CN109321663B - 进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合及应用 - Google Patents

进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合以及应用方法，属于遗传育种中的分子辅助育种领域。其步骤包括(1)从基因组筛选微卫星位点，设计引物，通过扩增选择8个等位基因数目较多，多态性较高的微卫星；(2)通过微卫星分型获得微卫星数据信息，进而实现对候选母本和子代的鉴定。本发明利用脊尾白虾高度多态的8个微卫星位点进行家系鉴定，效率高，结果准确可靠，弥补了当前脊尾白虾育种中系谱记录困难的问题，可以有效提高良种选育效果。

Description

进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合及应用
技术领域
本发明属于遗传育种的分子辅助育种技术，具体的说是用于脊尾白虾快速、高效进行家系鉴定的微卫星标记组合和应用。
背景技术
脊尾白虾又名小白虾，绒虾，迎春虾，属节肢动物门、甲壳纲、十足目、长臂虾科，广布于整个中国大陆沿岸和朝鲜半岛西岸的浅海水域，以黄渤海产量最高。它具有繁殖能力强、生长速度快和环境适应性广等优点，是我国重要的小型经济虾。此外，脊尾白虾肉质细嫩，味道鲜美，可鲜食也可加工成虾米，因虾米呈金黄色，故也有“金钩虾米”之称。近年来，随着沿海滩涂的开发，养殖面积迅速扩大，目前脊尾白虾已成为虾蟹混养和虾贝混养的重要品种。
由于脊尾白虾的养殖种苗主要来源于海区纳苗或者池塘养殖后留种用于下年度养殖，没有经过人工选育，尚无良种可言。而且近年来由于环境污染和过度捕捞，野生脊尾白虾资源受到一定的影响。随着养殖规模的不断扩大，缺乏稳定的苗种供应，良种匮乏等问题，严重制约了产业的可持续发展。面对种质资源限制养殖业发展的情况，脊尾白虾良种选育工作引起了广泛重视。
家系选育是获得优良品种的重要手段。在这个过程中，了解完整、准确的系谱信息可以有效指导亲本选育，增强遗传多样性，从而避免近交衰退现象。传统的虾类选择育种，是将不同的家系养在不同的养殖池中以维持家系信息。由于不同养殖池间的环境因子存在差异，这可能会导致育种相关的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定。在混合养殖群体中，是通过物理标记荧光染料等保持家系信息，但存在操作繁琐、易损伤虾体、标记在体内移动及不易于在仔虾上进行标记等缺点。
随着科学技术的发展，分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。微卫星又称简单重复序列，由于其具有分布广、多态性高、稳定性强、共显性等遗传特点，在为水产动物选育中保持家系信息、确认亲缘关系、追踪系谱提供了有用的工具。目前已在草鱼、牡蛎、文蛤和凡纳滨对虾等水产动物中证实了微卫星在家系鉴定中的可行性和应用价值。然而，将微卫星标记应用于脊尾白虾家系鉴定的报道较少。因此，发挥微卫星标记在脊尾白虾家系鉴定中的优势，对于保护及合理开发利用脊尾白虾资源具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供快速高效进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合，该标记等位基因数目多，多态性高，可以用来实现脊尾白虾家系的快速鉴定，也可以应用于种质管理、家系管理和评价增殖放流效果等领域。
为实现以上目的，本发明采用的方案为：
快速高效进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合及应用，具体包括筛选多态性高的微卫星位点，设计引物，合成带有荧光标记的引物，建立微卫星扩增体系，保证扩增体系的稳定性和目的条带准确性,通过Cervus软件读取微卫星分型数据进行家系鉴定。
1.微卫星位点的筛选，具体包括：使用MIcroSAtellite identification tool(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对脊尾白虾基因组进行微卫星筛选，单核苷酸到六核苷酸微卫星重复次数分别设为不小于10、6、5、5、5、5次，混合型微卫星中间碱基数最多为100bp。根据微卫星两端的侧翼序列，使用primer 3(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html)批量设计引物，同时考虑最佳退火温度和产物片段长度。通过PCR扩增，筛选出扩增稳定和多态性高的8个微卫星标记：Ec276、Ec651、Ec844、Ec1955、Ec2335、Ec2556、Ec4023和Ec4040。
2.所述的8个微卫星标记的引物如下：
Ec276F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GATTGATTCTGGGAAAGGCA-3’
Ec276R:5’-AATGAAGTACCTGGCGGTTG-3’
