CN109321679A - 检测乙肝病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开用于检测乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)和/或共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途。其中寡核苷酸组合物包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸；第一寡核苷酸特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列，第二寡核苷酸特异性结合至第二序列的至少一部分连续序列，且两个连续序列之间的距离为30‑350nt，第一序列为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的HBV直接重复(direct repeat,DR)序列的DR2‑DR1之间的序列，第二序列为DR1的第五个碱基之后的序列。本发明可以有效检测HBV rcDNA和/或cccDNA的水平，而不受整合HBV DNA的影响。

Description

检测乙肝病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒 和方法及用途
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒的检测，具体地涉及用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界性流行，不同地区HBV感染的流行强度差异很大。根据病毒基因组序列相似度，HBV至少分为10个基因型(A-J)。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者。我国属于中高流行区，HBV感染以B型和C型为主。在2006年全国乙型肝炎血清流行病学调查中，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率为7.18％。据此推算，我国慢性HBV感染者约为9300万人，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者约2000万例。HBV持续感染引起慢性乙型肝炎(CHB)，也是肝硬化和肝细胞癌(HCC)发生发展的重要因素。在我国，一半以上的肝硬化和HCC患者由HBV引起。
HBV属嗜肝DNA病毒科，是已知最小的DNA病毒之一，基因组为全长约3.2kb(3182-3248，不同基因型病毒基因组序列长度有所不同)的不完全闭合环形DNA(rcDNA)，双链长度不对称，单链部分占全长的15-50％。HBV子代病毒复制存在以前基因组 RNA(pgRNA)为模板逆转录合成子代病毒DNA的过程，该过程发生在P蛋白与pgRNA 结合并招募核心抗原形成的核衣壳内。跳转后的逆转录起始于pgRNA的3’末端的DR1 区并沿pgRNA向其5’端逐步延伸，同时模板pgRNA在P蛋白的RNase H作用下被分段降解。HBV负链合成完成后正链合成开始，正链DNA以新合成负链DNA为模板，其引物为5’端残余的pgRNA，该引物跳转至负链DR2区并向负链5’端延伸至末尾，然后再次发生跳转，至负链3’末端继续延伸合成正链。由于很快获得包膜并释放出细胞，子代病毒的正链不完整，长度为负链全长的15-50％。子代病毒所含的病毒核酸为不完全闭合环形的松弛型rcDNA，病毒感染后rcDNA进入细胞核经加工后形成cccDNA，HBV cccDNA是病毒各种转录本转录的模板，由于其以微小染色体形式存在于细胞核中，是 HBV持续存在难以清除以及发生再感染的遗传学因素。HBV结构的示意图见图1。
血清中HBV DNA水平能反映HBV的复制水平，可作为一个抗病毒疗效的监测指标，且有较好的预后监测价值(Martinot-Peignoux M,Marcellin P.Virological andserological tools to optimize the management of patients with chronichepatitis B[J].Liver International, 2016,36Suppl 1(Supplement S1):78-84.)。在《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》中提到，HBV DNA定量检测主要用于判断慢性HBV感染的病毒复制水平，可用于抗病毒治疗适应症的选择及疗效的判断，并建议采用灵敏度和精确度高的实时荧光定量聚合酶链式反应。在抗病毒治疗过程中，通过对血清HBV DNA进行定量检测，在检测病毒抑制效果、监测抗病毒治疗疗效上有着重要作用。特别是核苷(酸)类药物，由于其主要通过抑制病毒的逆转录和DNA合成发挥抗病毒作用，对血清HBV DNA进行定量检测可有效反映药物的抗病毒作用和监测耐药发生。目前临床上现有乙肝病毒载量检测试剂盒主要通过对病毒X、S、PreC/C区进行绝对定量，从而得出血清中DNA含量。由于针对X、 S、PreC/C区的引物可以只以HBV单负链DNA为模板进行扩增，并不能直接反映新合成的子代病毒的rcDNA水平。由此可见，目前尚缺乏HBV rcDNA特异的定量检测方法。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种新的检测体系，其可以有效检测HBV rcDNA和/或cccDNA的水平，而不受整合HBV DNA的影响。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与所述第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与所述第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸能够特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列，所述第二寡核苷酸能够特异性结合至第二序列的至少一部分连续序列，且两个连续序列之间的距离为30-350nt，所述第一序列为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的直接重复序列的DR2-DR1之间的序列，所述第二序列为DR1的第五个碱基之后的序列。
优选地，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的长度分别为10-50nt。
优选地，所述第一序列包括HBV各基因型第1590-1828之间的序列。
优选地，所述第一寡核苷酸特异性结合至第一序列的保守区，所述第二寡核苷酸特异性结合至第二序列的保守区。更优选地，所述第一序列的保守区包括B基因型或C基因型第1655-1685之间的序列或第1775-1800之间的序列，所述第二序列的保守区包括B 基因型或C基因型第1825-1855之间的序列或第1860-1890之间的序列。
