CN109337979A - tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其为tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，包括提供了检测组织中tRNA表达水平在肺腺癌预后判断中的应用，它由以下步骤完成：步骤一：肺腺癌及正常肺组织tRNA定量；步骤二：tRNA与肺腺癌预后相关性；步骤三：tRNA相关预后评分模型建立；本发明，通过qPCR芯片对50对肺腺癌及其对应癌旁肺组织进行筛选，揭示了其对应组织的tRNA定量表达情况，本发明的目的在于筛选与肺腺癌患者预后相关的特定tRNA分子，并且提供一种诊治肺腺癌的tRNA预后模型，本发明的另一目的在于提供特定tRNA组合在制备肺腺癌预后预测试剂盒中的应用，本发明阐述了该预后模型在肺腺癌预后预测及相关试剂盒在肺腺癌诊治、预后中的应用。

Description

tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用。
背景技术
根据最新的流行病学调查数据显示，肺癌是发病率和肿瘤相关致死率最高的恶性肿瘤之一，而其中最常见的病理类型是肺腺癌，在临床工作中，TNM分期为最常用的肺癌分期方法，用于指导临床治疗和评估预后，但值得注意的是，在临床工作中，即使同期肺腺癌患者的术后生存率和无复发生存率也存在着明显差异，近年来，随着测序技术的快速发展，一些研究人员发现驱动基因和分子病理亚型的突变极大地影响了肺腺癌患者的预后，2015年WHO肺癌分类的重点描述了分子标志物在肺腺癌的诊断和治疗中的重要作用，然而，肺腺癌发生发展的分子机制仍不清楚，为了更准确地预测肺腺癌患者的生存，我们仍需要确定研究的新视角。
转运RNA(转移核糖核酸，tRNA)是一种携带和运输氨基酸的小分子核糖核酸，tRNA是由长度为70-90个碱基构成的核苷酸链，折叠成三叶草形状。近年来，研究证实，除氨基酸转运外，tRNA还可通过影响细胞增殖，分化，凋亡和代谢来参与细胞生物学功能的调节，近年来，tRNA与肿瘤的关系逐渐受到关注，并取得了一些标志性的进展，有研究表明，特异性tRNA可以驱动癌基因表达，某些特定tRNA(甲硫氨酸tRNA)表达水平的上调可导致肿瘤发生，此外，肿瘤细胞可通过调节tRNA的表达来调节肿瘤生长，在临床应用方面，tRNA被证实可以作为乳腺癌的生物标志物。
据本发明申报人所知，tRNA与肺腺癌患者预后之间的关系尚无研究人员报道，迄今为止，tRNA表达失调与肺腺癌之间的关系目前尚不清楚，申请者研究了tRNA在肺腺癌和相应的癌旁组织中的表达谱，筛选出与肺腺癌患者预后相关的tRNA分子，并且进一步扩大样本检测，表明tRNA-CysTT-1、mt-tRNA-Ser-GCT和tRNA-Tyr-ATA与肿瘤相关预后CSS相关，并构建了首个tRNA相关肺腺癌预后模型，tRNA相关研究目前是一个新兴领域，我们希望这种预后模型可用于指导临床肺腺癌的个体化治疗策略，并根据预后模型中相关的tRNA分子进一步开发用于肺腺癌诊治、预后检测相关试剂盒。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，具有用于指导临床肺腺癌的个体化治疗的特点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，包括提供了检测组织中tRNA表达水平在肺腺癌预后判断中的应用，它由以下步骤完成：
步骤一：肺腺癌及正常肺组织tRNA定量；
步骤二：tRNA与肺腺癌预后相关性；
步骤三：tRNA相关预后评分模型建立。
优选的，所述肺腺癌及正常肺组织tRNA定量的步骤包括：
步骤一：确定研究对象；所使用的50对肺腺癌组织及癌旁正常肺组织组织样本来自胸外科进行手术的患者，患者诊断以最终石蜡切片诊断为准，所纳入的样本均为肺腺癌，患者的基本信息及预后信息完备；
步骤二：组织RNA提取步骤同常规；
步骤三：RNA的去甲基化；步骤为：
四、选择质量合格的样品进行去甲基化处理；
五、配置试剂；