Ec651F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-ATGAAAGAGGCCTAGGGGAA-3’
Ec651R:5’-TCTCGGGTGAGTCTATGTGG-3’
Ec844F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-TTTTCCCTTTTGGAGTCCCT-3’
Ec844R:5’-AGGGAAAGTGGTCTCGGTCT-3’
Ec1955F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-CTCATCCCCTTAGATCCGGT-3’
Ec1955R:5’-GTCAGCAGAGCGTCTTCAAA-3’
Ec2335F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GCATCCCACTTTTCCAACAT-3’
Ec2335R:5’-TTTGGCTTTTATTCCTTTCGTT-3’
Ec2556F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GTTCCTTCAATGGCGTGAGT-3’
Ec2556R:5’-GTCGGTGGCATTTCCATAAG-3’
Ec4023F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GCACCCTGCGGTTCTAAATA-3’
Ec4023R:5’-TCAAGTGGGTTCTATCGGCT-3’
Ec4040F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GAGACCTCTTACCCAAGCCA-3’
Ec4040R:5’-GCAATTCAGTTATGAAGTTGTTGC-3’
3.所述的微卫星扩增体系如下：
10uL的扩增体系包括：5uL Ex-Taq(Takara)，0.2uL 10uM正向引物，0.2uL 10uM反向引物，3.6uL灭菌超纯水,1uL 50ng/uL模板DNA。
4.所述的微卫星扩增程序如下：
PCR扩增程序设置：94℃变性5分钟；如下进行35个循环：94℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟；4℃保温。Ec276、Ec2335、Ec4040的退火温度为53℃，Ec2556、Ec4023、Ec651、Ec844、Ec1955的退火温度为55℃。
5.微卫星标记组合的使用方法如下：
分别对待鉴定的子代和候选亲本进行PCR扩增和微卫星分型，将分型获得的每个个体微卫星的片段长度大小导入Cervus软件进行家系鉴定分析，Cervus判定的母本结果即为子代对应的母本。
本发明所具有的优点：
本发明通过筛选多态性高的8个微卫星位点，根据扩增片段的长度，对候选母本和子代进行微卫星分型，利用8个位点的分型数据进行家系鉴定，效率高，周期短，结果准确可靠，并且对亲缘关系较近的家系也有很好的鉴定效果。
具体实施方式
本发明首先建立混养家系，选择多态性高的微卫星位点，确定扩增体系、扩增程序的可行性和稳定性，对脊尾白虾个体进行微卫星扩增，再使用ABI 3730xl测序仪对微卫星位点进行分型，最后应用Cervus软件进行家系鉴定。
1.首先对脊尾白虾进行人工繁育，得到6个家系F1、F2、F3、F4、H1、H2，其中H1和H2是母系半同胞，每个家系随机选取30个子代，组成一个混合的群体，5个母本和另外15尾脊尾白虾组成20个候选亲本。取所有子代和候选母本的肌肉组织，提取基因组DNA。
2.微卫星位点的筛选，具体包括：使用MIcroSAtellite identification tool(MISA)(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)对脊尾白虾基因组进行微卫星筛选，单核苷酸到六核苷酸微卫星重复次数分别设为不小于10、6、5、5、5、5次，混合型微卫星中间碱基数最多为100bp。
3.根据微卫星两端的侧翼序列，使用primer 3
(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/primer3.html)批量设计引物，同时考虑最佳退火温度和产物片段长度。
4.10uL的扩增体系包括：5uL Ex-Taq(Takara)，0.2uL 10uM正向引物，0.2uL 10uM反向引物，3.6uL灭菌超纯水,1uL 50ng/uL模板DNA。
5.PCR扩增程序设置：94℃变性5分钟；如下进行35个循环：94℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟；4度保温。Ec276、Ec2335、Ec4040的退火温度为53℃，Ec2556、Ec4023、Ec651、Ec844、Ec1955的退火温度为55℃。
6.使用上述获得的微卫星扩增体系和程序对候选母本和子代进行PCR扩增，扩增产物经ABI 3730xl测序仪(Applied Biosystems)进行微卫星分型，使用GeneMarker(SoftGenetics,LLC)软件读取每个位点的分型数据，获得每个微卫星位点的片段。