优选地，所述第一寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO:1-15所示的序列组成的组中的至少一种；所述第二寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO:16-20所示的序列组成的组中的至少一种；更优选地，所述第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:5和/或6所示，且所述第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:16和/或17所示；或者所述第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:13和/或14所示，且所述第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:18-20中的至少一种所示。
优选地，本发明的组合物进一步包括第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能够特异性结合至所述第一序列的至少一部分连续序列与所述第二序列的至少一部分连续序列之间，且所述第三寡核苷酸包含荧光基团。更优选地，所述第三寡核苷酸具有如SEQ ID NO:21- 24任一项所示的结构。
本发明的第二方面，提供一种试剂盒，其包含第一方面所述的寡核苷酸组合物。
本发明的第三方面，提供一种检测样品中乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA水平的方法，其包括使用第一方面所述寡核苷酸组合物或第二方面所述试剂盒的步骤。优选地，所述样品为肝组织和/或血液；所述检测方法包括SYBR Green实时荧光定量PCR方法、Taqman探针定量PCR方法、MGB实时荧光定量PCR方法和微滴数字PCR。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的寡核苷酸组合物作为核酸扩增引物或探针的用途；优选第一方面所述的寡核苷酸组合物在制备用于检测剂或诊断剂中的用途。
附图说明
图1HBV的基因组结构示意图。
图2本发明的rcDNA检测体系与现有X、S、PreC/C区检测体系的比较。1为本发明HBVrcDNA和/或cccDNA检测体系的rcDNA primer；2为常规HBV DNA检测体系的PreC/C primer,3为常规HBV DNA检测体系的S primer，4为常规HBV DNA检测体系的X primer。
图3 1.2xHBV质粒模拟cccDNA显示rcDNA检测寡核苷酸组合与cccDNA检测趋势相同。
图4表1所示第一寡核苷酸特异性结合的区域的位置示意图。
图5不同基因型HBV rcDNA检测的上下游引物和探针序列的示例性结合区域示意图。其中上图为1660-1850nt区域引物和探针设计；下图为1750-1890nt区域引物和探针设计。
图6本发明示例性寡核苷酸组合物的检测结果。其中1-15对应于本发明的序列SEQID NO:1-15，以这些第一寡核苷酸作为正向引物。上图使用的反向引物是SEQ ID NO:17，下图使用的反向引物是SEQ ID NO:20。
图7本发明另一示例性寡核苷酸组合物的特异性检测。A，不同rcDNA引物扩增rcDNA的PCR产物琼脂糖凝电泳结果；B和C，不同rcDNA引物组合扩增产物溶解曲线图。
图8HBV rcDNA不同引物组合扩增曲线图。
图9实时荧光定量PCR法在HBV rcDNA标准品体系中的检测及标准曲线的建立。 A，不同终浓度HBV DNA质粒经过检测后的Ct值；B，利用浓度和Ct值构建的标准曲线；C，荧光定量PCR最终得到的扩增曲线。
图10HBV rcDNA HRD-Probe探针检测体系在HBV B C基因型中的灵敏度检测。A 和B，HBV B基因型质粒中的扩增曲线和扩增效率；C和D，HBV C基因型质粒中的扩增曲线和扩增效率。
图11利用本实时荧光定量PCR方法对核苷(酸)类药物治疗后患者血清样本的重复性检测。
图12HBV rcDNA和/或cccDNA检测体系概要图，其中NAs:核苷(酸)类似物；“-”：HBV负链DNA；“+”：HBV正链DNA；DR：直接重复序列；rcDNA：松弛环状DNA；cccDNA：共价闭合环状DNA；pgRNA：前基因组RNA；dslDNA：双链线性 DNA。1为本发明HBV rcDNA和/或cccDNA检测体系的rcDNA primer；2为常规HBV DNA检测体系的PreC/C primer,3为常规HBV DNA检测体系的S primer，4为常规HBV DNA检测体系的X primer。
图13A NAs类药物LdT治疗12周后血清HBV DNA rcDNA、PreC/C和S区定量差异；图13B干扰素治疗48周后血清HBV DNA rcDNA、PreC/C和S区定量差异。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明的术语“特异性结合”包括以下含义：(1)在一个模板中与寡核苷酸杂交的目标DNA区域仅为一个，且寡核苷酸中的每个碱基均与目标DNA的对应碱基配对。即，寡核苷酸与目标DNA完全匹配；(2)在适于PCR反应的条件下，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸与同一模板杂交后，仅能得到一个长度为50-350bp之间的可检测片段。因此，本发明的“特异性结合”也称作“特异性杂交”。
本发明的术语“保守区”指多种不同核苷酸序列之间明显相似甚至完全相同的核苷酸序列的片段，其与所选定的不同核苷酸序列的范围或不同核苷酸序列组成的组相关的一个相对概念。本发明中与第一寡核苷酸结合的保守区称作第一保守区，或第一序列的保守区。本发明中与第二寡核苷酸结合的保守区称作第二保守区，或第二序列的保守区。