六、需要满足去甲基化条件：37℃恒温水浴100min；终止甲基化条件：加入160μLNuclease-free水以及40μL Stop buffer(5×)，充分混匀；
步骤四：RNA沉淀；使用常规RNA沉淀方法，最后使用11μL Nuclease-free水，于56℃水浴锅中放置10min，使RNA充分溶于水；
步骤五：RNA反转录成cDNA；步骤为：
六、配制退火混合物；
七、置于PCR仪，其反应条件为：65℃，5min，迅速置于冰上，冷却1min以上；
八、配成mix；
九、将第二与第三的溶液充分混匀，25℃孵育8min，然后50℃孵育50min；
十、85摄氏度孵育5min终止反应。
步骤六：tRNA定量检测；步骤为：
四、选择质量合格的样本进行PCR array的检测；
五、1:40稀释cDNA，充分混匀，
六、进行qPCR检测。
步骤七：数据处理；不同芯片之间所获得的数据需要进行第一步标准化处理，设定标化系数，qPCR数据处理过程如下：
ΔΔCt＝ΔCt(样本)-ΔCt(内参)
倍数差异＝2-ΔΔCt(肿瘤)/2-ΔΔCt(正常)
比较两组之间的差异选择用双侧t检验，当p值<0.05时，认为有统计学差异。
优选的，所述tRNA与肺腺癌预后相关性包含收集所有患者的临床病理特征以及患者的无复发生存期和总生存期，并且将tRNA在肿瘤与对应癌旁组织中的相对表达量与患者的预后进行分析，通过Kaplan-Meier方法绘制RFS和CSS的存活曲线，对于每个存活曲线，进行对数秩检验，使用Cox PH回归模型进行单变量和多变量分析，统计结果以95％置信区间(CI)表示，所有测试都是双尾的，显着性设定为p<0.05，R版本3.2.5软件。
优选的，所述tRNA相关预后评分模型建立包含单因素和多因素Cox PH回归显示基于tRNA的预后评分是肺腺癌患者CSS的独立预测因子，而性别、肿瘤分化和血管侵犯等临床病理因素也是独立的预测因素，为了确定tRNA为基础的预后评分在生存预测中的重要性，我们建立了两个多变量模型，一个模型包含预后评分和重要临床病理变量(组合模型)，另一个仅包含重要的临床病理变量(单一模型)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明，通过qPCR芯片对50对肺腺癌及其对应癌旁肺组织进行筛选，揭示了其对应组织的tRNA定量表达情况，本发明的目的在于筛选与肺腺癌患者预后相关的特定tRNA分子，并且提供一种诊治肺腺癌的tRNA预后模型，本发明的另一目的在于提供特定tRNA组合在制备肺腺癌预后预测试剂盒中的应用，本发明使用了104例肺腺癌患者的肿瘤及癌旁正常组织进行研究，收集了患者的预后信息，筛选出3个与肺腺癌患者总生存期相关的tRNA分子：tRNA-CysTT-1、mt-tRNA-Ser-GCT和tRNA-Tyr-ATA。
2、本发明对预后相关tRNA分子进行了单因素及多因素分析，本发明进一步构建了tRNA相关的肺腺癌预后模型，并且对该模型进行校验，本发明阐述了该预后模型在肺腺癌预后预测及相关试剂盒在肺腺癌诊治、预后中的应用。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为使用tRNA芯片定量检测肺50对腺癌以及其癌旁正常肺组织中tRNA表达水平的热图；
图2为基于tRNA的预后评分和104例肺腺癌患者的Kaplan-Meier生存率分析图，A：基于tRNA的预后评分，用于无复发生存的每位患者。B：无复发生存的Kaplan-Meier生存分析。C：针对癌症特异性存活的每位患者的基于tRNA的预后评分。D：癌症特异性存活的Kaplan-Meier生存分析；
图3为两种预后模型的时间依赖性ROC曲线图，A：组合模型的时间相关ROC曲线。B：单个模型的时间相关ROC曲线；
图4为使用基于tRNA的预后模型构建和验证诺模图，A：使用基于tRNA的预后模型构建列线图。B，C：1年和3年生存概率的预测和观察之间的校准曲线；