7.数据转换成Cervus格式，Cervus根据候选母本的微卫星分型信息和子代的分型信息进行家系鉴定分析，根据多个微卫星位点的组合信息按照95％置信区间确定对应的母本。
实施例1：
利用上述快速高效进行脊尾白虾家系鉴定的方法对6个不同家系(F1、F2、F3、F4、H1、H2)的180个子代和20个候选亲本进行亲权分析，这6个家系包含了亲缘关系较近的半同胞家系和亲缘关系较远的家系，H1和H2是母系半同胞家系，从20个候选亲本找到真正的母本，通过这种实验设置，可以验证该方法对于亲缘关系近的家系及其在存在亲本干扰情况的鉴定准确率。
具体步骤如下：
1.候选亲本和子代DNA的提取：
使用天根海洋植物基因组提取试剂盒(天根)提取候选母本和子
代的基因组DNA，稀释到50ng/μL备用。
2.PCR扩增和基因分型：
以候选母本和子代DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序设置：94℃变性5分钟；如下进行35个循环：94℃变性30秒，退火温度退火30秒，72℃延伸30秒；72℃延伸10分钟；4度保温。Ec276、Ec2335、Ec4040的退火温度为53℃，Ec2556、Ec4023、Ec651、Ec844、Ec1955的退火温度为55℃。
10uL的扩增体系包括：5uL Ex-Taq(Takara)，0.2uL 10uM正
向引物，0.2uL 10uM反向引物，3.6uL灭菌超纯水,1uL 50ng/uL模板DNA。
微卫星引物序列和荧光标记如下：
Ec276F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GATTGATTCTGGGAAAGGCA-3’
Ec276R:5’-AATGAAGTACCTGGCGGTTG-3’
Ec651F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-ATGAAAGAGGCCTAGGGGAA-3’
Ec651R:5’-TCTCGGGTGAGTCTATGTGG-3’
Ec844F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-TTTTCCCTTTTGGAGTCCCT-3’
Ec844R:5’-AGGGAAAGTGGTCTCGGTCT-3’
Ec1955F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-CTCATCCCCTTAGATCCGGT-3’
Ec1955R:5’-GTCAGCAGAGCGTCTTCAAA-3’
Ec2335F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GCATCCCACTTTTCCAACAT-3’
Ec2335R:5’-TTTGGCTTTTATTCCTTTCGTT-3’
Ec2556F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GTTCCTTCAATGGCGTGAGT-3’
Ec2556R:5’-GTCGGTGGCATTTCCATAAG-3’
Ec4023F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GCACCCTGCGGTTCTAAATA-3’
Ec4023R:5’-TCAAGTGGGTTCTATCGGCT-3’
Ec4040F:6-FAM(羧基荧光素)-5’-GAGACCTCTTACCCAAGCCA-3’
Ec4040R:5’-GCAATTCAGTTATGAAGTTGTTGC-3’
扩增产物避光保存。
取1uL以每个个体为模板的上述扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带亮度将扩增后产物稀释至约0.3ng/uL；按1000:10的比例，在变性剂Hi-Di甲酰胺(AppliedBiosystems)中加入标准品Liz 500Marker(Applied Biosystems)，分装后每10uL上述混合液中加入0.5uL稀释后的扩增后产物；将上述混合样品放入ABI 3730xl测序仪中对每个个体的扩增结果进行扫描，由于每个扩增体系中的不同微卫星位点的片段大小不同，分型结果使用Gene Marker(v1.91)软件读取每个微卫星位点扩增的片段大小，结果如表1和表2所示。
3.亲子鉴定:
将8个微卫星位点的分型数据转换成Cervus 3.0格式，使用Cervus软件统计各位点的等位基因数目、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量PIC、缺失值等参数。接着进行模拟分析和亲子鉴定分析。Cervus对候选的母本和所有子代个体的分型数据进行分析，通过似然率检验待测个体与亲本基因型之间的关联性，并在95％置信水平下，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系，从而实现亲子鉴定。