HBV DNA在宿主基因组中发生整合是HBV感染的常规事件。本发明人研究表明 HBVDNA整合片段的断端主要分布在DR1和DR2区，以双链线性DNA形式进行整合 (图2A)。对于肝组织中HBV病毒水平的检测，本实验室通过构建HBV 1.0×HBV质粒模拟整合(图2B)，利用1.2×HBV质粒模拟cccDNA以及含有cccDNA的慢性乙型肝炎患者肝组织DNA为样本，使用cccDNA检测体系、本发明中rcDNA检测体系、现有X、 S、PreC/C区检测体系分别对上述三种样本进行检测。结果显示，与现有X、S、PreC/C 区检测体系不同，本发明中rcDNA检测体系不能检测到整合，同时，与cccDNA检测体系相比，可以检测cccDNA(图2C)。因此，使用HBVrcDNA特异性检测可以排除肝组织中可能存在的HBV整合片段，从而排除了不具有HBV复制潜能的整合HBV DNA片段的干扰，而使用X、S、PreC/C区引物进行检测则无法排除这种干扰。HBV rcDNA具有作为子代病毒遗传物质的特征，血清中或肝组织中检测到HBV rcDNA表示有复制和再感染潜能的HBV病毒核酸的存在。同时，rcDNA的检测覆盖了cccDNA的检测，即检测rcDNA的寡核苷酸组合同样可以以cccDNA为检测目标。本实验室使用1.2×HBV质粒模拟cccDNA，结果显示检测rcDNA的寡核苷酸组合与检测cccDNA的寡核苷酸组合的检测结果呈现动态一致性(参见图3)。即，本发明中的rcDNA检测系统也可以检测cccDNA。 HBV隐匿性感染(occult HBV infection,OBI)表示具有HBV完整复制潜能的遗传物质的存在，因此可以发生HBV的再活动，肝组织中cccDNA的存在是OBI的基础。又因为rcDNA 只能来源于cccDNA，因此，血液及肝组织中HBV rcDNA水平可表示HBV真实病毒水平，特别是肝组织中rcDNA水平，可反映cccDNA水平和病毒发生再感染能力。至少基于上述内容完成了本发明。具体地，本发明的内容如下：
[用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物]
本发明的第一方面，提供用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸。可选地，进一步包括第三寡核苷酸。
第一寡核苷酸
本发明的第一寡核苷酸为能够特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列(本文有时也称作第一靶序列)的寡核苷酸。第一寡核苷酸一般为线性结构，其长度通常为10-50nt，优选15-40nt，更优选18-30nt。第一寡核苷酸可以仅包含一种寡核苷酸类型，也可包含多种不同种寡核苷酸类型。多种不同寡核苷酸类型之间可以仅存在1-5个，优选 1-4个，更优选1-2个碱基差异。优选地，各差异碱基的位置不连续。即，差异碱基分散于寡核苷酸的不相临的位置。例如，在某些实施方案中，第一寡核苷酸包含第一类型和第二类型的寡核苷酸，且第一类型和第二类型之间仅在同一位置具有一个碱基差异。优选地，碱基差异为简并碱基。例如，在不同寡核苷酸类型的同一位置的碱基为选自由R、 Y、M、K、S、W、H、B、V、D和N组成的组中的一种，其中R表示对应的位置的碱基为A/G，Y表示对应的位置的碱基为C/T，M表示对应的位置的碱基为A/C，K表示对应的位置的碱基为G/T，S表示对应的位置的碱基为G/C，W表示对应的位置的碱基为 A/T，H表示对应的位置的碱基为A/T/C，B表示对应的位置的碱基为G/T/C，V表示对应的位置的碱基为G/A/C，D表示对应的位置的碱基为G/A/T，N表示对应的位置的碱基为A/T/C/G。在某些实施方案中，本发明的第一寡核苷酸用作PCR反应的上游引物。
优选地，本发明的第一寡核苷酸优选为合成的寡核苷酸。在合成本发明的第一寡核苷酸时，优选将其设计成基本上与靶序列互补以使靶序列与其发生杂交，并且使3’端碱基配对并可以发生扩增延伸反应。“基本上与靶序列互补”是指在常规反应条件下第一寡核苷酸与靶序列互补以发生杂交，只要此类互补不足以完全地阻碍杂交，则也是允许的。优选地，使用本领域已知的手段(例如，Lasergene 7)来设计以使第一寡核苷酸与第一靶序列的退火温度60±5℃，且第一寡核苷酸的GC含量为在45-60％之间。
本发明的第一寡核苷酸优选能够特异性结合至第一序列的保守区。在某些实施方案中，本发明的第一寡核苷酸具有选自由SEQ ID NO:1-15所示的序列组成的组中的至少一种序列。优选地，第一寡核苷酸选自SEQ ID NO:5、6、13和14组成的组中的至少一种。
本发明所述的“第一序列”为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的DR2-DR1之间的序列。其中DR2-DR1之间的序列是指DR2区的5’端第一个核苷酸与DR1区的5’端第一个核苷酸之间的序列。即DR2-DR1之间的序列包含了DR2区的至少部分序列。根据 HBV病毒基因组结构和复制特征可知，第一序列对应于正确跳转后形成的HBV正链 DNA合成起始区。本领域技术人员已知，第一序列的具体位置根据不同病毒类型而不同。例如，在B基因型或C基因型HBV病毒中，第一序列的位置为HBV的基因组DNA中第1590-1828之间的序列，进一步优选第1655-1685之间的序列或第1775-1800之间的序列
本发明中，与第一寡核苷酸结合的第一序列的至少一部分连续序列的位置不特别限定。例如，在针对特定一种特定毒株时，第一序列的至少一部分连续序列可为第一序列中的任何连续区域。在针对一种特定类型的病毒时，第一序列的的至少一部分连续序列优选为在该病毒类型中各毒株中均保守的区域。在针对多种类型的病毒(例如，A-J类型的病毒)时，第一序列的的至少一部分连续序列优选为这些类型的病毒中的保守区。
第二寡核苷酸
本发明的第二寡核苷酸为能够特异性结合至第二序列的至少一部分连续序列(本文有时也称作“第二靶序列”)的寡核苷酸。第二寡核苷酸一般为线性结构，其长度通常为10-50nt，优选15-40nt，更优选15-30nt。第二寡核苷酸可以仅包含一种寡核苷酸类型，也可包含多种不同种寡核苷酸类型(简并碱基)。多种不同寡核苷酸类型之间可以仅存在1- 5个碱基差异。优选地，各差异碱基的位置不连续。即，差异碱基分散于寡核苷酸的不相临的位置。例如，在某些实施方案中，第一寡核苷酸包含第一类型和第二类型的寡核苷酸，且第一类型和第二类型之间仅在同一位置具有一个碱基差异。优选地，碱基差异为简并碱基。例如，在不同寡核苷酸类型的同一位置的碱基为选自由R、Y、M、K、S、W、 H、B、V、D和N组成的组中的一种，其中R表示对应的位置的碱基为A/G，Y表示对应的位置的碱基为C/T，M表示对应的位置的碱基为A/C，K表示对应的位置的碱基为 G/T，S表示对应的位置的碱基为G/C，W表示对应的位置的碱基为A/T，H表示对应的位置的碱基为A/T/C，B表示对应的位置的碱基为G/T/C，V表示对应的位置的碱基为 G/A/C，D表示对应的位置的碱基为G/A/T，N表示对应的位置的碱基为A/T/C/G。在某些实施方案中，本发明的第二寡核苷酸用作PCR反应的下游引物。
优选地，本发明的第二寡核苷酸优选为合成的寡核苷酸。在合成本发明的第二寡核苷酸时，优选将其设计成基本上与靶序列互补以使靶序列与其发生杂交，并且使3’端碱基配对并可以发生扩增延伸反应。“基本上与靶序列互补”是指在常规反应条件下第二寡核苷酸与靶序列互补以发生杂交，只要此类互补不足以完全地阻碍杂交，则也是允许的。优选地，使用本领域已知的手段(例如，Lasergene 7)来设计以使第二寡核苷酸与第二靶序列的退火温度60±5℃，且第二寡核苷酸的GC含量为在45-60％之间。
在某些实施方案中，本发明的第二寡核苷酸具有选自SEQ ID NO:16-20所示的序列组成的组中的至少一种的序列。
本发明所述的“第二序列”为DR1的第五个碱基之后的序列。第二序列优选为在HBV正链DNA沿着负链DNA 3’末端开始正链延伸后的区域。