图5为针对肺腺癌患者肿瘤特异生存期进行的单因素及多因素Cox PH回归分析图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供以下技术方案：tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，包括提供了检测组织中tRNA表达水平在肺腺癌预后判断中的应用，它由以下步骤完成：
步骤一：肺腺癌及正常肺组织tRNA定量；
步骤二：tRNA与肺腺癌预后相关性；
步骤三：tRNA相关预后评分模型建立。
实施例1
所述肺腺癌及正常肺组织tRNA定量的步骤包括：
步骤一：确定研究对象；所使用的50对肺腺癌组织及癌旁正常肺组织组织样本来自胸外科进行手术的患者，患者诊断以最终石蜡切片诊断为准，所纳入的样本均为肺腺癌，患者的基本信息及预后信息完备；
步骤二：组织RNA提取步骤同常规；
步骤三：RNA的去甲基化；步骤为：
一、选择质量合格的样品进行去甲基化处理；
二、配置试剂；配制如下体系：
三、需要满足去甲基化条件：37℃恒温水浴100min；终止甲基化条件：加入160μLNuclease-free水以及40μL Stop buffer(5×)，充分混匀；
步骤四：RNA沉淀；使用常规RNA沉淀方法，最后使用11μL Nuclease-free水，于56℃水浴锅中放置10min，使RNA充分溶于水；
步骤五：RNA反转录成cDNA；步骤为：
一、配制退火混合物；配置体系如下：
二、置于PCR仪，其反应条件为：65℃，5min，迅速置于冰上，冷却1min以上；
三、配成mix；配制体系如下：
四、将第二与第三的溶液充分混匀，25℃孵育8min，然后50℃孵育50min；
五、85摄氏度孵育5min终止反应。
步骤六：tRNA定量检测；步骤为：
一、选择质量合格的样本进行PCR array的检测；
二、1:40稀释cDNA，充分混匀；配制反应体系如下：
三、进行qPCR检测；检测体系如下：
步骤七：数据处理；不同芯片之间所获得的数据需要进行第一步标准化处理，设定标化系数，qPCR数据处理过程如下：
ΔΔCt＝ΔCt(样本)-ΔCt(内参)
倍数差异＝2-ΔΔCt(肿瘤)/2-ΔΔCt(正常)
比较两组之间的差异选择用双侧t检验，当p值<0.05时，认为有统计学差异。
结果统计：分析肺腺癌及癌旁正常组织中tRNA相对定量检测结果利用R软件绘制成热图，可见两组织中tRNA表达库存在差异，并且tRNA表达库存在个体差异。
实施例2
所述tRNA与肺腺癌预后相关性包含收集所有患者的临床病理特征以及患者的无复发生存期和总生存期，并且将tRNA在肿瘤与对应癌旁组织中的相对表达量与患者的预后进行分析，通过Kaplan-Meier方法绘制RFS和CSS的存活曲线，对于每个存活曲线，进行对数秩检验，使用Cox PH回归模型进行单变量和多变量分析，统计结果以95％置信区间(CI)表示，所有测试都是双尾的，显着性设定为p<0.05。R版本3.2.5软件。
结果：为了构建更精确的预后模型，我们首先进行了预后相关的单因素COX PH回归，三个tRNA:tRNA-CysTT-1、mt-tRNA-Ser-GCT和tRNA-Tyr-ATA与肿瘤相关预后CSS相关联，因此，基于tRNA的预后评分具有显著的tRNA来预测CSS＝(0.126×tRNA-CysTT-1的表达值)+(0.056×mt-tRNA-Ser-GCT的表达值)+(0.171×tRNA-Tyr-ATA的表达值)。
对于每个患者，计算基于tRNA的预后评分，我们将中位预后评分定义为截断点，并将每个患者分为两组(高危组和低危组)，高危组患者的CSS明显较短(P＝0.007)，高危组患者的RFS较短(P＝0.053)，P值虽不显著，但接近统计学意义。
实施例3
所述tRNA相关预后评分模型建立包含单因素和多因素Cox PH回归显示基于tRNA的预后评分是肺腺癌患者CSS的独立预测因子，而性别、肿瘤分化和血管侵犯等临床病理因素也是独立的预测因素，为了确定tRNA为基础的预后评分在生存预测中的重要性，我们建立了两个多变量模型，一个模型包含预后评分和重要临床病理变量(组合模型)，另一个仅包含重要的临床病理变量(单一模型)，我们进行了ROC分析和计算AUC在这两个模型(图3A和3B)，结果表明，包含基于tRNA的预后评分的联合模型比单一模型(联合模型的AUC：0.829，单一模型的AUC：0.809)具有更好的预测效果，还计算了两个模型的AIC。结果显示，联合模型的AIC(80.87)显著小于单一模型(83.67)，表明基于tRNA的预后评分是一个显著和重要的预后因素。