综上所述，本方法建立了利用微卫星鉴定体系，具体包括微卫星筛选、引物设计、PCR扩增、数据读取和亲子鉴定几个方面。利用这8个微卫星体系对6个家系进行亲子鉴定的结果表明，180个子代鉴定的准确率为97％。因此本专利提供的用于进行脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记组合可以实现脊尾白虾家系快速高效地鉴定，为家系选育过程中的系谱跟踪和家系混养提高有效方法。
本发明利用脊尾白虾高度多态的8个微卫星位点进行家系鉴定，效率高，结果准确可靠，弥补了当前脊尾白虾育种中系谱记录困难的问题，可以有效提高良种选育效果。
表格1:用于家系鉴定分析的所有候选母本的分型信息。H-F、F1-F、F2-F、F3-F、F4-F代表H1和H2、F1、F2、F3、F4家系的母本，F1-F15是其他15个候选母本，Ec276、Ec651、Ec844、Ec1955、Ec2335、Ec2556、Ec4023、Ec4040代表8个微卫星位点，对应的数据代表微卫星扩增片段大小。
Figure BDA0001849564990000061
表格2：子代分型信息，F1，F2，F3，F4，H1，H2对应相应家系的30个子代，Ec276、Ec651、Ec844、Ec1955、Ec2335、Ec2556、Ec4023、Ec4040代表8个微卫星位点，对应的数据代表微卫星扩增片段大小。
Figure BDA0001849564990000062
Figure BDA0001849564990000071
Figure BDA0001849564990000081
Figure BDA0001849564990000091
Figure BDA0001849564990000101

Claims (3)

1.一种用于脊尾白虾家系鉴定的微卫星标记引物，其特征在于：
所述微卫星标记引物共有8对 引物对 ，所述引物对 的序列和荧光标记如下：
Ec276F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’-GATTGATTCTGGGAAAGGCA-3’
Ec276R: 5’-AATGAAGTACCTGGCGGTTG-3’
Ec651F: 6-FAM（羧基荧光素）-5’- ATGAAAGAGGCCTAGGGGAA-3’
Ec651R: 5’- TCTCGGGTGAGTCTATGTGG-3’
Ec844F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’- TTTTCCCTTTTGGAGTCCCT-3’
Ec844R: 5’- AGGGAAAGTGGTCTCGGTCT-3’
Ec1955F: 6-FAM（羧基荧光素）-5’- CTCATCCCCTTAGATCCGGT-3’
Ec1955R: 5’- GTCAGCAGAGCGTCTTCAAA-3’
Ec2335F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’- GCATCCCACTTTTCCAACAT-3’
Ec2335R: 5’- TTTGGCTTTTATTCCTTTCGTT-3’
Ec2556F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’- GTTCCTTCAATGGCGTGAGT-3’
Ec2556R: 5’- GTCGGTGGCATTTCCATAAG-3’
Ec4023F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’- GCACCCTGCGGTTCTAAATA-3’
Ec4023R: 5’- TCAAGTGGGTTCTATCGGCT-3’
Ec4040F : 6-FAM（羧基荧光素）-5’- GAGACCTCTTACCCAAGCCA-3’
Ec4040R: 5’- GCAATTCAGTTATGAAGTTGTTGC-3’。
2.一种权利要求1所述微卫星标记引物在脊尾白虾家系鉴定中的应用。
3.按照权利要求2所述微卫星标记引物在脊尾白虾家系鉴定中的应用，其特征在于：使用所述的8对 引物对 对脊尾白虾父母本个体和子代个体的DNA进行微卫星扩增和分型，利用家系鉴定的软件Cervus对父母本和子代进行分析，进而实现对候选母本和子代的鉴定。
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Isolation and characterization of polymorphic microsatellite loci in the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda;S W Jia等;《Genet Mol Res》;20130808;第12卷(第3期);第2816-2820页 *
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