本发明中，与第二寡核苷酸结合的第二序列的至少一部分连续序列的位置不特别限定，其根据不同的病毒类型或分类而不同。在某些实施方案中，第二序列的至少一部分连续序列位于HBV的基因组DNA第1827位之后。在针对特定一种特定毒株时，第二序列的至少一部分连续序列可为第二序列中的任何连续区域。在针对一种特定类型的病毒时，第二序列的至少一部分连续序列优选为在该病毒类型中各毒株中的保守区。在针对多种类型的病毒(例如，A-J类型的病毒)时，第二序列的至少一部分连续序列优选为这些类型的病毒中的保守区。在某些实施方案中，第二保守区包括B基因型或C基因型第 1828-1855之间，优选第1825-1855之间的序列。在某些实施方案中，第二保守区包括B 基因型或C基因型第1860-1890之间，优选第1860-1885之间的序列。
本发明中，第一序列的至少一部分连续序列与第二序列的至少一部分连续序列之间的距离为30-350nt，优选60-300nt，更优选80-250nt，还优选100-280nt。此处的“距离”是指第一序列的至少一部分连续序列的3’端最后一个核苷酸与第二序列的至少一部分连续序列5’端第一个核苷酸之间的距离。
第三寡核苷酸
本发明的第三寡核苷酸为可选的成分，其能够特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列与第二序列的至少一部分连续序列之间，且第三寡核苷酸包含荧光基团。
本发明的第三寡核苷酸的长度优选地使其适于与互补DNA杂交，以提供稳定的杂交体。通常，第三寡核苷酸的长度是10-50nt，优选15-30nt。需要说明的是虽然优选第三寡核苷酸能够与其杂交的DNA完全互补，但是在有些情况下，第三寡核苷酸也可与其杂交的DNA不完全互补。
本发明中，第三寡核苷酸中包含的荧光基团的数量不限定。例如，在第三寡核苷酸具有15-30个核苷酸的情况下，第三寡核苷酸可具有10个以下，优选8个以下，更优选 5个以下，还优选2个以下的荧光基团。例如，具有2、3、4或5个荧光基团。
本发明中，荧光基团优选标记于核苷酸残基上，且优选地，用荧光团标记的核苷酸残基中至少2个被至少2个非标记的核苷酸残基分隔。通常有2、3、4、5或6个未标记的核苷酸残基来分隔标记的核苷酸残基。特别优选地，2个未标记的残基分隔标记的残基。另外特别优选地，所有的标记核苷酸探针被至少2个未标记核苷酸残基分隔。优选地，分隔荧光基团从而避免荧光基团间的直接“接触”淬灭。接触淬灭产生于荧光基团间的物理接触，且通常使用物理分隔来避免接触淬灭，即荧光团标记的碱基间至少有2个核苷酸残基。
本发明的第三寡核苷酸中，各核苷酸残基经常衍生自天然的核苷A、C、G、T和U。然而，也可在本发明的第三寡核苷酸的一个或多个位置使用核苷酸类似物。此类核苷酸类似物例如在碱基部分和/或糖部分和/或磷酸键被修饰。碱基修饰(例如，丙炔基dU(dT 类似物)和2-氨基dA)一般改变了杂交特性并使得具有少于15个核苷酸残基的寡核苷酸的应用更有吸引力。对于含丙炔基dU的寡核苷酸，它们的长度大约为10个残基，并根据所需的与靶序列的解链温度而变化。
在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸中使用相同的荧光基团。可使用任何能结合核苷酸残基的荧光基团，只要其不阻止寡核苷酸与其靶序列杂交即可。
本发明的荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素；基于罗丹明的荧光团，例如ROX(6-羧基-X- 罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5，以上所有都可购自Glen Research，22825Davis Drive，Sterling，VA 20164，USA。
本发明还可使用其他荧光素，例如具有不同发射光谱的荧光素，如NED和JOE。可使用其他荧光基团，例如Alexa、Atto、Dyomics、Dyomics Megastokes和Thilyte染料家族中的荧光基团。
在本发明的某些实施方案中，分别使用C6FAM dU或荧光素dT在尿嘧啶/胸腺嘧啶碱基处标记寡核苷酸(在本文中，dT和dU的结构是相同的，因此这两个术语可交换使用)。可将FMOC保护的亚磷酰胺包含在寡核苷酸内部的T位置，并作为多种荧光染料结合的位点，这些荧光染料包括但不局限于FAM、TET、HEX、ROX、TAMRA、VIC、Cy3和 Cy5。寡核苷酸合成后，可从2’-保护的尿苷上去除FMOC基团，如适当保护的6-羧基荧光素亚磷酰胺的荧光团亚磷酰胺可偶联到游离的2’-羟基基团。在另一具体实施方式中，在A、C或G位置标记寡核苷酸，而标记的核苷酸或在固相寡核苷酸合成期间作为亚磷酰胺而被纳入，或在寡核苷酸合成后使用保护的亚磷酰胺(例如8-胺烷基-dA、7-胺烷基7-deaza-dA、N(4)-胺烷基dC和5-胺烷基-dC)与荧光基团结合。
在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸中包含相同的荧光团。在另外的某些实施方案中，在本发明的同一第三寡核苷酸中包含不同荧光基团。特别优选第三寡核苷酸包含2种荧光基团，其中一个是ROX而另一个是FAM。
在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸包括选自SEQ ID NO:21-24所示序列组成的组中的至少一种结构。
寡核苷酸组合物
本发明的寡核苷酸组合物，有时称作本发明的组合物，其存在形式不特别限定，可以干粉或溶液形式存在。另外，本发明的组合物可以是全部寡核苷酸组成的混合物形式，也可以是第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和可选的第三寡核苷酸分别为单独存在的形式。优选地，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以混合物的形式存在，第三寡核苷酸单独存在。第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的混合比不特别限定。优选地，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以1:1的摩尔比的混合物形式存在。
本发明的寡核苷酸组合物中，可以使用上述任意的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及可选的任意第三寡核苷酸。上述第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和可选的第三寡核苷酸的组合形式不特别限定。例如，第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:5和/或6所示，且第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:16和/或17所示，和可选地，第三寡核苷酸的序列如 SEQ IDNO:21-23任一种所示。又如，第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:13和/或14所示，第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:18-20中的至少一种所示，和可选地，第三寡核苷酸的序列如SEQID NO:24所示。