最后，基于包含基于tRNA的预后评分和重要临床病理变量的多变量模型构建诺模图，临床病理变量包括性别、肿瘤分化和血管侵犯，HARELL预测CSS的C指数为0.814，95％可信区间(0.651，0.978)，校准曲线表明，在1年和3年生存率的预测和观察之间有很好的一致性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，包括提供了检测组织中tRNA表达水平在肺腺癌预后判断中的应用，其特征在于：它由以下步骤完成：
步骤一：肺腺癌及正常肺组织tRNA定量；
步骤二：tRNA与肺腺癌预后相关性；
步骤三：tRNA相关预后评分模型建立。
2.根据权利要求1所述的tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，其特征在于：所述肺腺癌及正常肺组织tRNA定量的步骤包括：
步骤一：确定研究对象；所使用的50对肺腺癌组织及癌旁正常肺组织组织样本来自胸外科进行手术的患者，患者诊断以最终石蜡切片诊断为准，所纳入的样本均为肺腺癌，患者的基本信息及预后信息完备；
步骤二：组织RNA提取步骤同常规；
步骤三：RNA的去甲基化；步骤为：
一、选择质量合格的样品进行去甲基化处理；
二、配置试剂；
三、需要满足去甲基化条件：37℃恒温水浴100min；终止甲基化条件：加入160μLNuclease-free水以及40μL Stop buffer(5×)，充分混匀；
步骤四：RNA沉淀；使用常规RNA沉淀方法，最后使用11μL Nuclease-free水，于56℃水浴锅中放置10min，使RNA充分溶于水；
步骤五：RNA反转录成cDNA；步骤为：
一、配制退火混合物；
二、置于PCR仪，其反应条件为：65℃，5min，迅速置于冰上，冷却1min以上；
三、配成mix；
四、将第二与第三的溶液充分混匀，25℃孵育8min，然后50℃孵育50min；
五、85摄氏度孵育5min终止反应。
步骤六：tRNA定量检测；步骤为：
一、选择质量合格的样本进行PCR array的检测；
二、1:40稀释cDNA，充分混匀，
三、进行qPCR检测。
步骤七：数据处理；不同芯片之间所获得的数据需要进行第一步标准化处理，设定标化系数，qPCR数据处理过程如下：
ΔΔCt＝ΔCt(样本)-ΔCt(内参)
倍数差异＝2-ΔΔCt(肿瘤)/2-ΔΔCt(正常)
比较两组之间的差异选择用双侧t检验，当p值<0.05时，认为有统计学差异。
3.根据权利要求1所述的tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，其特征在于：所述tRNA与肺腺癌预后相关性包含收集所有患者的临床病理特征以及患者的无复发生存期和总生存期，并且将tRNA在肿瘤与对应癌旁组织中的相对表达量与患者的预后进行分析，通过Kaplan-Meier方法绘制RFS和CSS的存活曲线，对于每个存活曲线，进行对数秩检验，使用Cox PH回归模型进行单变量和多变量分析，统计结果以95％置信区间(CI)表示，所有测试都是双尾的，显着性设定为p<0.05。R版本3.2.5软件。
4.根据权利要求1所述的tRNA相关肺腺癌预后模型及其应用，其特征在于：所述tRNA相关预后评分模型建立包含单因素和多因素Cox PH回归显示基于tRNA的预后评分是肺腺癌患者CSS的独立预测因子。而性别、肿瘤分化和血管侵犯等临床病理因素也是独立的预测因素，为了确定tRNA为基础的预后评分在生存预测中的重要性，我们建立了两个多变量模型，一个模型包含预后评分和重要临床病理变量(组合模型)，另一个仅包含重要的临床病理变量(单一模型)。
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