甘露聚糖纳米球、5份聚乙烯吡咯烷酮，15份微晶纤维素、5份聚磷酸钙、13份黄原胶、14份海藻酸钠、10份氧化镁、6份硬脂酸镁。
上述辅料中，黄原胶具有良好的粘合作用，海藻酸钠具有形成凝胶和成膜的能力，KGM纳米球与海藻酸钠和黄原胶共同形成一层保护膜，起到保护NADH和缓释NADH的作用。聚乙烯吡咯烷酮是一种合成水性高分子化合物，具有胶体保护作用，良好的成膜性、粘结性、吸湿性等，还具有优异的生理相容性。
S2、向所述预混物中加入10重量份润湿剂和7重量份粘合剂，搅拌均匀，得到包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的NADH纳米微球。其中，所述润湿剂采用浓度为70％的乙醇和水的混合物，所述乙醇与水的体积比为4:1。所述粘合剂为10wt％的羟丙甲纤维素。所述羟丙甲纤维素具有改善崩解、提高溶出度的作用。
所述的KGM纳米微球采用如下工艺制备：
a、将魔芋葡甘聚糖化学降解，将所述魔芋葡甘聚糖用0.5mol/L的HCl在常温下共同搅拌反应5h，得到粘均分子量为8000-20000Da的改性魔芋葡甘露聚糖。
b、将所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠共同研磨得到粒径为500nm的颗粒，所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠的质量比为1:2。
进一步地，制备包覆魔芋葡甘露聚糖的NADH纳米微球后，还包括将复合纳米微球用中号钢筛湿法制粒，即将称量好重量的物料置于筛孔尺寸由内而外递减的一套筛网上，物料按照颗粒大小分别留在各层筛面，然后将筛分而得的湿料烘干，烘干过程为在40℃下真空干燥2h。
更进一步地，还包括将制粒得到的颗粒用压片机压为片剂，所述片剂易于口服，且可在8h内持续释放NADH。
实验例
1、将实施例3制得的片剂在模拟胃酸溶液SGF pH＝2的条件下浸泡2h然后在模拟结肠溶液SCF pH＝6.8的条件下浸泡6h，分别测试第2、4、6、8h NADH的释放率，测试结果如表1和图1所示。
表1
时间h 释放率％
0 0
2 1.12
4 20.72
6 50.24
8 90.33
剩余量 0.30
总量 90.63
2、将实施例3制得的片剂在模拟结肠溶液SCF pH＝6.8的条件下浸泡8h，分别测试第2、4、6、8hNADH的释放率，测试结果如表2和图2所示。
表2
时间h 释放率％
0 0
2 39.57
4 66.85
6 85.5
8 93.27
剩余量 2.10
总量 95.37
上述测试结果表明，在模拟胃酸溶液和模拟结肠溶液浸泡下，制得的片剂中有效成分NADH可缓释至溶液中，是一种长效的剂型。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (2)

1.一种含包覆魔芋葡甘露聚糖的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纳米微球的片剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将1重量份烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纳米微球分散于制剂辅料中，得到预混物，其中所述制剂辅料以重量份计，包括80份魔芋葡甘露聚糖纳米球、1份聚乙烯吡咯烷酮， 30份微晶纤维素、1份聚磷酸钙、30份黄原胶、1份海藻酸钠、20份氧化镁、1 份硬脂酸镁；
S2：向所述预混物中加入1重量份润湿剂和15重量份粘合剂，搅拌均匀，得到包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纳米微球，其中，所述润湿剂为浓度70％的乙醇，所述粘合剂为10wt％的预胶化淀粉；
S3：将S2得到的包覆魔芋葡甘露聚糖纳米球的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纳米微球湿法制粒；
S4：将S3所得颗粒压片制成片剂；
其中所述魔芋葡甘露聚糖纳米球按照以下方法制备：
a、将魔芋葡甘聚糖化学降解：将所述魔芋葡甘聚糖用0.1mol/L的HCl在常温下共同搅拌反应10h，得到粘均分子量为8000-20000Da的改性魔芋葡甘露聚糖；
b、将所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠共同研磨得到粒径为200nm 的颗粒，所述改性魔芋葡甘露聚糖与海藻酸钠的质量比为1:1；
其中所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸纳米微球按照以下方法制备：
（1）将含烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的质粒pRSET bmj转化感受态细菌细胞E.coliHB101，在含100mg/L卡那霉素的Luriabroth平板上37℃培养24小时；接种单个克隆于5毫升含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中并于30℃培养20-24小时；离心收集菌体，并悬浮于1毫升100mM pH7.5的 Tris 盐酸缓冲液中；然后用超声波裂解细菌细胞；10℃，17800g，离心10分钟并收集上清液，得粗提蛋白；重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白经70℃热处理10分钟，10℃，17800g，离心10分钟 并收集上清液，得部分纯化的蛋白；
（2）取步骤（1）得到的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白或部分纯化的蛋白，用含0.02M Tris-HCl，0.001M EDTA，pH7.0的洗酶缓冲液稀释至蛋白含量5-10mg/ml；将稀释液与含2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5的PB溶液等体积混合，加入10毫克酶/克载体的环氧型固定化酶载体LX3000，于转速100rpm的摇床中25℃反应20小时；反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶；
（3）配制含5mM的烟酰胺核苷酸、10mM的三磷酸腺苷二钠、 100mMTris盐酸缓冲液和终浓度为10mM的MgCl2，pH7.5的底物溶液；取底物溶液1毫升，然后加入0.05克固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，于37℃进行反应2-20小时；10℃，17800g，离心15分钟并收集上清液即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3步骤中包含40℃下真空干燥2h的烘干过程。
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