[试剂盒]
本发明的第二方面，提供试剂盒，其包含本发明第一方面所述的寡核苷酸组合物。关于寡核苷酸组合物的说明如上所述，在此不再赘述。
除了寡核苷酸组合物之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸组合物)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg2+等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。
本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
[检测样品中乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA水平的方法]
本发明的第三方面，提供检测样品中乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA水平的方法，本文有时简称本发明的方法。本发明的方法的检测模板仅限于负链合成后正链成功跳转合成的子代病毒颗粒中的HBV DNA，因此，本发明的方法更能准确地检测具有活性的乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的水平，使检测方法更准确可靠。
本发明的方法包括使用本发明所述的寡核苷酸组合物或本发明第二方面所述的试剂盒的步骤。本发明的方法只要使用上述寡核苷酸组合物或试剂盒，则不特别限定具体过程或步骤。在示例性方法中，本发明的方法包括PCR扩增步骤。其具体实例包括SYBRGreen实时荧光定量PCR方法、Taqman探针定量PCR方法、MGB实时荧光定量PCR方法和微滴数字PCR。
在示例性实施方案中，本发明的方法为定性检测方法。优选地，在这种情况下，本发明的方法包括将第一寡核苷酸作为正向引物，将第二寡核苷酸作为反向引物进行核酸扩增的步骤。进一步还优选包括检测、确认或鉴定核酸扩增产物的步骤。例如，通过在支承体(如琼脂糖)上的电泳鉴定核酸扩增产物的步骤。
在另外的示例性实施方案中，本发明的方法为定量检测方法。优选地，本发明的方法包括将第一寡核苷酸作为正向引物，将第二寡核苷酸作为反向引物，将第三寡核苷酸作为探针进行核酸扩增的步骤。此时，本发明的方法也称作实时荧光定量PCR方法。
本发明的方法中，样品的类型不特别限定。优选为肝组织样品和血液样品，例如，血清或血浆样品。在某些实施方案中，本发明的样品为核苷(酸)类似物治疗后的血液样品。
[用途]
本发明的第四方法，提供寡核苷酸组合物作为核酸扩增引物或探针的用途。优选地，本发明的用途包括寡核苷酸组合物在制备用于检测剂或诊断剂中的用途。
本发明的检测剂或诊断剂可以以试剂盒的形式提供。如上所述，已对试剂盒进行了较详细的说明，在此不再赘述。
本发明的检测剂或诊断剂可用于检测血液样本中rcDNA水平，用于判断或鉴定核苷 (酸)类似物的治疗效果，或者用于施用核苷(酸)类似物治疗后的预后评价。
本发明的检测剂或诊断剂可用于检测肝组织中HBV rcDNA和/或cccDNA水平。
本发明的检测剂或诊断剂可以排除肝组织中可能存在的HBV整合片段，从而排除了整合HBV DNA片段对检测具有完整复制潜能的HBV DNA的干扰。HBV rcDNA包含 HBV完整遗传信息，cccDNA是病毒复制和持续感染的原因，血清中或肝组织中检测到 HBV rcDNA和/或cccDNA表示有复制和再感染潜能的HBV病毒核酸的存在。HBV隐匿性感染(occult HBVinfection,OBI)表示具有HBV完整复制潜能的遗传物质的存在，因此可以发生HBV的再活动。所以肝组织中cccDNA的存在是OBI的基础。又因为rcDNA 只能来源于cccDNA，因此，肝组织中rcDNA水平可反映cccDNA水平和病毒发生再感染能力。因为rcDNA的检测可以检测cccDNA，即检测rcDNA的寡核苷酸组合同样可以以cccDNA为检测目标。因此，本发明的检测剂或诊断剂可以用于检测和判断OBI。
本发明的检测剂或诊断剂可用于抗病毒治疗情况下复发风险的评估，有完整病毒复制能力的rcDNA或cccDNA的消失会使停药后病毒学反弹和疾病复发风险明显减少，所以本发明的检测剂或诊断剂可以用于预测感染复发风险或停药复发风险。
实施例1
一、引物的设计
从GenBank中下载多种基因型(A-H)HBV参考序列，通过MegAlign软件分析不同基因型HBV的保守序列，设计了针对HBV rcDNA和/或cccDNA检测的多对引物和探针，参见表1。其中部分引物的结合区域的位置参见图4和图5。
表1.针对HBV rcDNA和/或cccDNA检测的引物和探针序列
序列名称 序列 ID
HRD-F1 TTCACCTCTGCACGTCGCATG SEQ ID NO:1
HRD-F2 GGAGACCACCGTGAACGCCCA SEQ ID NO:2
HRD-F3 CAGGAACCTGCCCAAGGTCTT SEQ ID NO:3
HRD-F4 GCATAAGAGGACTCTTGGACT SEQ ID NO:4
HRD-F5 GGACTCTTGGACTTTCAGCAAT SEQ ID NO:5
HRD-F6 AGGACTCTTGGACTTTCAGCAA SEQ ID NO:6
HRD-F7 TTCAGCAATGTCAACGACCGA SEQ ID NO:7
HRD-F8 CCTTGAGGCATACTTCAAAG SEQ ID NO:8
HRD-F9 CTTCAAAGACTGTGTGTTTA SEQ ID NO:9
HRD-F10 AGGACTGGGAGGAGTTGG SEQ ID NO:10
HRD-F11 GGGAGGAGATTAGGTTAA SEQ ID NO:11
HRD-F12 TGATCTTTGTACTAGGAGGCT SEQ ID NO:12
HRD-F13 GGAGGCTGTAGGCATAAATTGG SEQ ID NO:13
HRD-F14 GAGGCTGTAGGCATAAATTGGT SEQ ID NO:14
HRD-F15 CTGTTCACCAGCACCATGCAAC SEQ ID NO:15
HRD-R1 ACATGAGATGATTAGGCAGAGGT SEQ ID NO:16
HRD-R2 TGAACATGAGATGATTAGGCAGAG SEQ ID NO:17
HRD-R3 GCACAGCTTGGAGGCTTGA SEQ ID NO:18
HRD-R4 GCACAGCTTGGAGGCTTG SEQ ID NO:19
HRD-R5 CACAGCTTGGAGGCTTGAAC SEQ ID NO:20
HRD-Probe1 TCAACGACCGACCTTGAGGCGTACT SEQ ID NO:21
HRD-Probe2 TGTCAACGACCGACCTTGAGGCGTAC SEQ ID NO:22
HRD-Probe3 CAACGACCGACCTTGAGGCATACTTC SEQ ID NO:23
HRD-Probe4 CAGTAGGACATGAACATGAGATGATTAGGCAGAGGT SEQ ID NO:24
注：SEQ ID NO:21-24各序列的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1。
二、定性检测方法的建立
使用血清样本的病毒核酸提取试剂盒提取血液中总HBV DNA，然后利用普通PCR的方法检测设计的HBV rcDNA和/或cccDNA引物是否可以特异扩增rcDNA和/或 cccDNA。结果如图6所示。图6显示本发明的正向引物1-15的结合区域覆盖DR2-DR1 之间的整个区域，且引物1-15均能扩增得到相应的条带。即，可以在含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的直接重复序列的DR2-DR1之间的任何区域设计引物。
三、定量检测方法的建立
(1)引物特异性检测
引物特异性检测分为两组，1660-1850nt区域为第一组：HRD-F5+HRD-R1，HRD- F5+HRD-R2，HRD-F6+HRD-R1，HRD-F6+HRD-R2；1750-1890nt区域为第二组：HRD- F13+HRD-R3，HRD-F13+HRD-R4，HRD-F13+HRD-R5，HRD-F14+HRD-R3，HRD-F14+ HRD-R4，HRD-F14+HRD-R5。使用上述引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳显示条带大小与预期相符(图7A)。PCR产物经胶回收试剂盒回收，连入pEASY-Blunt载体，然后经测序确认扩增序列为以rcDNA和/或cccDNA为模板特异扩增的对应片段序列。同时利用SYBR Green方法评价了针对HBV DNA检测的不同引物组合的扩增特异性，通过计算扩增产物的溶解曲线发现，不同引物组合可以扩增获得均一的目的片段(图7B 和7C)。
(2)引物效率检测
定量PCR的方法检测HBV rcDNA和/或cccDNA的水平。利用SYBR Green方法评价了针对HBV DNA检测的不同引物组合的扩增效率，分为两组，第一组：HRD-F5+HRD- R1，HRD-F5+HRD-R2，HRD-F6+HRD-R1，HRD-F6+HRD-R2；第二组：HRD-F13+HRD- R3，HRD-F13+HRD-R4，HRD-F13+HRD-R5，HRD-F14+HRD-R3，HRD-F14+HRD-R4， HRD-F14+HRD-R5。结果显示，不同引物组合扩增曲线指数扩增期基本吻合，说明不同引物扩增效率无明显差异。参见图8。
(3)反应体系的组分
根据Taqman探针实时荧光定量PCR常规反应体系，检测了引物和探针组合。用于HBV rcDNA和/或cccDNA定量检测的40ul体系中探针浓度为10μM探针加0.8μl，引物浓度为10μM引物加2μl，扩增反应温度60℃。
反应体系和扩增条件如下：
在LightCycler 480Ⅱ或ABI Step One Plus荧光定量PCR仪中的扩增循环参数为： 95℃，5min，预变性；然后95℃，10s，60℃，30s，72℃，1s，45个循环；在每个循环的延伸阶段(60℃)同步持续采集荧光信号。
(4)HBV rcDNA和/或cccDNA质粒标准品和标准曲线的建立
使用本室1.2×HBV复制型质粒pBB4.5-1.2×HBV经测序确认后作为质粒标准品，作为实验室内部检测生物样本HBV rcDNA的标准品使用。将标准品进行10倍倍比稀释，浓度分别为2.00E+08、2.00E+07、2.00E+06、2.00E+05、2.00E+04/ml、2.00E+03/ml。用上述确定的检测体系和循环参数分别对倍比稀释的HBV rcDNA和/或cccDNA标准品进行定量检测。结果显示，在检测HBV rcDNA和/或cccDNA标准品时，线性范围可低至 2.00E+03copies/mL；标准曲线的线性回归方程为：y＝-3.3071x+51.177，相关系数的平方R2＝0.9955。结果参见图9。
(3)灵敏度的检测
为确定HBV rcDNA和/或cccDNA检测体系的灵敏度，对体系中引物和探针对对不同病毒基因型的灵敏度进行检测。设计中，HBV rcDNA和/或cccDNA检测的引物和探针在HBVB、C基因型均保守，使用本研究中的引物和探针，以B、C两种基因型HBV 质粒为扩增目标对HBV rcDNA和/或cccDNA检测体系进行了测验。结果显示，在B、 C两种基因型HBV质粒中本HBV rcDNA和/或cccDNA检测体系均可以有效的扩增，同时引物在一定质粒浓度范围内线性扩增，均有良好的扩增效率，参见图10。标准曲线的线性范围可低至2.00E+03copies/ml。在检测HBV B基因型时，标准曲线的线性回归方程为：y＝-3.278x+47.247，相关系数的平方R2＝0.9984(图10B)；在检测HBV C基因型时，标准曲线的线性回归方程为：y＝-3.1384x+46.108，相关系数的平方R2＝0.9959(图 10D)。
(4)重复性的检测
取经核苷(酸)类药物治疗后的慢乙肝患者血清，使用血清样本的病毒核酸提取试剂盒提取血清中总DNA进行检测，重复20次。结果显示，20次重复检测的曲线基本重合，重复性良好。结果参见图11。
实施例2
本实施例为一种检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA水平的示例性方法。
使用本发明的寡核苷酸组合物作为引物检测乙型肝炎病毒的水平。本发明的寡核苷酸组合物特异性结合至正确跳转后形成的HBV正链DNA合成起始处，从而使检测模板仅限于负链合成后正链成功跳转合成的子代病毒颗粒中的HBV DNA，即rcDNA。rcDNA 的检测更能准确反映有复制能力的HBV病毒。与现有临床中使用的HBV DNA检测 PreC/C、S、X区HBVDNA定量引物相比，本发明的引物使得本发明的方法更加准确反映HBV病毒在机体内的活力情况。下面说明本发明的方法与现有临床使用的HBV DNA 检测方法的比较。
HBV病毒基因组为rcDNA，携带形成子代病毒的遗传信息。dslDNA为HBV DNA 复制过程中未完成正确跳转形成的基因组形式，携带病毒的部分遗传信息。本发明的检测方法中第一序列为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的DR2-DR1之间的序列，第二序列为DR1的第五个碱基之后的序列，可以特异性检测rcDNA(图12A)。对于dslDNA，由于第一序列扩增方向和第二序列扩增方向相反，不能进行有效扩增和检测(图12D)。 NAs主要通过抑制病毒逆转录过程，终止HBV负链DNA延伸，形成只含部分负链DNA 片段的不完整病毒(图12B)。现有常规HBV DNA检测体系仍能检测部分负链DNA片段，不能排除此部分不完整病毒，而本发明的检测体系可以排除此部分不完整病毒，检测结果更能反应真实病毒载量水平。cccDNA由rcDNA在肝细胞核中经加工转化形成，以微小染色体形式存在，同样携带病毒的全部遗传信息且是HBV持续感染难以清除的原因，本发明的检测体系可以检测cccDNA(图12C)。隐匿性HBV感染表示具有HBV完整复制潜能的遗传物质，包括rcDNA和/或cccDNA的存在，因此可以发生HBV的再活动。由于HBV DNA可以整合到宿主基因组中且dslDNA是HBV整合的主要形式，因此本发明的检测体系可以更好的排除整合HBV DNA对OBI鉴定的干扰(图12D)。
本发明中，核苷(酸)类药物治疗临床样本使用基线HBV高病毒载量后经LdT治疗的母婴阻断样本，分为LdT治疗4/8周、LdT治疗12周(即产前停药点)和产后停药4周 HBV DNA监测三个时间点。使用本发明的引物(即，HBV rcDNA的定量检测引物)和 PreC/C、S区定量引物对不同时间点血清样本进行HBV DNA定量，结果显示，在未进行任何抗病毒治疗的基线情况下，采用针对HBV DNA不同区域的引物的定量结果并无明显差异，但在接受药物治疗后，S、PreC/C区定量结果明显高于rcDNA特异的定量结果，结果参见图13A。说明核苷类似物LdT治疗后HBV DNA存在负链合成因核苷(酸)类药物的作用而过早终止、形成不完整的片段化形式的HBV DNA，同时核苷类似物治疗后 rcDNA特异引物的定量检测结果比S和PreC/C区域的定量引物所反映的病毒载量的数值明显降低。
与核苷(酸)类药物治疗CHB病人抑制病毒逆转录和DNA合成发挥抗病毒作用不同，使用干扰素治疗主要通过调节机体免疫发挥综合抗病毒能力。因此，干扰素治疗后不同区域HBV DNA量应无明显差别。我们在研究中对接受聚乙二醇干扰素(PegIFN)治疗的慢性乙肝患者的临床样本，分别在干扰素治疗前(基线)、治疗48周和停药后24周三个时间点血清样本，使用HBV rcDNA的特异定量检测引物和PreC/C、S区定量引物进行HBV DNA定量检测。结果正如我们的预期，S、PreC/C和rcDNA的不同引物对HBV DNA的定量结果基本一致，参见图13B。
以上NAs和PegIFN两种不同类型治疗药物的临床样本的研究结果证实，通过对病毒X，S，PreC/C区的定量来标示接受核苷(酸)类药物治疗的慢性乙肝病人体内的乙肝病毒载量并不合理，使用rcDNA和/或cccDNA引物来检测核苷(酸)类药物治疗后病人体内的完整有复制潜力的HBV病毒载量则更加准确。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物、试剂盒和方法及用途
<130> 1810001
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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cagtaggaca tgaacatgag atgattaggc agaggt 36

Claims (10)

1.一种用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，或者与所述第一寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸和与所述第二寡核苷酸的序列互补的寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸能够特异性结合至第一序列的至少一部分连续序列，所述第二寡核苷酸能够特异性结合至第二序列的至少一部分连续序列，且两个连续序列之间的距离为30-350nt，所述第一序列为含有cccDNA或rcDNA的跨缺口区的直接重复序列的DR2-DR1之间的序列，所述第二序列为DR1的第五个碱基之后的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的长度分别为10-50nt。
3.根据权利要求1所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其中所述第一序列包括HBV各基因型第1590-1828之间的序列。
4.根据权利要求1所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其中所述第一寡核苷酸特异性结合至第一序列的保守区，所述第二寡核苷酸特异性结合至第二序列的保守区。
5.根据权利要求4所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其中所述第一序列的保守区包括B基因型或C基因型第1655-1685之间的序列或第1775-1800之间的序列，所述第二序列的保守区包括B基因型或C基因型第1825-1855之间的序列或第1860-1890之间的序列。
6.根据权利要求1所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其中所述第一寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO:1-15所示的序列组成的组中的至少一种；所述第二寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO:16-20所示的序列组成的组中的至少一种；
优选地，所述第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:5和/或6所示，且所述第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:16和/或17所示；或者所述第一寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:13和/或14所示，且所述第二寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:18-20中的至少一种所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用于检测乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA的寡核苷酸组合物，其进一步包括第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能够特异性结合至所述第一序列的至少一部分连续序列与所述第二序列的至少一部分连续序列之间，且所述第三寡核苷酸包含荧光基团；
优选地，所述第三寡核苷酸具有如SEQ ID NO:21-24任一项所示的结构。
8.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸组合物。
9.一种检测样品中乙型肝炎病毒rcDNA和/或cccDNA水平的方法，其包括使用根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸组合物或根据权利要求8所述的试剂盒的步骤；优选地，所述样品为肝组织和/或血液；所述检测方法包括SYBR Green实时荧光定量PCR方法、Taqman探针定量PCR方法、MGB实时荧光定量PCR方法和微滴数字PCR。
10.根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸组合物作为核酸扩增引物或探针的用途；优选根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸组合物在制备用于检测剂或诊断剂中的用途。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852727A (zh) * 2019-03-05 2019-06-07 厦门市安美捷生物工程有限公司 基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒
CN111808985A (zh) * 2019-04-11 2020-10-23 北京大学 超敏检测NAs治疗下乙型肝炎病毒DNA的寡核苷酸组合物、试剂盒、方法及用途
CN112725538A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN112725535A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 无锡中德美联生物技术有限公司 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN115267193A (zh) * 2022-09-20 2022-11-01 北京大学 用于判断生物样本中HBsAg来源的方法及系统和用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898100A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 深圳先进技术研究院 cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒
CN105256076A (zh) * 2015-11-20 2016-01-20 河北国际旅行卫生保健中心 乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒
CN106636466A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 南方医科大学南方医院 一种乙型肝炎病毒共价闭合环状dna精确定量的方法
WO2017142965A1 (en) * 2016-02-15 2017-08-24 JBS Science Inc. Quantitative measurement of hepatitis b virus cccdna

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103898100A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 深圳先进技术研究院 cccDNA标准品及其制备方法、定量检测乙肝病毒cccDNA的方法及试剂盒
CN105256076A (zh) * 2015-11-20 2016-01-20 河北国际旅行卫生保健中心 乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒
WO2017142965A1 (en) * 2016-02-15 2017-08-24 JBS Science Inc. Quantitative measurement of hepatitis b virus cccdna
CN106636466A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 南方医科大学南方医院 一种乙型肝炎病毒共价闭合环状dna精确定量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
肖春花等: "血清中HBVcccDNA定量检测方法的建立及临床应用", 《广东医学》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109852727A (zh) * 2019-03-05 2019-06-07 厦门市安美捷生物工程有限公司 基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒
CN109852727B (zh) * 2019-03-05 2022-10-11 苏州恩可医药科技有限公司 基于通用碱基替换插入的HBV-cccDNA检测方法与试剂盒
CN111808985A (zh) * 2019-04-11 2020-10-23 北京大学 超敏检测NAs治疗下乙型肝炎病毒DNA的寡核苷酸组合物、试剂盒、方法及用途
CN112725535A (zh) * 2021-02-03 2021-04-30 无锡中德美联生物技术有限公司 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN112725535B (zh) * 2021-02-03 2024-05-31 江苏安科华捷生物科技有限公司 同时检测全长与截短的HBV pgRNA荧光定量PCR试剂盒及其应用
CN112725538A (zh) * 2021-02-22 2021-04-30 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN112725538B (zh) * 2021-02-22 2021-12-14 南方医科大学南方医院 基于hbv s区的高敏hbv rna定量检测的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN115267193A (zh) * 2022-09-20 2022-11-01 北京大学 用于判断生物样本中HBsAg来源的方法及系统和用途
CN115267193B (zh) * 2022-09-20 2022-12-27 北京大学 用于判断生物样本中HBsAg来源的方法及系统和用途

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